核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立及鑑定方法

2023-06-06 14:34:36

專利名稱:核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立及鑑定方法
技術領域：
本發明涉及一種生物學功能研究領域，更具體地說，涉及一種核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型建立方法。
背景技術：
核心巖藻糖基化是普遍的蛋白質翻譯後修飾過程。FutS是修飾核心巖藻糖基化的唯一的糖基轉移酶(如圖8所示)，能夠調節蛋白質的空間結構和生物學功能，如分子間相互作用、細胞與細胞間的相互識別、蛋白質的正確定位、細胞信號傳導等。FutS+小鼠有肺氣腫表現型，這是因為轉化生長因子I受體上的核心巖藻糖基缺損則降低TGF I與受體的結合能力，激活基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，引起肺氣腫病變；Fut8基因敲除導致細胞表面的血管內皮生長因子受體表達量下降。另外，Stubbs等發現核心巖藻糖基化程度能影響糖蛋白分子上的N-糖鏈的分子構象和柔軟性。
目前常用的方法是利用RNA幹擾(RNA interference, RNAi)或基因敲除方法，抑制該基因表達，觀察相應功能的丟失。基因敲除方法既費時間又需要尖端實驗設備。RNA i發現為人們提供了特異性阻斷基因表達的新策略。RNA i通過在細胞內轉染與靶基因相同序列的2Ibp的雙鏈RNA，即可使靶基因降解，而且具有特異性強、抑制效率高等特點。目前常用的siRNA導入方法是利用脂質體導入雙鏈siRNA或含有siRNA序列的載體，但是上述方法存在siRNA進入細胞後容易被降解、在細胞內的效應持續時間短、siRNA表達載體轉染效率低等問題。針對這種情況，目前應用較多的是逆轉錄病毒、腺病毒、脂質體等載體。
目前，有關一種核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型建立方法的文章及專利如下
(I)用於失活a -1，6巖藻糖基轉移酶(FUT8)基因表達的方法和組合物(專利公開號CN101883850A)
(2) Methods and compositions for inactivating alphaI, 6fucosy I transferase (FUT8) gene expression (專利公開號=US2OO9(M225C) (Al))
(3) Compositon for suppressing the expression of fucosyltransferase (專利公開號US2009221065(A1))
(4) Wang X, Inoue S, Gu J, et al. Dysregulation of TGF-betalreceptoractivation leads to abnormal lung development and emphysema-1 ike phenotype incore fucose-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 2005, 102 (44):15791-6.
(5)Stubbs HJ et al.1nfluence of core fucosylation on the flexibility ofa biantennary N-1inked oligosaccharide. Biochemistry 1996, 35:937-947.
專利1-3發明使用包含鋅指蛋白和切割結構域或切割半結構域的融合蛋白來失活FUT8基因的方法和組合物。還提供了編碼所述融合蛋白的多核苷酸，以及包含所述多核苷酸和融合蛋白的細胞。
文章4介紹轉化生長因子I受體上的核心巖藻糖基缺損則降低TGFl與受體的結合能力，激活基質金屬蛋白酶(MMP)的表達，引起肺氣腫病變。
文章5介紹核心巖藻糖基化程度能影響糖蛋白分子上的N-糖鏈的分子構象和柔軟性。
目前，Fut8siRNA複製缺陷型重組逆轉錄病毒構建Fut8基因沉默細胞模型的研究尚無報導。

發明內容
本發明利用重組逆轉錄病毒載體構建了 PSINs1-hU6-Fut8siRNA載體，克服了傳統載體的諸多弊端，以穩定表達Fut8siRNA，通過細胞感染的方式快速建立Fut8基因沉默細胞模型，旨在為Fut8基因生物學功能研究奠定基礎。
為了達到上述目的，本發明一種核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，包括如下步驟
Stepl、根據Fut8基因序列，設計I條21個核苷酸雙鏈Fut8siRNA序列
CUGAUCACU CCAGCAGAGA (759-778)；
並設計Fut8siRNA雙鏈短髮夾結構
siRNA-sense:
5 ' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';siRNA-antisense:
5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3'
Step 2、將該條Fut8siRNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSINsi_hU6中，構建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 載體；
Step 3、FutS基因沉默細胞模型的建立，包括如下分步
Step 31、用脂質體轉染法將 pSINs1-hU6_Fut8siRNA, pE-ampho 載體，pGP 載體共同轉染293T細胞，包裝攜帶有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆轉錄病毒；
Step 32、將 3-5X IO4祀細胞進行 9_12h 培養,利用 7-lOug/mL polybrane 孵育後，通過病毒感染方式將Fut8siRNA轉染至靶細胞內；
Step 33、用400-1000ug/ml G418進行篩選，並挑取單個細胞，進行擴大培養，獲得穩定的Fut8基因沉默細胞模型。
優選方式下，Step31 中的的脂質體與 pSINs1-hU6_Fut8siRNA、pE-ampho 載體、PGP載體的摩爾濃度比例為4-5 :1. 5-2 1-1. 5 1-1. 5 ；Step 32中病毒液與細胞培養液之間的比例為1-2:10。
本發明還提供了上述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的檢測方法，選用實時定量PCR鑑定，其中，所述實時定量PCR的引物序列為
sense:AACAGCTTGTTAAGGCCAAAG,
antisense:GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC。
本發明還提供了上述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型酶活性的檢測方法，利用HPLC法測定Fut8酶活性，細胞裂解液蛋白含量為0. 2-0. 5mg,反應時間為2_5小時。
本發明在4種優先設計的FutS基因RNA幹涉靶序列中選擇最有效RNA幹涉靶序列。根據該序列在體外合成兩段互補的寡核苷酸，利用載體上的BamH I和Cla I酶切位點，將Fut8基因siRNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSINs1-hU6中。經293T細胞包裝後，重組逆轉錄病毒滴度可達2. lX105CFU/ml,產生的重組逆轉錄病毒感染前B細胞株(70Z/3細胞)，通過400-1000ug/ml G418篩選獲得穩定表達株，命名為Fut8-KD-70Z/3。用Realtime-PCR及高效液相色譜(HPLC)檢測結果表明，Fut8siRNA複製缺陷型重組逆轉錄病毒感染70Z/3細胞中，FutSmRNA及酶活性顯著下降。該發明具有操作簡單，基因沉默效率高、重複性好等優點。Fut8基因沉默細胞模型的建立為Fut8基因生物學功能研究奠定了基礎。


圖1是4條Fut8siRNA雙鏈序列；
圖 2 是 TransIT-TKO transfection reagent 與雙鏈 siRNA 的最適比例；
圖3是篩選Fut8siRNA的最有效序列；
圖4是逆轉錄病毒質粒pSINs1-hU6_Fut8siRNA的PCR鑑定；
圖5是經G418篩選的Fut8基因沉默70Z/3細胞；
圖6是Fut8基因沉默70Z/3細胞中Fut8基因表達量明顯下降；
圖7是Fut8基因沉默70Z/3細胞中Fut8酶活性明顯下降；
圖8是Fut8催化反應圖。
具體實施方式
本發明的技術方案是 首先設計4種Fut8基因RNA幹涉靶序列，選擇最有效RNA幹涉靶序列。將Fut8siRNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSINs1-hU6中。經293T細胞包裝後產生的重組逆轉錄病毒感染前B細胞株(70Z/3細胞)，通過G418篩選獲得穩定表達株，命名為Fut8-KD-70Z/3。該發明具有操作簡單，基因沉默效率高、重複性好等優點。Fut8基因沉默細胞模型的建立為Fut8基因生物學功能研究奠定了基礎。
實施例1 :
(I) Fut8siRNA 片段的選擇利用網上 http: //rnaidesigner.1nvitrogen. com/sirna軟體程序設計4條21個核苷酸雙鏈siRNA序列(19個核苷酸+overhang TT)。從Fut8 基因(GenBank Accession NM_016893)中分別選擇 4 種 siRNA 序列(圖1)。利用TransIT-TKO transfection reagent (Mirus Co. Madison, USA)把 4 條雙鏈 siRNA 轉染到靶細胞內，24小時後，篩選特異性抑制Fut8表達的最有效siRNA序列。TransIT-TKOtransfection reagent與雙鏈siRNA的比例為8:3 (圖2)。經過酶活性測定，最終確定Fut8siRNA(759-778:CUG AUC ACU CCA GCA GAGATT)為最佳序列(圖 3)。
(2)含Fut8基因的重組逆轉錄病毒載體構建pSINs1-hU6_Fut8的構建用siRNA hairpin Oligonucleotide Sequence Designer 軟體設計成雙鏈髮夾結構，siRNA-sense: 5 '(3)逆轉錄病毒包裝及病毒滴度測定按Wizard Plus SV Minipreps DNA純化試劑盒操作說明提取pSINs1-hU6-Fut8siRNA，用脂質體轉染法將pSINs1-hU6_Fut8siRNA，pE-ampho載體，pGP載體共同轉染包裝細胞293T，形成重組的具有一次感染性的假型逆轉錄病毒顆粒，獲得了攜帶有FutS靶向的SiRNA的逆轉錄病毒。脂質體與質粒的比例為4:1. 5:1:1。轉染後48h，胰酶消化，稀釋傳代，培養24h後，以800ug/ml G418進行篩選。兩周後，挑選單克隆細胞，轉入24孔培養板培養，經擴增後，轉入6cm培養皿培養。以每6cm平皿接種5X104NIH3T細胞，接種後24h，用polybrene 9ug/mL孵育後，接種1:1
0,1 100，I 1000, 1:10000, I 100000稀釋的病毒液，繼續培養24h後，胰酶消化、培養24h,再加入800ug/ml G418篩選2周後，經甲醒固定，Giemsa染色，計抗性細胞克隆數，以此計算病毒滴度，以克隆形成單位表示(CFU/ml)。
(4) Fut8基因沉默70Z/3細胞克隆篩選準備階段第一天取3X 10470Z/3細胞六孔板中，加入一定培養液，放到CO2培養箱中培養。感染階段換液,加入polybrene 7ug/mL和重組逆轉錄病毒液體，在CO2培養箱中孵育4-6h，後再追加Iml培養液到六孔板中，CO2培養箱過夜培養。病毒液與細胞培養液之間的比例為1:10。G418篩選加入G418 (400ug/ml)於培養液中，然後每隔3天換含G418的培養液。兩周後，在顯微鏡下取單個70Z/3細胞進行96孔板培養，獲得穩定 Fut8基因沉默細胞株(Fut8-KD-70Z/3細胞)。導入空載體的70Z/3細胞作為Mock細胞。利用293T細胞進行逆轉錄病毒包裝，並獲得含有Fut8siRNA的逆轉錄病毒顆粒。通過病毒感染實驗，感染70Z/3細胞，再用400ug/mlG418進行篩選。挑取單個細胞，接種到96孔板中進行擴大培養，獲得穩定的FutS基因沉默細胞模型(圖5)。
(5)實時定量 PCR 取 1父106個702/3細胞和？此8-1(0-702/3細胞，按 TrizolRNA提取試劑盒的操作說明提取細胞總RNA。以Oligo (dT)為起始引物，加入總RNA I u g，70°C IOmin 後，依次加入無 RNase 水，10XRT buffer, 250 u mol/LdNTPs, RNase-1nhibitor,RT Reverse Transcriptase,反應體系為20 ii I。於PCR儀器內，設定程序,42 ° C90min，85。C 5min, 4° C lmin，同時利用 SYBR Green 通過實時定量 PCR檢測 GAPDH，70Z/3和Fut8-KD-70Z/3中cDNA的量。用SYBR Green Real-time PCR試劑盒，加入一定量的試齊[J，於PCR儀內，設定程序變性94° C 3min退火延伸，93° C IOs, 52° C 20s, 72° Clmin 35個循環。對反轉錄產物進行Real-time PCR，測定cDNA的表達量。使用管家基因GAPDH對加入到反轉錄反應中的RNA進行均一化處理。70Z/3及Fut8-KD_70Z/3細胞中提取mRNA，進行實時定量PCR檢測。與70Z/3細胞相比，Fut8-KD_70Z/3細胞的Fut8mRNA表達下降(圖6)。
(6)Fut8酶活性測定取1父106個702/3細胞和？此8-1(0-702/3細胞，用PBS洗兩次，後用含0. 05%胰蛋白酶和0. 0296EDTA在37 ° C孵育45min。利用l%Triton_100進行裂解，IOOOOrpm離心5min，取上清，測蛋白含量，與底物進行反應。底物為PABA: 4- (2-pyridylamino) butylamine 標記的 S:GnGn_b1-Asn-PABA。通過 HPLC 對其產物(P:GnGnFuc-b1-Asn_PABA)進行分析。Fut8 酶活性(pmol/hr/mg)由按照公式[P(pmol)/反應時間(hr)/蛋白質含量(mg)]來計算。蛋白含量為0. 200mg，反應時間為2小時。70Z/3及Fut8-KD-70Z/3細胞中提取蛋白質進行HPLC檢測。與70Z/3細胞相比，Fut8-KD_70Z/3細胞的酶活性明顯下降(圖7)。
實施例2
(I) Fut8siRNA 片段的選擇利用網上 http: //rnaidesigner.1nvitrogen. com/sirna軟體程序設計4條21個核苷酸雙鏈siRNA序列(19個核苷酸+overhang TT)。從Fut8 基因(GenBankAccession NM_016893)中分別選擇 4 種 siRNA 序列(圖1)。利用TransIT-TKO transfection reagent (Mirus Co. Madison, USA)把 4 條雙鏈 siRNA 轉染到靶細胞內，24小時後，篩選特異性抑制Fut8表達的最有效s iRNA序列。Trans IT-TKOtransfection reagent與雙鏈siRNA的比例為8:5 (圖2)。經過酶活性測定，最終確定Fut8siRNA(759-778:CUG AUC ACU CCA GCA GAGATT)為最佳序列(圖 3)。
(2)含Fut8基因的重組逆轉錄病毒載體構建pSINs1-hU6_Fut8的構建用siRNA hairpin Oligonucleotide Sequence Designer 軟體設計成雙鏈髮夾結構，siRNA-sense:5 '(3)逆轉錄病毒包裝及病毒滴度測定按Wizard Plus SV Minipreps DNA純化試劑盒操作說明提取pSINs1-hU6-Fut8siRNA，用脂質體轉染法將pSINs1-hU6_Fut8siRNA，pE-ampho載體，pGP載體共同轉染包裝細胞293T，形成重組的具有一次感染性的假型逆轉錄病毒顆粒，獲得了攜帶有FutS靶向的SiRNA的逆轉錄病毒。脂質體與質粒的比例為5:2:1. 5:1. 50轉染後48h，胰酶消化，稀釋傳代，培養24h後，以800mg/L G418進行篩選。兩周後，挑選單克隆細胞，轉入24孔培養板培養，經擴增後，轉入6cm培養皿培養。以每6cm平皿接種5X104NIH3T細胞，接種後24h，用polybrene 9ug/mL孵育後，接種I 10，I 100, 1:1000, 1:10000, I 100000稀釋的病毒液，繼續培養24h後，胰酶消化、培養24h,再加入800ug/ml G418篩選2周後，經甲醒固定，Giemsa染色，計抗性細胞克隆數，以此計算病毒滴度，以克隆形成單位表示(CFU/ml)。
(4)Fut8基因沉默70Z/3細胞克隆篩選準備階段第一天取5 X 10470Z/3細胞六孔板中，加入一定培養液，放到CO2培養箱中培養。感染階段換液，加入polybrene 10ug/mL和重組逆轉錄病毒液體，在CO2培養箱中孵育4-6h，後再追加Iml培養液到六孔板中，CO2培養箱過夜培養。病毒液與細胞培養液之間的比例為2:10。G418篩選加入G418 (IOOOug/ml)於培養液中，然後每隔3天換含G418的培養液。兩周後，在顯微鏡下取單個70Z/3細胞進行96孔板培養，獲得穩定Fut8基因沉默細胞株(Fut8-KD-70Z/3細胞)。導入空載體的70Z/3細胞作為Mock細胞。利用293T細胞進行逆轉錄病毒包裝，並獲得含有Fut8siRNA的逆轉錄病毒顆粒。通過病毒感染實驗，感染70Z/3細胞，再用1000ug/mlG418進行篩選。挑取單個細胞，接種到96孔板中進行擴大培養，獲得穩定的FutS基因沉默細胞模型(圖5)。
(5) Fut8 酶活性測定取 I X IO6 個 70Z/3 細胞和 Fut8-KD_70Z/3 細胞，用 PBS洗兩次，後用含0. 05%胰蛋白酶和0. 0296EDTA在37° C孵育5min。利用l%Triton_100進行裂解，IOOOOrpm離心5min，取上清，測蛋白含量，與底物進行反應。底物為PABA: 4- (2-pyridylamino) butylamine 標記的 S:GnGn_b1-Asn-PABA。通過 HPLC 對其產物(P:GnGnFuc-b1-Asn_PABA)進行分析。Fut8 酶活性(pmol/hr/mg)由按照公式[P(pmol)/反應時間(hr)/蛋白質含量(mg)]來計算。蛋白含量為0. 500mg，反應時間為5小時。70Z/3及Fut8-KD-70Z/3細胞中提取蛋白質進行HPLC檢測。與70Z/3細胞相比，Fut8-KD_70Z/3細胞的酶活性明顯下降(圖7)。
根據上述兩個實施例，本發明方法概括如下，步驟為
S1、最佳Fut8siRNA片段的選擇,具體分步如下
SI1、根據Fut8基因序列，設計4條21個核苷酸雙鏈siRNA序列；CUGAUCA⑶CCAGCAGAGA (759-778) ；CAGCUUGUUAAGGCCAAAG (918-936) ;UCUCAGAAUUGGCGCUAUG(1386-1404) ;CAGGC UUAUAUCCCUCCUA (2302-2320)。
S12、利用 TransIT-TKO transfection reagent 將把每一個雙鏈 siRNA 轉染到革巴細胞內，用實時定量PCR測定其Fut8mRNA，最後篩選特異性抑制Fut8mRNA表達的最有效Fut8siRNA 序列；
S2、複製缺陷型Fut8siRNA重組逆轉錄病毒載體(pSINs1-hU6_Fut8siRNA)的構建，具體分步如下
S21、根據最有效Fut8siRNA序列設計Fut8siRNA雙鏈短髮夾結構。
S22、將Fut8siRNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSINsi_hU6中，構建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 載體。
S3、Fut8基因沉默細胞模型的建立
S31、用脂質體(Iipofectamine)轉染法將 pSINs1-hU6_Fut8siRNA, pE-ampho 載體，pGP載體共同轉染293T細胞，包裝攜帶有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆轉錄病毒。
S32、將3-5X IO4祀細胞進行9_12h培養,利用7-lOug/mL polybrane孵育後，通過病毒感染方式將Fut8siRNA轉染至靶細胞內。
S33、用400-1000ug/ml G418進行篩選，並挑取單個細胞，進行擴大培養，獲得穩定的Fut8基因沉默細胞模型。
步驟S12 的最有效 Fut8siRNA 序列為(759-778: CUGAUCACUCCAGCAGAGA)。步驟 S12具體步驟為利用 Trans IT-TKO transfection reagent 和 Fut8siRNA 的比例為 8 :3_8 :5。
在步驟S21 的 Fut8siRNA雙鏈短髮夾結構序列為 siRNA-sense:5' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';
siRNA-antisense:5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3'。
在步驟S31 中的的脂質體(lipofectamine)與 pSINs1-hU6_Fut8siRNA, pE-ampho載體，pGP載體的摩爾濃度比例為4-5 :1. 5-2 1-1. 5 1-1. 5。在步驟S32的病毒液與細胞培養液之間的比例為1-2:10。
最終檢測所述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞的方法為實時定量PCR。實時定量 PCR 的引物序列為，sense:AACAGCTTGTTAAGGCCAAAG, antisense:GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC。
利用HP LC法測定Fut8酶活性時，細胞裂解液蛋白含量為0. 2-0. 5mg,反應時間為2-5小時。
以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式
，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域：
的技術人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，其特徵在於，包括如下步驟 51、根據Fut8基因序列，設計I條21個核苷酸雙鏈Fut8siRNA序列
CUGAUCACU CCAGCAGAGA (759-778)； 並設計Fut8siRNA雙鏈短髮夾結構 siRNA-sense:
5' -GATCCACTGATCACTCCAGCAGAGATTCAAGAGATCTCTGCTGGAGTGATCAGTTTTTTAT-3';
siRNA-antisense:
5' -CGATAAAAAAACTGATCACTCCAGCAGAGATCTCTTGAACTCTGCTGGAGTGATCAGTG-3' 52、將該條Fut8siRNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSINsi_hU6中，構建pSINs1-hU6-Fut8siRNA 載體； 53、Fut8基因沉默細胞模型的建立，包括如下分步 531、用脂質體轉染法將PSINs1-hU6-Fut8siRNA，pE-ampho載體，pGP載體共同轉染293T細胞，包裝攜帶有PSINs1-hU6-Fut8siRNA的逆轉錄病毒； 532、將3-5X IO4靶細胞進行9-12h培養，利用7-10ug/mL polybrane孵育後，通過病毒感染方式將Fut8siRNA轉染至靶細胞內； 533、用400-1000ug/mlG418進行篩選，並挑取單個細胞，進行擴大培養，獲得穩定的Fut8基因沉默細胞模型。
2.根據權利要求
1所述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，其特徵在於，步驟S31中的的脂質體與pSINs1-hU6-Fut8siRNA、pE_ampho載體、pGP載體的摩爾濃度比例為 4-5 :1. 5-2 1-1. 5 1-1. 5。
3.根據權利要求
2所述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，其特徵在於，步驟S32中病毒液與細胞培養液之間的比例為1-2:10。
4.一種針對上述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的檢測方法，其特徵在於，實時定量PCR鑑定，其中，所述實時定量PCR的引物序列為，
sense:AACAGCTTGTTAAGGCCAAAG,
antisense:GCATGTCTTTGGAGTTCATTTC。
5.一種針對上述核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型酶活性的檢測方法，其特徵在於，利用HPLC法測定Fut8酶活性，細胞裂解液蛋白含量為0. 2-0. 5mg,反應時間為2_5小時。
專利摘要
本發明公開了一種核心巖藻糖基轉移酶基因沉默細胞模型的建立方法，選擇最有效RNA幹涉靶序列，在體外合成兩段互補的寡核苷酸，利用載體上的BamH Ⅰ和Cla Ⅰ酶切位點，將Fut8基因siRNA片段重組到逆轉錄病毒質粒pSINsi-hU6中。經293T細胞包裝後，重組逆轉錄病毒滴度可達2.1×105CFU/ml，產生的重組逆轉錄病毒感染前B細胞株通過400-1000ug/ml G418篩選獲得穩定表達株。用Real time-PCR及高效液相色譜(HPLC)檢測結果表明，Fut8siRNA複製缺陷型重組逆轉錄病毒感染70Z/3細胞中，Fut8mRNA及酶活性顯著下降。本發明具有操作簡單，基因沉默效率高、重複性好等優點。Fut8基因沉默細胞模型的建立為Fut8基因生物學功能研究奠定了基礎。
文檔編號C12N15/867GKCN103045647SQ201210496554
公開日2013年4月17日 申請日期2012年11月29日
發明者李文哲, 金錦花 申請人:大連大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan