檢測人巨細胞病毒或其啟動子的螢光絕對定量pcr試劑盒的製作方法

2023-06-06 04:19:16 1

專利名稱：檢測人巨細胞病毒或其啟動子的螢光絕對定量pcr試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測試劑盒，尤其涉及一種檢測人巨細胞病毒啟動子或檢測含人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品的螢光定量PCR試劑盒，屬於人巨細胞病毒或其啟動子的檢測領域。
背景技術：
人類巨細胞病毒(human cytomegalovirus, HCMV)的感染對人類健康造成嚴重威脅。HCMV幾乎可以感染所有器官，它的感染一方面使細胞吞噬溶解功能、抗原呈遞功能、分泌抗病毒細胞因子和調節因子的功能顯著降低；另一方面通過抑制Th功能或下調感染細胞MHC-1類抗原表達，使被感染個體免疫功能下降。在感染發生過程中極早期啟動子(major immediate early enhancer/promoter, MIEP)是病毒和宿主細胞發生相互作用的通信接口。人巨細胞病毒啟動子能指導基因 在大多數的體外培養細胞中瞬時/穩定表達，是啟動真核基因表達的強力啟動子，該啟動子參與構建的高效真核表達載體廣泛應用於基因治療產品和DNA疫苗的製備。
人巨細胞病毒感染廣泛存在、發病率高、危害大，尤其對於孕產婦、嬰幼兒以及器官移植患者。對於HCMV感染患者就需要早診斷、早治療，方法選擇顯得很重要。此外，也需要一種特異性強、靈敏度高的定量檢測方法用於人巨細胞病毒(HCMV)基因疫苗的研製及其預防和治療HCMV原發和再發感染效果的評價。
病毒分離為最準確方法，是金標準。但耗時長，技術要求高，不適合臨床推廣。血清學檢測雖然簡便，但不適於早期檢測及對HCMV感染狀況的評價。以螢光標記探針為基礎的實時螢光定量PCR技術，在目前國內的臨床診斷中應用最為廣泛。在探針法的實時螢光定量PCR反應體系中往往包括一對或多對特異性PCR引物及探針，通過研發過程中的條件摸索，探針及引物只與相對應的模板特異性地結合，其結合位點在兩條引物之間。探針的5 ^端標記有報告基團(Reporter，R)，如FAM、VIC、ROX等，3'端標記有螢光淬滅基團(Quencher, Q)，如BHQ1、BHQ2、TAMRA等。當探針完整的時候，報告基團所發射的螢光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結合的探針，其外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產生螢光信號。所以，每經過一個PCR循環，螢光信號也和目的片段一樣，有一個同步指數增長的過程。
迄今為止，用於檢測人巨細胞病毒或含有人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品的螢光定量PCR試劑盒均不同程度的存在特異性差、靈敏度低、檢測線性範圍較窄等缺陷，有待改進。發明內容
本發明的主要目的是提供一種能夠準確的檢測人巨細胞病毒或檢測含有人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品的螢光定量PCR試劑盒，該檢測試劑盒具有特異性強、靈敏度高、檢測線性範圍廣等優點。
本發明的主要目的是通過以下技術方案來實現的:
—種檢測人巨細胞病毒或檢測含有人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品的螢光定量PCR試劑盒，包括以下各組分:螢光聚合酶鏈式反應液，特異性引物對，螢光標記的探針和雙蒸水；所述的特異性引物對由SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物組成；所述的探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。
其中，在探針的5'端標記有螢光報告基團，所述的螢光報告基團是FAM、HEX或ROX螢光報告基團，優選為FAM螢光報告基團；在探針的3'端標記有螢光淬滅基團；所述的螢光淬滅基團可以是TAMRA、BHQ1或BHQ2等螢光淬滅基團，優選為TAMRA螢光淬滅基團。
其中，所述的螢光聚合酶鏈式反應液包括:Taq DNA聚合酶、PCR緩衝液、Mg2+、dNTPs ；
為了得到絕對定量結果，所述的試劑盒中還包含有人巨細胞病毒啟動子質粒標準品。所述人巨細胞病毒啟動子質粒標準品可通過商業途徑購買得到，也可參照以下方法構建得到:在PUC57質粒的Sam I酶切位點插入SEQ ID N0.4所示的基因片段，即得。
本發明試劑盒中各組分的用量可根據待檢測樣品的數量以及每次螢光定量PCR反應所需的用量來確定或進行相應的調整，這些都是本領域所屬技術人員視檢測情況或實際需要很容易就能確定的參數。
作為參考，採用本發明螢光定量PCR試劑盒檢測人巨細胞病毒或含有人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品的PCR反應條件和PCR反應體系如下:
PCR反應體系:總體積25 μ 1，上/下遊引物260nmol/L，探針IOOnmoI/L, 5XPCR緩衝液5 μ 1，dNTP200 μ mol/L, Mg2+3mmol/L, Ex Taq HS聚合酶1.5U，待檢測的樣品模板1.5 μ I,滅菌水 16 μ I。
PCR 擴增條件:94°C 3min ；94°C 30s, 60°C lmin,40 個循環。
本發明試劑盒可採用各種市售的螢光定量PCR儀進行分析和檢測，所述的螢光定量 PCR 儀可以是 ABI 系列螢光定量 PCR 儀、B10RADiCycler、Roche4800、Qiagen Rotor Gene坐寸ο
本發明試劑盒對檢測樣本的要求:
檢測樣本來源:人外周血中DNA，動物血液和組織臟器中DNA或基因治療產品中的DNA。
樣本製備:
1、人血液中DNA的提取、動物組織臟器中DNA的提取以及基因治療產品中的DNA的提取可以按照市售DNA提取試劑盒說明書操作，也可以按照以下提供的方法操作。
2、稱取約25mg左右的組織臟器，去除結締組織，用剪刀剪成細小碎塊。加10倍體積 DNA 提取緩衝液[50mM Tris Cl (ρΗ8.0)，0.IM EDTA (ρΗ8.0)，0.IM NaCl]，用超聲勻漿儀進行勻漿。取200 μ I勻漿液於2ml的Eppendorf管中，緩慢加入20% SDS溶液，至終濃度I%，搖勻直至溶液變粘稠。再加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2-3h或過夜。並間歇攪動。或取200 μ I EDTA抗凝的全血或基因治療產品，加入5μ I蛋白酶K，55°C消化2_3h或過夜。
3、取出勻漿液，放置室溫，加入50 μ 15Μ的NaCl至終濃度為1Μ。再加等體積飽和酌.抽提，以12, OOOrpm離心5min。
4、取上清加1/2體積飽和酚，1/2體積氯仿/異戊醇抽提一次，以12，OOOrpm離心5min。
5、取上清,加等體積氯仿/異戍醇抽提一次，12，OOOrpm離心5min。
6、加1/10體積3M NaAcJ^ 2倍體積無水乙醇充分混勻，出現絮狀沉澱，把液體連同沉澱一,決轉移到吸附柱中，12，OOOrpm離心5min,棄廢液。
7、加 1111170% 乙醇漂洗，以 12，OOOrpm 離心 5min。
8、室溫放置乾燥吸附柱後，加100 μ I TE溶解(60°C _70°C預熱)，室溫放置IOmin後 12，OOOrpm 離心 30sec。-20°C|C存備用。
採用本發明試劑盒對檢測樣品進行定量分析的方法可參考以下步驟:
1、質粒標準品濃度計算:當OD26tl= I時，相當於雙鏈的DNA濃度為50ng/y 1，然後根據計算公式:DNA濃度(ng/ μ I) = 50 X OD260 X稀釋倍數,計算質粒標準品濃度。
2、待測樣品定量:在每次測定中，用質粒標準品作標準曲線，待測樣本中所得Ct值對應標準曲線中的拷貝數，即為所測拷貝數。
本發明設計了針對CMV啟動子序列的特異性引物和探針，構建了實時螢光定量PCR檢測試劑盒，具有 特異性強，靈敏度高，重複性好，檢測線性範圍廣等特點，可以用於人巨細胞病毒感染的診斷，監測，也可以應用含CMV啟動子的基因治療產品的通用定量檢測。


圖lpUC57質粒圖譜及酶切位點。
圖2採用本發明特異性引物擴增質粒標準品擴增產物的熔解曲線圖；圖中橫坐標為溫度(Temperature°C ),縱坐標為校正後的突光值(Derivative)。
圖3其它引物擴增質粒標準品擴增產物的熔解曲線圖。A、B、C、D、E分別是mixl、mix2、mix3、mix4、mix5的熔解曲線圖，圖中橫坐標為溫度(Temperature°C )，縱坐標為校正後的突光值(Derivative)。
圖4本發明螢光定量PCR試劑盒的特異性實驗結果。
圖5本發明螢光定量PCR試劑盒的定量限和靈敏度檢測結果；a，b，c, d，e, f，g，h分別是Xio7，XlO6, XlO5, XlO4, XlO3, XlO2的質粒標準品系列稀釋濃度、正常小鼠組織陰性對照和無模板對照(NTC)。
圖6引物濃度優化實驗結果。
圖7探針濃度優化實驗結果。
圖8Ex Taq HS聚合酶濃度優化實驗結果。
圖9Mg2+濃度優化實驗結果。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
實施例1質粒標準品的構建及鑑定
1.1質粒標準品構建
在PUC57質粒(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)的Sam I酶切位點插入了長度為107bp的包含有上下遊引物片段的基因片段(5』CAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCA3』，SEQ ID N0.4)。成功構建質粒標準品，pUC57質粒的示意圖見圖1。
1.2測序鑑定
對質粒pUC57進行酶切，對酶切產物進行序列測定，成功構建質粒標準品。
實施例2特異性引物和探針的設計及製備
針對CMV啟動子反義核酸序列設計的上遊引物(FP)和下遊引物(RP):
FP:5/ AGACTTGGAAATCCCCGTGAGT3' (SEQ ID N0.1)
RP:5/ CGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGT3' (SEQ ID N0.2)
探針:5'AACCGCTATCCACGCCCATTGATG3' (SEQ ID N0.3)
探針Y端報告基團用FAM標記，3 ^端淬滅基團用TAMRA標記。
擴增產物長度為93bp。引物和探針均配製成100 μ mol/L貯存液，使用前用滅菌注射用水10倍稀釋。
特異引物對(SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示)對質粒標準品的特異性鑑定
SYBR Green I熔解曲線結果見圖2。結果顯示,質粒模板(Template)在80_85°C有一特異性的產物峰，沒有出現雙峰或峰的異常增寬。無模板對照(NTC)有一引物二聚體峰，正常小鼠肝基因組(Normal liver)沒有出現非特異擴增峰。實驗結果說明本發明所設計的引物組(SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2)對質粒標準品擴增具有較好的特異性。
此外，本發明針對CMV啟動子反義核酸序列設計了另外5對上下遊引物和探針序列，見表I。
表I針對CMV反義鏈序列設計的5對引物和探針序列
權利要求
1.一種檢測人巨細胞病毒或檢測含人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於，包括以下各組分:螢光聚合酶鏈式反應液，特異性引物對，螢光標記的探針和雙蒸水。
2.按照權利要求1所述的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:所述特異性引物對由SEQID N0.1和SEQ ID N0.2所示的引物組成；所述探針的核苷酸序列為SEQ ID N0.3所示。
3.按照權利要求2所述的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:在探針的5'端標記有螢光報告基團；在探針的3'端標記有螢光淬滅基團。
4.按照權利要求3所述的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:所述的螢光報告基團包括FAM、HEX或ROX螢光報告基團；所述的螢光淬滅基團包括TAMRA、BHQ1或BHQ2螢光淬滅基團。
5.按照權利要求4所述的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:所述的螢光報告基團是FAM螢光報告基團；所述的螢光淬滅基團是TAMRA螢光淬滅基團。
6.按照權利要求1所述的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:所述的螢光聚合酶鏈式反應液包括=Taq DNA聚合酶、PCR緩衝液、Mg2+、dNTPs。
7.按照權利要求1所述的螢光定量PCR試劑盒，其特徵在於:含有人巨細胞病毒啟動子陽性質粒標準品。
8.權利要求1-7任何一項所述的螢光定量PCR試劑盒在製備檢測人巨細胞病毒試劑中的用途。
9.權利要求1-7任何一項所述的螢光定量PCR試劑盒在檢測含人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品中的應用。
10.按照權利要求9所述的應用，其特徵在於，包括:(I)建立PCR反應體系；(2)進行PCR擴增；(3)進行定性或定量分析；其中步驟⑴中所述的PCR反應體系為:總體積.25 μ 1，上 / 下遊引物 260nmol/L，探針 100nmol/L，5XPCR 緩衝液 5 μ 1，dNTP200 μ mol/L,Mg2+3mmol/L,Ex Taq HS聚合酶1.5U，待檢測的樣品模板1.5 μ 1，滅菌水16 μ I ;所述上/下遊引物的序列 分別 為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
全文摘要
本發明公開了一種檢測人巨細胞病毒或含人巨細胞病毒啟動子的基因治療產品的螢光絕對定量PCR試劑盒。所述試劑盒包括以下組分螢光聚合酶鏈式反應液，特異性引物對，螢光標記的探針和雙蒸水。所述特異性引物對由SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物組成；所述探針的核苷酸序列為SEQ ID No.3所示。本發明設計了針對CMV啟動子序列的特異性引物和探針，構建了實時螢光定量PCR檢測試劑盒，具有特異性強，靈敏度高，重複性好，檢測線性範圍廣等特點，可以用於人巨細胞病毒感染的診斷，監測，也可以應用含CMV啟動子的基因治療產品的通用定量檢測。
文檔編號C12Q1/70GK103215376SQ20131007065
公開日2013年7月24日 申請日期2013年3月6日 優先權日2013年3月6日
發明者苗玉發, 李波, 沈連忠 申請人:中國食品藥品檢定研究院