一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法

2023-06-06 00:56:41

一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，包括以下步驟：（1）製備載體蛋白溶液；（2）將載體蛋白溶液和橋聯劑溶液混合併4℃避光攪拌30分鐘；（3）用0.01M磷酸鹽緩衝液透析或者超濾除去載體蛋白溶液和橋聯劑溶液混合液中游離的橋聯劑，得到活化後的載體蛋白溶液；（4）抗原溶液緩慢滴入活化後的載體蛋白溶液中，4℃攪拌20小時以上，經透析、脫鹽或者超濾除去游離抗原，得偶聯物，對偶聯物進行還原。本發明提供了一種製備方法簡單、生產周期短，生產成本低的4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，解決了有機磷類物質是小分子結構，不具備免疫原性，激發不了動物免疫反應產生抗體的問題。
【專利說明】一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於免疫學【技術領域】，具體的是一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法。
【背景技術】
[0002]有機磷農藥屬有機磷酸酯類的一組化合物，是目前廣泛應用於防治糧、棉、水果及蔬菜蟲害的農藥。對人畜具有毒性，在生產和使用過程中不注意防護，可引起中毒。雖然與已禁用的有機氯農藥相比其在環境中降解快，殘毒低，但由於使用量大，加上違章非正常操作，不僅糧食、蔬菜農藥殘留問題日漸突出，在生產和使用這些農藥的過程中殘留的農藥會將汙染延伸到環境水體中，對地表水、地下水造成汙染。目前有機磷農藥殘留檢測方法主要有兩大類——色譜檢測法和快速檢測法。色譜檢測法是目前農藥殘留主要的檢測方法，包括氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細管電泳法、薄層色譜法。其特點是檢測時間稍長，但檢測精度高，可為農藥殘留執法提供依據。農藥殘留快速檢測法是一類快速檢測農藥殘留的方法，包括免疫分析技術、酶抑制法等。
[0003]有機磷的免疫法檢測不僅方法簡便，成本低廉，而且靈敏度高。但建立高效的免疫法檢測需要高品質的抗原和抗體。但是，有機磷類化合物均是小分子，不具備免疫原性，不能直接產生抗體。因此，需要一種簡單可靠的方法，合成一種能夠激發動物產生抗體的完全抗原。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是為了解決上述`技術問題，提供一種製備方法簡單、生產周期短，生產成本低的用於有機磷抗體製備和免疫學檢測的完全抗原。
[0005]本發明是在分析了大量常用的有機磷農藥結構的情況下，應用4-氨基苄基磷酸二乙酯(DAP)作為半抗原，製備完全抗原。其特點是具備大部分有機磷的共同結構，並且結構相對複雜。採用戊二醛作為橋聯劑，將4-氨基苄基磷酸二乙酯(DAP)通過五個碳的橋與載體蛋白連接，從而使半抗原完全暴露在載體蛋白的表面，有利於抗體的識別，免疫原性得到增強，有利於動物產生抗體。
[0006]本發明提供的技術方案是:
[0007]—種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，包括以下步驟:
[0008](I)將4-氨基苄基磷酸二乙酯溶於去離子水製備抗原溶液，戊二醛溶於去離子水製備橋聯劑溶液，載體蛋白溶於PH9.6的0.05M碳酸鹽緩衝液製備載體蛋白溶液；
[0009](2)將載體蛋白溶液和橋聯劑溶液混合併4°C避光攪拌30分鐘；
[0010](3)用0.01M磷酸鹽緩衝液透析或者超濾除去載體蛋白溶液和橋聯劑溶液混合液中游離的橋聯劑，得到活化後的載體蛋白溶液；
[0011](4)抗原溶液緩慢滴入活化後的載體蛋白溶液中，4°C攪拌20小時以上，經透析、脫鹽或者超濾除去游離抗原，得偶聯物；[0012](5 )加NaBH4溶液還原偶聯物。
[0013]進一步，步驟(1)中，所述載體為含有游離氨基的蛋白大分子。
[0014]進一步，所述的蛋白大分子為牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍蛋白。
[0015]進一步，所述步驟(1)中，所述抗原溶液濃度為lOmmol/L，載體蛋白溶液濃度為0.5mmol/L,橋聯劑溶液濃度為50mmol/L。
[0016]進一步，所述步驟(2)中按照血管緊張素與載體蛋白摩爾比10-20:1的比例。
[0017]採用紫外分光光度計對載體蛋白、未偶聯小分子、偶聯物在200_500nm之間進行掃描，在同坐標下進行圖形比對，在偶聯物和載體蛋白對照濃度相同的情況下，如果偶聯物的特徵峰與載體蛋白特徵峰及實驗對照組特徵峰相比發生明顯偏移，說明偶聯成功。
[0018]實驗對照組按照上述步驟(1) - (5)製備，只是不添加抗原溶液。 [0019]戊二醛法原理:戊二醛是一種常用交聯劑，兩端的醛基均可與伯氨基縮合。本方法就是利用其交聯劑的特性，將4-氨基苄基磷酸二乙酯(DAP)的氨基及載體蛋白中的伯氨基交聯在一起。本發明的優點是提供一種製備方法簡單、生產周期短，生產成本低的用於4-氨基苄基磷酸二乙酯抗體製備和免疫學檢測的完全抗原，直接應用於免疫檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0020]圖1是偶聯物通過分光光度計掃描鑑定圖【具體實施方式】:
[0021]實施例1 4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA偶聯
[0022](I)將4-氨基苄基磷酸二乙酯溶於去離子水製備抗原溶液，載體蛋白BSA溶於去離子水製備載體蛋白溶液，戊二醛溶於去離子水製備催化溶液，4-氨基苄基磷酸二乙酯抗原溶液為 IOmmoI/L (即 3.37mg/ml)，載體蛋白 BSA 溶液為 0.5mmol/L (即 33mg/ml)B，戊二醛溶液為 20mmol/L (即 3.82mg/ml)；
[0023](2)將戊二醛溶液和載體蛋白BSA4°C避光攪拌30分鐘，4_氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA的摩爾比為20:1 ;
[0024](3)用0.01M磷酸鹽緩衝液透析除去4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白BSA混合液中游離的戊二醛，得到活化後的載體蛋白BSA溶液；
[0025](4)抗原溶液緩慢滴入活化後的載體蛋白溶液中，4°C攪拌22小時，經透析除去游離抗原，得偶聯物；
[0026](5 )加NaBH4溶液還原偶聯物。
[0027]按照步驟(1) (2) (3) (4) (5)的方法，不需要4-氨基苄基磷酸二乙酯製備抗原溶液，維持其他各反應條件不變，製備實驗對照樣品。
[0028]採用紫外分光光度計對載體蛋白、未偶聯小分子、偶聯物在200_500nm之間進行掃描，在同坐標下進行圖形比對，在偶聯物和載體蛋白對照濃度相同的情況下，如果偶聯物的特徵峰與載體蛋白特徵峰及實驗對照樣品特徵峰相比發生明顯偏移，說明偶聯成功。
[0029]實施例2 4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白卵清蛋白偶聯
[0030](I)將4-氨基苄基磷酸二乙酯溶於去離子水製備抗原溶液，載體蛋白卵清蛋白溶於去離子水製備載體蛋白溶液，戊二醛溶於去離子水製備催化溶液，4-氨基苄基磷酸二乙酯抗原溶液為10mmol/L (即3.37mg/ml),載體蛋白卵清蛋白溶液為0.5mmol/L (即33mg/ml) B，戊二醛溶液為 20mmol/L (即 3.82mg/ml)；
[0031](2)將戊二醛溶液和載體蛋白卵清蛋白4°C避光攪拌30分鐘，4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白卵清蛋白的摩爾比為15:1 ;
[0032](3)用0.01M磷酸鹽緩衝液超濾除去4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白卵清蛋白混合液中游離的戊二醛，得到活化後的載體蛋白卵清蛋白溶液；
[0033](4)抗原溶液緩慢滴入活化後的載體蛋白卵清蛋白溶液中，4°C攪拌24小時，經透析除去游離抗原，得偶聯物；
[0034](5 )加NaBH4溶液還原偶聯物。
[0035]按照步驟(1) (2) (3) (4) (5)的方法，不需要4-氨基苄基磷酸二乙酯製備抗原溶液，維持其他各反應條件不變，製備實驗對照樣品。
[0036]採用紫外分光光度計對載體蛋白、未偶聯小分子、偶聯物在200_500nm之間進行掃描，在同坐標下進行圖形比對，在偶聯物和載體蛋白對照濃度相同的情況下，如果偶聯物的特徵峰與載體蛋白特徵峰及實驗對照樣品特徵峰相比發生明顯偏移，說明偶聯成功。
[0037]實施例3 4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白鑰孔血藍蛋白偶聯
[0038](I)將4-氨基苄基磷酸二乙酯溶於去離子水製備抗原溶液，載體蛋白鑰孔血藍蛋白溶於去離子水製備載體蛋 白溶液，戊二醛溶於去離子水製備催化溶液，4-氨基苄基磷酸二乙酯抗原溶液為10mmol/L(即3.37mg/ml),載體蛋白鑰孔血藍蛋白溶液為0.5mmol/L(即33mg/ml) B,戍二醒溶液為 20mmol/L (即 3.82mg/ml)；
[0039](2)將戊二醛溶液和載體蛋白鑰孔血藍蛋白4°C避光攪拌30分鐘，4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白鑰孔血藍蛋白的摩爾比為10:1 ；
[0040](3)用0.01M磷酸鹽緩衝液超濾除去4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白鑰孔血藍蛋白混合液中游離的戊二醛，得到活化後的載體蛋白鑰孔血藍蛋白溶液；
[0041](4)抗原溶液緩慢滴入活化後的載體蛋白卵清蛋白溶液中，4°C攪拌28小時，經脫鹽除去游離抗原，得偶聯物；
[0042](5 )加NaBH4溶液還原偶聯物。
[0043]按照步驟(1) (2) (3) (4) (5)的方法，不需要4-氨基苄基磷酸二乙酯製備抗原溶液，維持其他各反應條件不變，製備實驗對照樣品。
[0044]採用紫外分光光度計對載體蛋白、未偶聯小分子、偶聯物在200_500nm之間進行掃描，在同坐標下進行圖形比對，在偶聯物和載體蛋白對照濃度相同的情況下，如果偶聯物的特徵峰與載體蛋白特徵峰及實驗對照樣品特徵峰相比發生明顯偏移，說明偶聯成功。
【權利要求】
1.一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)將4-氨基苄基磷酸二乙酯溶於去離子水製備抗原溶液，戊二醛溶於去離子水製備橋聯劑溶液，載體蛋白溶於PH9.6的0.05M碳酸鹽緩衝液製備載體蛋白溶液； (2)將載體蛋白溶液和橋聯劑溶液混合併4°C避光攪拌30分鐘； (3)用0.01M磷酸鹽緩衝液透析或者超濾除去載體蛋白溶液和橋聯劑溶液混合液中游離的橋聯劑，得到活化後的載體蛋白溶液； (4)抗原溶液緩慢滴入活化後的載體蛋白溶液中，4°C攪拌20小時以上，經透析、脫鹽或者超濾除去游離抗原，得偶聯物； (5)加NaBH4溶液還原偶聯物。
2.根據權利要 求1所述的一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述載體為含有游離氨基的蛋白大分子。
3.根據權利要求1所述的一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，其特徵在於，所述的蛋白大分子為牛血清白蛋白或者卵清蛋白或者牛丙種球蛋白或者鑰孔血藍蛋白。
4.根據權利要求1所述的一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，其特徵在於，所述步驟(1)中，所述抗原溶液濃度為lOmmol/L，載體蛋白溶液濃度為0.5mmol/L載體蛋白溶液，橋聯劑溶液溶液濃度為50mmol/L。
5.根據權利要求1所述的一種4-氨基苄基磷酸二乙酯完全抗原的製備方法，其特徵在於，所述步驟(2)中按照4-氨基苄基磷酸二乙酯與載體蛋白摩爾比10-20:1的比例。
【文檔編號】C07K14/47GK103613659SQ201310606470
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月25日 優先權日:2013年11月25日
【發明者】張振斌, 侯玉文, 田雲霞, 李克錦, 劉萍, 欒大偉 申請人:博奧賽斯（天津）生物科技有限公司