核心蛋白聚糖的製備方法

2023-06-06 11:17:56

專利名稱：核心蛋白聚糖的製備方法
一. 所屬領域本發明涉及生物技術，特別涉及一種核心蛋白聚糖的製備方法。
二.
背景技術：
核心蛋白聚糖(英文名Decorin，縮寫DC、DCN)屬細胞外基質(extracellularmatrix，ECM)成分和膠原纖維緊密相連，Decorin多分布於人和動物體的肌腱、皮膚、骨、軟骨、臍帶、韌帶及角膜等部位的各種結締組織中，是一種蛋白多糖，由一個核心蛋白和一單鏈氨基多糖組成，帶糖鏈時分子量為80-100kD(鼠)、95-120kD(人)，所帶糖鏈為透明質酸、硫酸軟骨素、硫酸角質素、肝素。經硫酸軟骨素酶消化處理後得到35-45kD的核心蛋白。經胺基酸序列分析，人和動物(牛、鼠)的核心蛋白保守區高度一致，其分子量也相當接近，人cDNA為330胺基酸，分子量為36.32kD，大鼠分子量約為37kD，核心蛋白亮氨酸含量相當豐富，約佔總胺基酸的80％，且亮氨酸排列組合有一定的規律性，即由24個亮氨酸構成的重複序列不少於10次。生物活性是由核心蛋白決定的，亦核心蛋白聚糖和去掉糖鏈後的核心蛋白二者都有生物學活性。
迄今為止，對Decorin的研究僅有十幾年的歷史，國內尚未見報導。Decorin是轉化生長因子-β(TGF-β)的拮抗劑，它能結合併中和TGF-β，下調TGF-β所有的生物學活性。TGF-β的過量表達可導致疤痕形成和器官纖維化，當發展成慢性後，最終破壞組織結構。美國Tellos製藥公司，用Decorin治療因TGF-β過量表達所致的器官瘢痕，已進入I期臨床研究。
近年來，美國更多學者正在研究Decorin的抗腫瘤作用，資料表明，其抗腫瘤機制為激活表皮生長因子受體(EGFR)，激活MAP信號傳導通道，繼而持續誘導P21抑瘤蛋白的表達。對於其抗腫瘤活性的檢測，則是採用MTS/PMS雙顏料結合法來了解Decorin對鱗癌細胞株(A431)的抑制作用。因此，Decorin尚有可能成為抗腫瘤新藥。
三.

發明內容
本發明的目的在於提供一種核心蛋白聚糖的製備方法，利用生物技術生產高純度。高活性的核心蛋白聚糖藥物。
本發明的技術方案製備所需要的原材料為動物肌肉組織，製備過程為勻漿→離心8000～12000轉/分鐘、10～30分鐘、2～10℃以內→收沉澱用1～3倍沉澱溶解液溶解懸浮沉澱→透析→研磨→層析→收峰→定量、定性→凍幹→低溫下保存。
具體步驟為①、將新鮮動物肌肉組織洗淨，剪碎，以1～3倍體積的勻漿液勻漿，勻漿液配製是10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、0.5％曲拉通(Triton)X-100、10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液，pH6.0；②、離心在2～10℃溫度下以8000～12000轉/分鐘的速度離心10～30分鐘；③、收沉澱用1～3倍體積的沉澱溶解液溶解懸浮沉澱，沉澱溶解液配製是4mol/L尿素(Urea)、10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液；於2～10℃內，在電磁攪拌下連續攪拌過夜；④、透析移入玻璃紙透析袋、在2～10℃溫度下透析，透析過程為流水透析48小時後，10倍體積的蒸餾水透析24小時，再用10倍體積的磷酸鹽緩衝液(PBS)濃度為1～10mmol/L、PH值為6～7透析48小時；⑤、研磨用濃度為1～10mmol/L、PH值為6～7磷酸鹽緩衝液(PBS)或0.9％氯化鈉(NaCl)，多次反覆研磨；⑥、層析離心收上清液過陰離子交換柱，洗脫液濃度為1～10mmol/L、PH值6～7磷酸鹽緩衝液(PBS)，或A、B液A液10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)-1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)PH8.0；B液A+1mol/L氯化鈉(NaCl)，在280nm監測下收目標蛋白洗脫峰，測定含量、純度及生物學活性。
本發明的特點是1.勻漿液和沉澱溶解液的配方有利於核心蛋白聚糖的釋放溶解；2.增加了研磨這一步驟，更利於分離純化核心蛋白聚糖及提高產量；3.層析次數為一次，操作簡便。
本發明的優點是以動物肌肉組織為原材料，原材料易得，採用生物技術生產，操作簡便易行，可生產出高純度.高活性的核心蛋白聚糖藥物。
四.
具體實施例方式1.製備①、勻漿取動物肌肉組織，剪碎，用1～3倍體積的勻漿液勻漿，勻漿液配製是勻漿液(10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、0.5％曲拉通(Triton)X-100、10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液pH6.0)；②、離心在4℃溫度下以12000r/min×15min的速度離心；③、溶解收沉澱用2倍體積沉澱溶解液溶解沉澱，沉澱溶解液配製是4mol/L尿素(Urea)、10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液；④、攪拌在4℃溫度下電磁攪拌過夜；⑤、透析透析過程為先流水透析48小時，再以10倍體積的蒸餾水透析24小時，最後以10倍體積的濃度為10mmol/L、PH值為6.8的磷酸鹽緩衝液(PBS)透析48小時，於4℃溫度下透析。
⑥、研磨收透析袋沉澱部分，用10mmol/L PBS(PH6.8)研磨；⑦、離心4℃溫度下，以12000r/min×15min速度離心；⑧、層析將上清液上柱，條件FPLC Mono Q陰離子交換柱，洗脫液為A、B液A液10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)-1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)PH8.0；B液A+1mol/L氯化鈉(NaCl)，0.5A280nm，收核心蛋白峰。
2.鑑定外觀外觀為無色透明的液體或白色凍幹疏鬆體無菌實驗按《生物製品無菌實驗規程》進行PH值pH＝6.5～7.5之間多肽含量Folin-酚法0.1～1.0mg/ml純度鑑定SDS-PAGE電泳，30％聚丙烯醯胺凝膠，厚度1mm垂直平板電泳。T＝15％、C＝6％，SDS濃度為1％，電極緩衝液為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸(pH8.0)，上樣1～10ug不等，電壓160V，電泳1hr，用考馬斯亮藍R-250染色。結果顯示在低分子量標準蛋白31,000～43,000道爾頓之間有兩條顯帶，分子量大約為37,000～38,000道爾頓，背景乾淨無雜帶。
生物活性檢測Decorin與表皮生長因子受體(EGF-R)的作用實驗分對照和實驗二組。取已長好的人肺癌上皮細胞株(A549)，用消化液(0.25％胰蛋白酶-生理鹽水)消化，計數，用10％Fcs-1640調細胞1×105/ml，分於96孔板100ul/孔，對照組加生理鹽水，實驗組加重組人表皮生長因子(rhEGF)和Decorin，rhEGF的濃度為100ng/ml、Decorin的濃度為200ug/ml。將培養板置37℃，5％ CO2孵育24h，1500轉離心15min，加MTT 20ul/孔，繼續孵育4h，小心吸棄上液100ul，向每孔加DMSO 100ul，輕輕搖勻後，在ELISA-readerMR 4000參考波長670nm、測試波長為570nm，測定各孔A值。共做5批次，每次設3個復孔，3復孔差＜30％，按下公式計算活性檢測結果抑制細胞增殖率(％)＝(對照A—實驗A)/對照A×100％。
3.結果生物活性Decorin對A549癌細胞生長抑制活性結果(A570nm)An對照組實驗組抑制率(％)10.234 0.098 58.1220.153 0.050 67.3230.204 0.087 57.3540.144 0.050 65.2850.180 0.065 63.89X0.183 0.070 61.75從上面活性結果可知純化的核心蛋白聚糖對A549癌細胞具有明顯的抑制作用，其抑制增殖率在50.00％以上。
權利要求
1.核心蛋白聚糖的製備方法，其特徵在於製備所需要的原材料為動物肌肉組織，製備方法由以下幾個步驟組成①、將新鮮動物肌肉組織洗淨，剪碎，以1～3倍體積的勻漿液勻漿，勻漿液配製是10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、0.5％曲拉通(Triton)X-100、10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液，pH6.0；②、離心在2～10℃溫度下以8000～12000轉/分鐘的速度離心10～30分鐘；③、收沉澱用1～3倍體積的沉澱溶解液溶解懸浮沉澱，沉澱溶解液配製是4mol/L尿素(Urea)、10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液；於2～10℃內，在電磁攪拌下連續攪拌過夜；④、移入玻璃紙透析袋、在2～10℃溫度下透析，透析過程為流水透析48小時後，10倍體積的蒸餾水透析24小時，再用10倍體積的磷酸鹽緩衝液(PBS)濃度為1～10mmol/L、PH值為6～7透析48小時；⑤、研磨用濃度為1～10mmol/L、PH值為6～7磷酸鹽緩衝液(PBS)或0.9％氯化鈉(NaCl)，多次反覆研磨；⑥、離心收上清液過陰離子交換柱，洗脫液濃度為1～10mmol/L、PH值6～7磷酸鹽緩衝液(PBS)，或A、B液A液10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)-1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)PH8.0；B液A+1mol/L氯化鈉(NaCl)，在280nm監測下收目標蛋白洗脫峰，測定含量、純度及生物學活性。
2.根據權利要求1所述的核心蛋白聚糖的製備方法，其特徵在於製備方法由以下幾個步驟組成①勻漿取動物肌肉組織，剪碎，用1～3倍體積的勻漿液勻漿，勻漿液配製是勻漿液(10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、0.5％曲拉通(Triton)X-100、10mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液pH6.0)；②離心在4℃溫度下以12000r/min×15min的速度離心；③溶解收沉澱用2倍體積沉澱溶解液溶解沉澱，沉澱溶解液配製是4mol/L尿素(Urea)、10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)、10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)、50mmol/L醋酸鈉(NaAc)緩衝液；④攪拌在4℃溫度下電磁攪拌過夜；⑤透析透析過程為先流水透析48小時，再以10倍體積的蒸餾水透析24小時，最後以10倍體積的濃度為10mmol/L、PH值為6.8的磷酸鹽緩衝液(PBS)透析48小時，於4℃溫度下透析。⑥研磨收透析袋沉澱部分，用10mmol/LPBS(PH6.8)研磨；⑦離心在4℃溫度下以12000r/min×15min速度離心；⑧層析收上清液上FPLCMonoQ陰離子交換柱，洗脫液為A、B液A液10mmol/L三羥甲基氨基甲烷·鹽酸(Tris·HCl)-1mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)PH8.0；B液A+1mol/L氯化鈉(NaCl)，0.5A280nm，收集各洗脫峰，鑑定分析，最後收集純化的核心蛋白聚糖。
全文摘要
核心蛋白聚糖的製備方法，以動物肌肉組織為原料，採用勻漿、離心、收沉澱、透析、研磨及層析及回收，再鑑定質量和純度，活性檢測。該發明具有操作簡便易行，且生產出的藥物純度高、活性高等特點。
文檔編號C08H1/00GK1472236SQ0311456
公開日2004年2月4日 申請日期2003年3月24日 優先權日2003年3月24日
發明者王國華, 柴玉波, 陳志陽, 蒲勤, 陳南春, 何鵬, 劉新平, 藥立波 申請人:中國人民解放軍第四軍醫大學