一種基於點擊化學的肺炎多糖結合疫苗及其製備方法

2023-06-06 07:37:31

專利名稱：一種基於點擊化學的肺炎多糖結合疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域的一種疫苗藥物，具體地說涉及一種肺炎多糖結合疫苗；本發明還涉及其製備方法和免疫學評價。
背景技術：
肺炎鏈球菌是革蘭氏陽性囊狀雙球桿菌，可導致鼻竇炎、中耳炎、氣管炎和肺炎等非侵襲性感染，也可導致膿毒症和腦膜炎等侵襲性感染。肺炎鏈球菌可通過病人和攜帶者的呼吸道分泌物傳播，是導致嬰幼兒、兒童和老人發病及死亡的主要原因之一。儘管可利用有效的抗生素治療，但由該菌引起的呼吸系統疾病和侵襲性感染仍然構成重大的公共健康問題。據世界衛生組織(WHO)估計，每年約有數百萬人死於肺炎鏈球菌感染。為保障人類健康，WHO主張接種疫苗來預防肺炎鏈球菌的感染。此外，隨著日益廣泛地使用抗生素，致使肺炎鏈球菌耐藥菌株達96%以上，且呈現多重耐藥性狀況，尤其是對青黴素、頭孢黴素、萬古黴素、大環內酯類和氟奎諾酮類抗生素的耐藥性，已成為全世界關注的嚴重問題之一，給治療帶來了困難。因此，通過免疫接種來預防肺炎鏈球菌的感染變得十分緊迫和重要。莢膜多糖是肺炎鏈球菌的主要致病因子。根據莢膜的組分差異，肺炎鏈球菌可分成約90種血清型，但全球80%以上的感染性疾病是由約20種血清型的肺炎鏈球菌引起的。肺炎鏈球菌的保護性免疫 機制主要是產生針對肺炎莢膜多糖的特異性抗體。目前上市的肺炎莢膜多糖疫苗有4價、13價及23價多糖疫苗。大多數健康成人接種肺炎莢膜多糖疫苗2 3周後，體內針對莢膜多糖的特異性抗體能升高2倍以上。但肺炎莢膜多糖是T細胞非依賴性抗原，2歲以下的兒童由於免疫系統尚未發育成熟，對大多數肺炎莢膜多糖的抗體應答反應較弱，接種劑不能達到抗體保護水平，且產生的抗體很快消失。為解決這一問題，國內外學者轉向對肺炎鏈球菌結合疫苗的研究,並已有7價結合疫苗上市。通過將肺炎莢膜多糖與某種載體蛋白質共價結合，使肺炎莢膜多糖轉化成T細胞依賴性抗原，從而刺激嬰幼兒的T細胞依賴性抗體的合成，並可產生加強應答，同時還能提高免疫球蛋白(IgG)的抗體比例。這種多糖結合疫苗不僅能夠保護嬰幼兒(2歲以下兒童)，還能夠大大地增強抵抗力差的病人(如老人)對肺炎鏈球菌感染的抵抗力，因此具有十分廣闊的應用前景。細菌莢膜多糖-蛋白結合疫苗最早出現在20世紀30年代，Goebel和Avery將3型肺炎球菌多糖連接到馬血清球蛋白上，產生的偶聯物能在動物身上產生多糖專一的抗體，同時提供相應的免疫保護。1987年，世界上第一個多糖蛋白結合疫苗，B型流感嗜血桿菌(HiB)多糖-破傷風類毒素(TT)結合疫苗被美國FDA批准進入市場。默克公司、輝瑞公司、賽諾菲-安萬斯公司和諾華公司相繼開發了 HiB多糖-破傷風類毒素結合疫苗和流行性乙型腦膜炎多糖-破傷風類毒素結合疫苗，並成功上市。目前唯一已上市的肺炎鏈球菌多糖結合疫苗為美國輝瑞公司研製的7價結合疫苗(PCV7，包含4、68、抑、14、18(:、19 和23 型；商品名=Prevenar),已經在70多個國家獲得了批准。PCV7結合疫苗可以幫助抵禦系統和黏膜感染；阻止細菌在鼻咽部增殖，從而降低肺炎鏈球菌的流行。國內的細菌莢膜多糖結合疫苗也在起步當中，如蘭州生物製品研究所、成都生物製品研究所和武漢生物製品研究所等單位在研發細菌莢膜多糖結合疫苗，包括流行性腦膜炎多糖結合疫苗和肺炎多糖結合疫苗。由於技術的限制，這些開發的產品還比較單一，結合工藝也是仿製歐美上世紀80年代的產品，產品缺乏自主智慧財產權。由於結合技術等原因，目前多糖結合疫苗的免疫原性和穩定性還需進一步提高，結合技術尚需進一步的改進和優化。PCV7結合疫苗是用高碘酸鈉氧化肺炎鏈球菌莢膜多糖的鄰位羥基，氧化生成的醛基在還原劑硼氫氰化鈉(NaCNBH3)的作用下與載體蛋白(白喉毒素，CRM197)的氨基發生胺還原反應，生成多糖-蛋白結合物。然而，該結合技術存在著以下不足之處:(1)氧化多糖產生的醛基與載體蛋白的氨基反應時間過長，需要5天以上，而且結合反應的效率較低；(2)某些多糖與載體蛋白的反應 需要在較高的溫度(如37° C)下進行，會影響到多糖與蛋白的結構穩定性；(3)多糖-蛋白結合疫苗的免疫原性有待進一步提高；多糖與載體蛋白的連接橋為甲氨基(-CH2-NH-),由於甲氨基的長度過短，載體蛋白的空間屏蔽作用會遮蔽多糖分子的抗原表位，從而影響其免疫原性。肺炎鏈球菌莢膜多糖與載體蛋白的連接也可用己二酸二醯肼(ADH)為連接劑，這也是一種常用的多糖-蛋白結合技術。首先，需要將多糖的鄰位順式羥基與溴化氰在鹼性條件下反應，生成氰酸酯，然後與ADH反應；氰酸酯與ADH —端的氨基發生加成反應，從而將醯肼基團引入多糖分子中；多糖衍生物在碳二亞胺(EDC)的介導下與載體蛋白形成穩定的結合物。該結合技術存在著以下不足之處:(1)溴化氰的反應活性太強，活化反應不易控制，導致製備工藝的批次穩定性差；(2) EDC在介導ADH衍化多糖與載體蛋白結合的同時，易引起多糖與載體蛋白的自身交聯。這些不足之處會影響多糖結合疫苗的免疫原性和穩定性。點擊化學(click chemistry)是由諾貝爾化學獎獲得者Sharpless教授於2001年首次提出，其中最主要的一類點擊化學反應是由Cu(I)化合物催化疊氮化合物與炔基化合物反應生成1，2，3-三唑五元環化合物。點擊化學能夠將兩種不同物質通過五元環共價結合起來。該方法具備產量高、效率高、副反應少、反應條件溫和、分離提純簡單等優點，因而得到了廣泛的應用。本發明擬提出基於點擊化學的多糖-蛋白結合工藝，並通過延長多糖與蛋白之間的連接橋長度來進一步提高多糖結合疫苗的免疫原性。

發明內容
本發明利用「點擊化學」的原理，在溫和的反應條件下，對活化的肺炎莢膜多糖和載體蛋白(如破傷風類毒素)進行連接，製備肺炎莢膜多糖結合疫苗，提高多糖與載體蛋白的結合效率，增強多糖結合疫苗的免疫原性。本發明以長鏈分子作為連接橋，增大了疫苗分子中肺炎莢膜多糖與載體蛋白的空間距離，減少了載體蛋白對肺炎莢膜多糖抗原表位的空間屏蔽作用，從而提高了結合疫苗的免疫原性。以下是肺炎多糖結合疫苗的製備與純化步驟:I)肺炎莢膜多糖在50mM的醋酸鈉緩衝液(pH4.7)中水解20_60分鐘，水解溫度為60-900C ;優化的條件為水解30分鐘，水解溫度為75°C。
2)將水解產物的pH值調至5.5-6.0，在高碘酸鈉存在的情況下避光反應5_120分鐘；優化的氧化條件為PH值為5.8，避光反應10分鐘；透析除去高碘酸鈉。高碘酸鈉可將肺炎莢膜多糖中的鄰位羥基氧化成醛基。3)在還原劑氰基硼氫化鈉存在的情況下，向氧化的多糖溶液中加入氨基乙炔，多糖與氨基乙炔的質量比為1:(0.5 5);在20-401:反應4-15小時，pH值為7_8;優化的條件為於37°C反應6小時，pH為7.4 ;優化的質量比為1: 2，於37°C下反應6小時，pH值為
7.4。隨後，用超濾膜離心去除反應混合液中的氰基硼氫化鈉及未參與反應的氨基乙炔。4)製備短鏈疊氮化的破傷風類毒素:用疊氮-甲醯琥珀醯亞胺活化破傷風類毒素，其中疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與破傷風類毒素的摩爾比為(5-60):1，活化反應的pH值為
6.0-8.0，反應溫度為2-15小時；優化的活化反應條件為摩爾比為20:1，活化反應的pH值為7.4，於室溫下反應4小時。5)製備長鏈疊氮化的破傷風類毒素:(a)用2-亞氨基硫烷在破傷風類毒素上引入巰基，其中破傷風類毒素與2-亞氨基硫烷反應的摩爾比為1: (10-60)，反應pH值為
6.0-8.0,反應1-24小時，於室溫下反應；優化的反應條件為摩爾比為1:20，反應pH為7.4，反應4小時；(b)疊氮-甲醯琥珀醯亞胺的琥珀醯亞胺基團與N-(2-氨乙基)馬來醯亞胺的氨基基團反應，在疊氮-甲醯琥珀醯亞胺上引入馬來醯亞胺基團，其中疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與N-(2-氨乙基)馬來醯亞胺以摩爾比1: (0.5-4)的比例混合反應，反應pH值為
6.0-8.0,反應0.5-4小時，於室溫下反應；優化的反應條件為摩爾比為1: 1，反應pH為7.4，反應I小時；(c)馬來醯亞胺化的疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與巰基化的破傷風類毒素反應，在破傷風類毒素上引入疊氮基團；其中馬來醯亞胺化的疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與巰基化的破傷風類毒素以摩爾比1: ( 10-60)混合反應，反應pH值為6.0-8.0,反應1_24小時，於室溫下反應；優化的反應條件為摩爾比為1:20,反應pH為7.4,反應4小時。6)在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將乙炔化的肺炎莢膜多糖與疊氮化的破傷風類毒素進行混合，多糖與破傷風類毒素的質量比為(0.5 5):1 ;將溶液pH值調整為
5.5-7.0,於室溫下反應過夜；優化的質量比為2:1，溶液pH為6.0。7)以Superdex200凝膠過濾柱對步驟6得到的結合產物進行純化，洗脫液為20mM的磷酸緩衝液(pH7.4)，收集產物的洗脫液。本發明提供的肺炎莢膜多糖結合疫苗製備工藝，可以帶來以下效果:I)本發明提供的製備工藝，可有效地縮短多糖-蛋白結合反應的時間，將製備周期由傳統方法的5-6天縮短為1-2天。2)本發明提供了引入長鏈連接橋的結合方法，有可效增大結合疫苗中多糖與載體蛋白之間的空間距離，顯著增強了肺炎莢膜多糖的免疫原性。


圖1短鏈肺炎莢膜多糖結合疫苗(S-PCV)的製備反應示意2長鏈肺炎莢膜多糖結合疫苗(L-PCV)的製備反應示意3凝膠過濾分析S-PCV和L-PCV。用分析型凝膠過濾柱Superdex200 (IcmX 30cm)檢測S-PCV和L-PCV。分析條件:流動相為20mM的磷酸緩衝液(pH7.4)，流速0.5毫升/分鐘，檢測波長為280納米。
圖fH-NMR分析S-PCV和L-PCV。1H-NMR分析由fcuker400MHz核磁共振儀完成。圖5L-PCV組和S-PCV組產生的多糖特異性抗體。圖a為多糖特異性的IgM抗體滴度；圖b為多糖特異性的IgG抗體滴度；圖c為多糖特異性的IgGl抗體滴度；圖d為多糖特異性的IgG2a抗體滴度。圖6肺炎莢膜多糖特異性抗體的特異性。
具體實施方案本發明包括兩種肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備、分離純化及其免疫學性質的評價方法。實施例1:短鏈肺炎莢膜多糖結合疫苗(S-PCV)的製備短鏈肺炎莢膜多糖結合疫苗(S-PCV)的製備反應如圖1所示。將5mg肺炎莢膜多糖溶於50mM的醋酸鈉緩衝液(pH4.7)中，於75°C下水解30分鐘。將水解產物的pH值調至
5.8，在高碘酸鈉存在的情況下室溫避光反應10分鐘。透析除去未反應的高碘酸鈉。將預處理後的肺炎莢膜多糖溶液的PH調節到7.4，在氰基硼氫化鈉存在的情況下，以多糖與氨基乙炔質量比以2:1的比例混合反應，37°C反應6小時。使用截留分子量為50kDa的濾膜於5000g下離心3次，除去未反應的氰基硼氫化鈉和氨基乙炔。載體蛋白與疊氮-甲醯琥珀醯亞胺以摩爾比為1:20的比例混合反應，緩衝液為20mM的磷酸緩衝液(pH7.4)，於室溫下反應4小時。此步驟中，疊氮-甲醯琥珀醯亞胺上的琥珀醯亞胺會與載體蛋白上的伯胺發生反應。使用截留分子量為50kDa的濾膜於5000g下離心3次，除去未反應的疊氮-甲醯琥珀醯亞胺。在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將活化肺炎莢膜多糖與活化載體蛋白以質量比2:1混合反應，pH為5.8，室溫反應過夜。實施例2:長鏈肺炎莢膜多糖結合疫苗(L-PCV)的製備長鏈肺炎莢膜多糖結合疫苗(L-PCV)的製備反應如圖2所示。將5mg肺炎莢膜多糖溶於50mM的醋酸鈉緩衝液(pH4.7)中，於75°C下水解30分鐘。將水解產物的pH值調至
5.8，在高碘酸鈉存在的情況下於室溫避光反應10分鐘。透析除去未反應的高碘酸鈉。將預處理後的肺炎莢膜多糖溶液PH調節到7.4，在氰基硼氫化鈉存在的情況下，以多糖與氨基乙炔質量比以2:1的比例混合反應，37°C反應6小時。使用截留分子量為50kDa的濾膜於5000g下離心3次，除去未反應的氰基硼氫化鈉和氨基乙炔。載體蛋白與2-亞氨基硫烷以摩爾比1:20混合反應，緩衝液為20mM的磷酸緩衝液(pH7.4)，於室溫下反應4小時，使用截留分子量為50kDa的濾膜於5000g下離心3次，除去未反應的2-亞氨基硫烷。疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與N-(2-氨乙基)馬來醯亞胺以摩爾比1:1的比例混合反應生成長鏈分子 ，溶液的pH值為7.4，室溫反應I小時。載體蛋白與生成的長鏈分子以摩爾比1:20混合反應，溶液的pH值為7.4，於室溫下反應4小時。使用截留分子量為50kDa的濾膜於5000g下離心3次，除去未反應的化學試劑。在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將活化肺炎莢膜多糖與活化載體蛋白以質量比2:1混合反應，pH為5.8，室溫反應過夜。實施例3 =L-PCV和S-PCV的純化與表徵將實施例1和2中所涉及的結合產物,用Superdex200凝膠過濾柱(2.6cmX 60cm)進行分離純化，洗脫液為20mM的磷酸緩衝液(pH7.4)，流速為3毫升/分鐘。分別收集對應於L-PCV和S-PCV的洗脫峰。以Superdex200凝膠過濾柱(1.0cmX 30cm)對純化產品進行鑑定，洗脫液為20mM的磷酸緩衝液(PH7.4)，流速為0.5毫升/分鐘。如圖3所示，與載體蛋白相比，L-PCV和S-PCV的出峰時間明顯提前。這表明載體蛋白與肺炎莢膜多糖結合後，分子量顯著增加。用1H-NMR進行檢測L-PCV和S-PCV。如圖4所示，與肺炎多糖分子相比，S-PCV在0-1.0ppm處出現了蛋白的特徵峰,在5.0-5.5ppm處出現了含有C=C鍵的五元雜環特徵峰。這表明肺炎多糖分子通過點擊化學成功地偶聯了載體蛋白。與S-PCV相比，L-PCV在7.1ppm處出現了琥珀醯亞胺的特徵峰，這表明L-PCV的連接橋中含有琥珀醯亞胺。這進一步說明L-PCV的連接橋分子要大於S-PCV的連接橋。實施例4 =L-PCV和S-PCV的免疫原性測定選取15隻5周齡的雌性Blab/C小鼠，體重為15_22克。隨機分為3組，即肺炎莢膜多糖組、L-PCV組和S-PCV組。腹腔注射，每隻每次注射含有5微克多糖，每周注射I次，共注射3次。21天後眼眶取血。用ELISA法檢測小鼠血漿中抗肺炎莢膜多糖的IgM、IgG、IgGl和IgG2a。如圖5所示，與肺炎莢膜多糖組進行比較，S-PCV組的抗體滴度提高明顯，其中IgM、IgG、IgGl和IgG2a的抗體滴度分別是多糖組的9倍、577倍、457倍和100倍。L-PCV組的抗體滴度要顯著高於S-PCV組，其中IgM、IgG、IgGl和IgG2a的抗體滴度分別分別是S-PCV組的1.4倍、1.3倍、1.4倍和1.4倍。實施例5:肺炎莢膜多糖特異性抗體的特異性和親合性向200倍稀釋的L-PCV組和S-PCV組小鼠血漿中加入不同量的肺炎莢膜多糖，用ELISA方法檢測小鼠血漿中抗肺炎莢膜多糖的抗體水平。如圖6所示，隨著多糖加入量的增力口，多糖特異性抗體結合 96孔板中多糖的能力逐漸降低。當加入的多糖達到150 μ g時,抗體結合多糖的能力喪失。這表明小鼠產生的抗體能夠特異性地結合肺炎莢膜多糖。用硫氰酸銨法測定抗肺炎莢膜多糖的抗體親合性。肺炎莢膜多糖組的多糖特異性抗體親和指數為1.43mol/L,而L-PCV組和S-PCV組的抗體親和指數分別為3.90mol/L和
3.67mol/Lo這表明結合載體蛋白能顯著提高多糖特異性抗體的親合性,而長鏈連接橋能進一步提高多糖特異性抗體的親合性。
權利要求
1.一種肺炎莢膜多糖結合疫苗，以共價鍵的方式將肺炎莢膜多糖連接到載體蛋白上，可用於預防肺炎鏈球菌的感染。
2.如權利要 求1所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗，所述的載體蛋白為破傷風類毒素。
3.權利要求1所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，製備的步驟包括:(1)肺炎莢膜多糖在酸性條件下水解；(2)由高碘酸鈉氧化肺炎莢膜多糖，多糖中的鄰位羥基氧化成醛基；(3)向氧化的肺炎莢膜多糖引入乙炔基團；(4)向破傷風類毒素引入疊氮基團；(5)將乙炔化的肺炎莢膜多糖與疊氮化的破傷風類毒素進行結合反應。
4.如權利要求3所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，肺炎莢膜多糖在50mM的醋酸鈉緩衝液(pH4.7)中水解20-60分鐘，水解溫度為60_90°C;優化的條件為水解30分鐘，水解溫度為75°C。
5.如權利要求3所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，高碘酸鈉氧化肺炎莢膜多糖的PH值為5.5-6.0，避光反應5-120分鐘；優化的氧化條件為pH值為5.8，避光反應10分鐘。
6.如權利要求3所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，由結構式為H2N-R-C = CH的試劑來衍化高碘酸鈉氧化的肺炎莢膜多糖，同時引入乙炔基團。其中，R是碳數在0-20之間的烷基；優化的試劑為氨基乙炔。
7.如權利要求6所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，氨基乙炔衍化高碘酸鈉氧化的肺炎莢膜多糖的反應條件為:在氰基硼氫化鈉存在的情況下，氧化的多糖與氨基乙炔在20-40°C反應4-15小時，pH為7-8 ;優化的條件為於37°C反應6小時，pH為 7.4。
8.如權利要求6所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，氨基乙炔衍化高碘酸鈉氧化的肺炎莢膜多糖過程氧化的多糖與氨基乙炔的質量比為1: (0.5 5);優化的質量比為1:2。
9.如權利要求3所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，用疊氮-甲醯琥珀醯亞胺活化破傷風類毒素，同時引入疊氮基團。
10.如權利要求9所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與破傷風類毒素的摩爾比為(5-60):1，活化反應的pH值為6.0-8.0,反應溫度為2-15小時；優化的活化反應條件為摩爾比為20:1,活化反應的pH值為7.4,於室溫下反應4小時。
11.如權利要求3所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，(I)用2-亞氨基硫烷在破傷風類毒素上引入巰基，(2)疊氮-甲醯琥珀醯亞胺的琥珀醯亞胺基團與N-(2-氨乙基)馬來醯亞胺的氨基基團反應，在疊氮-甲醯琥珀醯亞胺上引入馬來醯亞胺基團，(3)馬來醯亞胺化的疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與巰基化的破傷風類毒素反應，在破傷風類毒素上引入疊氮基團。
12.如權利要求11所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，破傷風類毒素與2-亞氨基硫燒反應的摩爾比為1: (10-60),反應pH值為6.0-8.0,反應1_24小時，於室溫下反應；優化的反應條件為摩爾比為1:20,反應pH為7.4,反應4小時。
13.如權利要求11所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與N-(2-氨乙基)馬來醯亞胺以摩爾比1: (0.5-4)的比例混合反應，反應pH值為6.0-8.0，反應0.5-4小時，於室溫下反應；優化的反應條件為摩爾比為1: 1，反應pH為7.4，反應I小時。
14.如權利要求11所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，馬來醯亞胺化的疊氮-甲醯琥珀醯亞胺與巰基化的破傷風類毒素以摩爾比1: (10-60)混合反應，反應PH值為6.0-8.0,反應1-24小時，於室溫下反應；優化的反應條件為摩爾比為1:20，反應pH為7.4，反應4小時。
15.如權利要求3所述的肺炎莢膜多糖結合疫苗的製備方法，其特徵在於，在CuSO4和抗壞血酸存在的情況下，將乙炔化的肺炎莢膜多糖與疊氮化的載體蛋白以質量比(0.5 5):1混合反應；優化的質量比為2:1。
16.如權利要 求1所 述的肺炎莢膜多糖結合疫苗製劑是注射劑型。
全文摘要
本發明利用「點擊化學」的方法，將肺炎莢膜多糖以共價鍵的方式連接到破傷風類毒素上，製備出可用於預防肺炎鏈球菌感染的多糖結合疫苗。通過延長肺炎莢膜多糖與破傷風類毒素之間連接橋的長度，提高多糖結合疫苗的免疫原性。
文檔編號A61K47/48GK103110940SQ20131004750
公開日2013年5月22日 申請日期2013年2月6日 優先權日2013年2月6日
發明者胡濤, 安文琪, 蘇志國, 範蓓, 吳鼎龍, 馬小偉, 潘若文 申請人:中國科學院過程工程研究所, 華蘭生物工程股份有限公司, 華蘭生物疫苗有限公司