一種快速止血抗菌羧化澱粉‑聚賴氨酸微球及其製備方法與流程
2023-06-06 15:40:44
一種快速止血抗菌羧化澱粉-聚賴氨酸微球及其製備方法，該方法涉及醫療器械領域。
背景技術：
：人體受傷或經手術後由於動脈破裂、臟器破裂等原因大量出血，若不及時進行阻止會導致失血過多而危及生命。這無疑成為了日常意外事故或戰傷死亡的主要原因，其中特別是血管豐富密集的四肢與軀幹交界處出血或在腦、腎臟、肝臟和病變腫瘤等處手術時出血，同時出血部位容易感染金葡菌、綠膿桿菌和組溶血性鏈球菌等革蘭氏陽性菌與陰性菌，而且不宜壓迫包紮、縫合等機械性止血，以致快速安全地止血較為困難。目前，急需一種在外科手術、外傷急救、家庭自救等出血時進行高效止血的具有良好生物相容性、使用方便且價格已被廣泛接受的可吸收降解性安全止血材料。因此，研發止血效果好、無毒副作用且易於生產加工的止血材料已成為目前研究的熱點，這對傷情緩解、手術成功率等起到了尤為重要的作用。目前，應用於外科及外傷出血的止血材料主要包括：殼聚糖類止血材料、澱粉型多聚糖止血材料、氧化纖維素和氧化再生纖維素、纖維蛋白膠等。其中近年來被廣為推崇的是由美國Medafor公司生產的。AristaTM是一種以馬鈴薯澱粉為原料製備的止血微球，其有效成分是多微孔多聚糖，具有較強的吸水性，能夠較快地吸收血液中的水分，同時因為其局部凝血因子濃度的增大，加快了內源性凝血，達到了牢固、可靠止血的效果。但這種止血材料除了吸水性不夠強、吸水倍數低、無抑菌性能外，其採用的交聯劑是表氯醇，存在潛在毒性而且價格昂貴，不適合大量規模化生產，極大地限制了它的廣泛應用。其次是臨床上使用較廣的美國強生公司生產的可溶性止血紗布Surgicel，屬於羧甲基纖維素類止血材料。據報導雖然止血效果增加且其產生的高酸環境有一定的抗菌能力，但這種高酸性的化學環境會經瀰漫性的化學機制導致神經損傷，應避免直接用於外圍神經。另外StarchMedicalInc公司研製出的產品PerClotTM也是一種在體內可降解吸收、相容性好，同時能迅速形成凝血塊並在局部發揮機械屏障作用的止血材料，但其抗菌能力較弱，安全性較低。基於當今市場上各種止血材料以及澱粉微球具有高度三維網狀結構、比表面積大可達到增強吸水效果等特點，製備止血微球作為理想的止血材料具有很大優勢。目前製備澱粉類微球的方法有物理法、化學法、反相懸浮聚合法等。球磨技術是製備澱粉類微球的一種物理方法，主要以水或乙醇為介質，澱粉顆粒在機械力的作用下發生破碎。該法製備的澱粉微球粒徑較大，不均勻，動力消耗大，成本高，少部分澱粉顆粒外表面破裂、粗糙，水解、酶解速度也大大加快。其中個別顆粒表面雖沒有任何變化，但內部已經破裂。而反相懸浮聚合法是近年來發展起來的製備澱粉微球的一種新型乳液聚合技術，即將澱粉溶液分散於一定體積的油相中製成油包水型反相乳液後，加入適量交聯劑，直接使澱粉高分子交聯成微球。製備澱粉微球所採用的反相懸浮聚合法不僅工藝簡單易行，而且所得的澱粉微球具有較堅固的網絡結構，在被澱粉酶降解前其形狀能保持相當長的時間。此外，反相懸浮聚合法還能使水溶性單體有效地聚合成粉狀或乳狀產物，其反應條件溫和，副反應少，便於使用。本發明是利用反相懸浮聚合法，將備受目前國內外關注的具有止血性能、可生物降解的羧化澱粉與抑菌活性較強的聚賴氨酸製備成止血抗菌微球，能夠達到止血快速安全、抑菌活性高、毒副作用最少、刺激性最弱且生產成本低、易於工業生產的止血抗菌材料，在生活中的各方面及生物醫藥研究領域的應用前景廣闊。技術實現要素：本發明克服了現有技術的不足之處，提供了一種快速止血抗菌羧化澱粉-聚賴氨酸微球及其製備方法，這種微球是既有止血性能，又有極強的抑菌能力的生物可吸收降解性材料，主要成分為羧化澱粉和ε-聚賴氨酸。羧化澱粉是一種能起到凝血作用的生物改性多聚糖，同時具有良好的組織相容性；ε-聚賴氨酸是一種具有抑菌功效的多肽，是賴氨酸的直鏈狀聚合物，具有抑菌譜廣、熱穩定性好、水溶性好、安全性高等特性。將羧化澱粉與ε-聚賴氨酸經乳化交聯製備成止血抗菌微球，達到了止血與抑菌的雙重效果。一種快速止血抗菌羧化澱粉-聚賴氨酸微球及其製備方法，其主要特徵在於所述方法包括如下步驟：(1)製備水相溶液：每次吸取20～100μLε-聚賴氨酸的水溶液(1.0～4.5％)在300～1500r/min高速攪拌下滴定到裝有10～50mL的羧化澱粉溶液(0.3～0.6g/mL)中，製備得到羧化澱粉-聚賴氨酸水相溶液。(2)乳化交聯：將乳化劑加入到分散劑中分散，40～60℃下攪拌0.5～2h，再將步驟(1)中溶液加入到分散劑中，乳化0.5～2.5h，溫度為30～50℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然後將交聯劑逐滴加入到溶液中，滴加完後攪拌2～6h。(3)精製微球：將步驟(2)中溶液置於透析袋中透析，抽濾，用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水依次洗滌3-6次後，乾燥、篩分、輻射滅菌，製得止血抗菌微球。本發明主要是將羧化澱粉與ε-聚賴氨酸交聯成一種既具有高吸液能力、高止血能力，又能夠有效防止各種細菌對傷口感染的快速止血抗菌材料，在羧化澱粉的止血性能基礎上大大提高了其抑菌能力，而且製備微球的原料來源廣泛，成本低廉，工藝簡便，易於規模化生產。附圖說明圖1為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水速率比較圖圖2為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水倍率比較圖圖3為止血抗菌微球1#與AristaTM抑菌率比較圖具體體實施方式現結合實施例，對本發明作詳細闡述，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述說明限定本發明的保護範圍。實施例1(1)羧化澱粉-聚賴氨酸水相溶液的製備每次吸取20μLε-聚賴氨酸的水溶液(1.0％)在300r/min高速攪拌下滴定到裝有10mL的羧化澱粉溶液(0.3g/mL)中，製備得到羧化澱粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯複合物的製備將乳化劑按1∶100g/mL的配比加入到植物油中分散，40℃恆溫水浴中攪拌0.5h，再將步驟(1)中溶液按1∶1(V/V)加入到植物油中，乳化0.5h，溫度為30℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然後將三氯氧磷酯按其與水相溶液1∶4g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完後攪拌2h。(3)微球的精製將步驟(2)的溶液置於透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌3次後，乾燥、篩分、鈷60輻射滅菌，製得止血抗菌微球。實施例2(1)羧化澱粉-聚賴氨酸水相溶液的製備每次吸取40μLε-聚賴氨酸的水溶液(2％)在500r/min高速攪拌下滴定到裝有20mL的羧化澱粉溶液(0.4g/mL)中，製備得到羧化澱粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯複合物的製備將乳化劑按1∶200g/mL的配比加入到植物油中分散，45℃恆溫水浴中攪拌1h，再將步驟(1)中溶液按1∶1.1(V/V)加入到植物油中，乳化1h，溫度為35℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然後將三偏磷酸鈉按其與水相溶液1∶8g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完後攪拌3h。(3)微球的精製將步驟(2)的溶液置於透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌4次後，乾燥、篩分、鈷60輻射滅菌，製得止血抗菌微球。實施例3(1)羧化澱粉-聚賴氨酸水相溶液的製備每次吸取60μLε-聚賴氨酸的水溶液(2.5％)在300～1500r/min高速攪拌下滴定到裝有30mL的羧化澱粉溶液(0.5g/mL)中，製備得到羧化澱粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯複合物的製備將乳化劑按1∶300g/mL的配比加入到液體石蠟中分散，50℃恆溫水浴中攪拌1.5h，再將步驟(1)中溶液按1∶1.3(V/V)加入到液體石蠟中，乳化1.5h，溫度為40℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然後將多聚磷酸鈉按其與水相溶液1∶12g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完後攪拌3.5h。(3)微球的精製將步驟(2)的溶液置於透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌4次後，乾燥、篩分、鈷60輻射滅菌，製得止血抗菌微球。實施例4(1)羧化澱粉-聚賴氨酸水相溶液的製備每次吸取80μLε-聚賴氨酸的水溶液(4％)在300～1500r/min高速攪拌下滴定到裝有50mL的羧化澱粉溶液(0.6g/mL)中，製備得到羧化澱粉-聚賴氨酸溶液。(2)乳化交聯複合物的製備將乳化劑按1∶500g/mL的配比加入到液體石蠟中分散，60℃恆溫水浴中攪拌2h，再將步驟(1)中溶液按1∶1.5(V/V)加入到液體石蠟中，乳化2h，溫度為45℃，高速攪拌使體系呈乳液狀，然後將多聚磷酸鈉按其與水相溶液1∶20g/mL的配比逐滴加入到溶液中，滴加完後攪拌4h。(3)微球的精製將步驟(2)的溶液置於透析袋中透析，抽濾，依次用乙酸乙酯、無水乙醇和蒸餾水各洗滌5次後，乾燥、篩分、鈷60輻射滅菌，製得止血抗菌微球。實施例5吸水性能對比實驗本發明中採用毛細管法測定止血抗菌微球的吸水性能，注水於酸式滴定管內至酸式滴定管零刻度液面與砂芯漏鬥濾板下端齊平。將濾紙放入砂芯漏鬥，完全接觸於濾板。打開活塞至濾紙完全吸水，讀取滴定管刻度數據，作為初始零刻度。關閉活塞，稱取0.1g止血抗菌微球1#，均勻鋪在濾紙上，同時打開活塞，從液面開始下降，於25s，50s，75，100s計時觀察液面下降距離，計算樣品吸水速度及在單位時間內的吸水飽和情況。本發明實施例中的止血抗菌微球1#與AristaTM(Medafor公司，美國)吸水性能作對照，測定結果見下表1。表1止血抗菌微球1#與AristaTM吸水性比較止血抗菌微球1#AristaTM吸水速率(mL/g)(第一個25s)0.33460.2013吸水速率(mL/g)(第二個25s)0.14350.0463吸水速率(mL/g)(第三個25s)0.09290.0275吸水速率(mL/g)(第四個25s)0.04150.0101吸水倍率(mL/g)19.26.3吸水速率分別為在第一，第二，第三和第四個25s內吸水的平均速度，即20s內1g樣品的吸水量(mL)。參閱圖1為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水速率比較圖所示，並由表1中結果表明本發明的止血抗菌微球1#分別在四個25s內的吸水速率均明顯大於AristaTM，說明止血抗菌微球1#比AristaTM吸水更快，更高效。吸水倍率是指1g樣品所能吸水的最大量(mL)。參閱圖2為止血抗菌微球1#與AristaTM吸水倍率比較圖所示，並由表1可見，本發明的止血抗菌微球1#相對於AristaTM，其吸水倍率明顯提高，約為AristaTM的3倍。實施例6鼠肝滲血止血實驗取實驗用小白鼠10隻(體重為250～300g，雌雄不限)，隨機分組，每組5隻，分為止血抗菌微球1#實驗組和AristaTM對照組。將鼠稱重，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30～40mg/kg麻醉，固定於手術臺上，剪除腹部的毛，無菌操作打開腹腔，暴露肝臟，用手術刀片在肝臟上劃出長約1cm，深約0.5cm的交叉傷口，立即在傷口處依次覆蓋由實施例1製備的止血抗菌微球1#和已稱重紗布，並於紗布放置砝碼以壓迫止血，即刻起開始計時，用紗布按壓20、40、60s，AristaTM對照組按上述步驟同樣處理，觀察各組止血情況，記錄止血成功例數見下表2。表2止血抗菌微球1#與AristaTM止血時間比較止血抗菌微球1#實驗組AristaTM對照組按壓20s成功止血例數3/51/5按壓40s成功止血例數5/53/5按壓60s成功止血例數5/54/5實施例7鼠股動脈穿刺出血止血實驗取實驗用小白鼠10隻(體重為250～300g，雌雄不限)，隨機分組，每組5隻，分為止血抗菌微球1#實驗組和AristaTM對照組。將鼠稱重，耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30～40mg/kg麻醉，預定於手術臺上，暴露股動脈，用6號針頭穿刺暴露好的股動脈，自由噴血後用紗布拭去多餘血液，然後立即在傷口處依次覆蓋止血抗菌微球1#和已稱重紗布，並於紗布放置砝碼以壓迫止血，即刻起開始計時，用紗布按壓20、40、60s，AristaTM對照組按上述步驟同樣處理，觀察各組止血情況，記錄止血成功例數見下表3。表3止血抗菌微球1#與AristaTM在不同止血時間內成功止血例數比較止血抗菌微球1#實驗組AristaTM對照組按壓20s成功止血例數4/51/5按壓40s成功止血例數5/53/5按壓60s成功止血例數5/54/5表2、3的結果均表明止血抗菌微球1#實驗組和AristaTM對照組在按壓20、40、60s成功止血例數有明顯不同，前者較後者多，說明止血抗菌微球1#較AristaTM的止血效果好、效率高。實施例8抑菌效果檢測實驗將金葡菌9h肉湯培養物製成菌懸液，取被試樣液(止血抗菌微球1#和AristaTM)和對照樣液(5mL)各2管。取上述菌懸液，分別在每個被試樣液和對照樣液內滴加100μL，混合均勻。開始計時，作用20min，分別取樣液(0.5mL)投入含5mLPBS的試管內，充分混勻，作適當稀釋，然後取其中2～3個稀釋度，分別吸取1ml，置於3個平皿，用涼至40～45℃的營養瓊脂培養基15mL作傾注，轉動平皿，使其充分均勻，瓊脂凝固後翻轉平板，37℃培養48h，作活菌菌落計數，試驗重複3次，計算抑菌率，見下表4。表4止血抗菌微球1#和AristaTM抑菌率比較樣品類型抑菌率(％)5mLPBS05mL止血抗菌微球1#90.85mLAsritaTM40.2參閱圖3為止血抗菌微球1#與AristaTM抑菌率比較圖所示，並由表4中結果表明止血抗菌微球的抑菌率高達90.8％，遠遠高於AristaTM的抑菌水平，具有較強的抑菌效果，對傷口處細菌殺傷能力較強。上述實施例均為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，任何其他的未背離本發明的實質性操作或工藝方法與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化等，均應為本發明的等效置換，都包含在本發明的保護範圍之內。本發明快速止血抗菌微球，製備步驟簡單、易操作，成本低廉，止血效果好且抗菌性能強，具有很高的應用價值。當前第1頁1 2 3