雲杉毛蟲dna複製原點識別蛋白第六亞基基因及其應用的製作方法

2023-06-25 23:45:56 1

專利名稱：雲杉毛蟲dna複製原點識別蛋白第六亞基基因及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及昆蟲基因工程技術領域，特別是涉及一種雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基(CfORC6)基因及其應用。
二、技術背景雲杉毛蟲(Choristoneura fumiferana)是一種重要的森林害蟲，能被雲杉毛蟲核型多角體病毒(CfMNPV)特異感染致死，但需要較長的時間。由於某些宿主蛋白和病毒蛋白在病毒感染宿主細胞時可能與病毒DNA複製相關，並且可能與病毒的毒力及宿主域有關。DNA複製是個嚴格控制的細胞過程，與細胞周期的其它環節密切協調。真核生物DNA複製研究是國際上非常活躍的前沿領域。複製原點識別蛋白第六亞基(ORC6)參與真核生物DNA複製，與細胞有絲分裂有關。在人、果蠅、酵母菌及雲杉毛蟲細胞中都有ORC6的同源蛋白。在雲杉毛蟲的部分基因組EST已被測定出來的基礎上，我們以果蠅的ORC為探針進行BLAST搜索時得到了包含DmORC6的同源序列的cDNA質粒，即CfORC6，利用RT-PCR方法獲得並保存了該基因的菌種。CfORC6是繼酵母(ScORC6，美國加州大學，1993)，果蠅(DmORC6，美國冷泉港實驗室，2000)及人的ORC6(HsORC6，美國哈府醫學院，2000)之後新鑑定的DNA複製原點識別蛋白第六亞基，其特證在於，CfORC6與DmORC6和HsORC6具有約30％同源性，與ScORC6無同源性；在原核中表達的分子大小與預測一致，分子量與ScORC6大小相似，是DmORC6和HsORC6的1.6～1.7倍，即CfORC6分子量與SCORC6相似，與DmORC6和HsORC6卻差異懸殊，但與DmORC6和HsORC6的同源性高。Southern blot證明CfORC6為單拷貝基因，但Northern blot表明其轉錄信號卻比同是單拷貝基因的Hsp90弱得多，這些特別之處與CfORC6的分子功能有關。重組杆狀病毒殺蟲劑一般採用Bt基因、蠍毒基因、昆蟲自身的激素基因及P53死亡蛋白，由於這些基因有的來源於其它物種，存在基因安全問題；來源於自身的技術等原因需要較長的生理過程，因而病毒殺蟲劑的效果一直不夠理想。CfORC6與DNA複製和細胞分裂有關，其突變可以直接引起細胞死亡，過量產生突變的CfORC6直接導致細胞死亡，省卻了較長的生理過程，無疑可提高毒力。CfORC6的功能特點為設計高效的新型重組杆狀病毒殺蟲劑奠定基礎，而且為進一步研製癌症的基因治療載體提供理論依據和實踐指導。
我國於2004年上市的癌症基因治療載體為Adv-P53，通過P53一系列信號傳導途經才能將死亡信號傳給癌細胞，最終導致癌細胞的死亡。而ORC6能直接與DNA結合，如果其複製功能域或細胞分裂功能域部位缺失或突變，可以直接引起細胞DNA不能複製、細胞不能分裂而死亡，預計癌細胞死亡時間會更短。
綜上所述，蛋白第六亞基CfORC6基因的研究，不僅具有重要的理論價值，而且對醫學和農業領域也有應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基CfORC6基因；本發明另一目的是利用雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基CfORC6基因及其突變體在獲得重組杆狀病毒殺蟲劑中的應用。
本發明的技術方案一種雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基CfORC6基因，該基因全長cDNA序列，具有如下所示的1014bp的核苷酸序列1 atggcttcgt acaataaaac tcttcaactt ctagcatcaa aaatgggtct aagggaggaa61 gataaagtgt taagtaaggc tgccgagttt gaacgactac tgcagactaa aactgttgcc121 gggagcaact tgagcgacac gagcaaggtg gtgatctgtc ttgacttagc tgcaggcatt181 tatggagtcg aattagatgt gaaaacagca gtgaaatact cgggtctgaa gccagtagca241 tatacaagta accgcaagac tgtggaaaac cttctagagc tgaacaccag caagctatcg301 gtgccattgc tgtgtgtctc cttgcagtgc acgggggttc aggagactgc tgtaaagata361 cttgaggagt accagagaca tgcaaaagtg gaggtggatc taagtctccc acaatatgta421 tgcatggctg tatttcaagc ttgtagaatt aacaaagtga aagtgtcgaa agtcaaaata481 aacgagaaat gtcgcctgaa gcctgcacaa tgggccaagc ttgaggctga ctgggctagc541 tttgtgaacg agaaattcaa catcgccaag aaaaaaaggg ggaggcctgc caagaatgct601 gtgaacagtg atgataatca agagatggaa gcagattcta aagaggaagg ccccacggaa661 attgagatag aaccatatga gacttggaaa cagcgcatgc tagaaagcgc ctatgaagaa721 ctcaaacaat taaagatgaa agaaaatgag actaggctga aatcgcctag aaaagccaca
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所述的CfORC6基因編碼的蛋白，編碼長為338個胺基酸，蛋白的胺基酸序列為1 MASYNKTLQL LASKMGLREE DKVLSKAAEF ERLLQTKTVA GSNLSDTSKV51 VICLDLAAGI YGVELDVKTA VKYSGLKPVA YTSNRKTVEN LLELNTSKLS101 VPLLCVSLQC TGVQETAVKI LEEYQRHAKV EVDLSLPQYV CMAVFQACRI151 NKVKVSKVKI NEKCRLKPAQ WAKLEADWAS FVNEKFNIAK KKRGRPAKNA201 VNSDDNQEME ADSKEEGPTE IEIEPYETWK QRMLESAYEE LKQLKMKENE251 TRLKSPRKAT VKETNKILSK EVTMGTPQKK VTRGTPQKEV SRGTPQKVTS301 GTPSKEILGV AHKKRFLEVP HTKKLLDIRH RKICLEIS。
所述的CfORC6基因在獲得CfORC6突變體中的應用。
所述的CfORC6突變體在獲得重組杆狀病毒殺蟲劑中的應用。
本發明利用Blast結合RT-PCR方法克隆並鑑定了CfORC6基因，所分離的基因長1014bp，編碼338個胺基酸，分子量約42kD。
CfORC6基因具有如下特點(1)與果蠅及人的ORC6有較高同源性(30％)；(2)在N-端有與DNA複製相關的功能域，在中部有與細胞有絲分裂相關的功能域；(3)在C-端有許多磷酸化位點；(4)CfORC6在雲杉卷夜蛾基因組中為單拷貝基因，在細胞周期中轉錄信號較弱；(5)CfORC6與病毒的增值無關。
綜上所述這些特點為構建新型的重組杆狀病毒殺蟲劑，提高殺蟲劑毒力提供理論依據和材料基礎，即將突變的CfORC6插入到杆狀病毒多角體蛋白的啟動子下，病毒大量表達突變的CfORC6，直接引起宿主細胞死亡。
本發明的積極有益效果(1)提供了一種雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基基因CfORC6基因及其編碼的蛋白質。
(2)利用雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基CfORC6基因，採用PCR和融和PCR方法在構建CfORC6突變體中的應用。
(3)利用CfORC6突變體插入到杆狀病毒多角體蛋白的啟動子下，病毒大量表達突變CfORC6，直接引起宿主細胞死亡，提供了CfORC6突變體在重組杆狀病毒殺蟲劑中的應用。
(4)CfORC6的功能特點為設計高效的新型重組杆狀病毒殺蟲劑奠定基礎，而且為進一步研製癌症的基因治療載體提供理論依據和實踐指導。
四

圖1、CfORC6與其它ORC6的同源性比較，表明CfORC6與果蠅及蚊子的同源性高，與人的較低，與酵母同源性最低。
圖2、CfORC6的C-端存在的磷酸化位點(S/T)PXK。
圖3、CfORC6與果蠅、蚊子及人的ORC6序列比對及功能域確定。
圖4、Northern blot表明CfORC6轉錄量很少，CfORC6的mRNA約2000nt，但轉錄信號很弱。第1泳道RNA Marker；第2泳道地高辛標記的CfORC6探針與CfORC6的mRNA雜交圖5、Southern blot表明CfORC6在雲杉毛蟲基因組中為單拷貝基因。
MDNA Maker第1、2泳道用EcoRI消化Cf基因組後，電泳、轉膜，以地高辛標記的CfORC6探針與其雜交，第2泳道DNA量是第1泳道的兩倍；第3泳道地高辛標記的CfORC6探針與含CfORC6基因的質粒雜交。
圖6、western blot證明CfORC6的分子大小約42kD。
M蛋白質Marker；U未經IPTG誘導的細胞；37誘導細胞在37℃表達CfORC6；25誘導細胞在26℃表達CfORC6。
圖7、Western Blot以CfORC6的抗體為探針進行Western Blot，證明它與病毒複製無關。
42.7蛋白質Marker；M未感染CfMNPV的細胞，0表示Cf124T細胞剛布滿培養瓶的80％，26表示繼續生長26小時；CfMNPVCfMNPV感染Cf124T細胞(剛布滿培養瓶的80％)後，分別於6、8、10、14、18、22、26小時後收集細胞進行Western Blot；上一行以CfORC6的抗體為探針進行Western Blot，下一行是對照，以Lef-3的抗體為探針進行Western Blot。
圖8、採用PCR和融合PCR方法構建CfORC6突變體過程示意圖。
圖9、重組杆狀病毒殺蟲劑生產流程示意圖。
五具體實施例方式實施例一獲得CfORC6基因及其突變基因的方法。
1、利用RNA試劑盒(Invitrogen，依據試劑盒操作說明)從蟲體或細胞系中提取總RNA。
2、依據序列設計引物(利用Primier 4.0，加入HindIII和Xhol酶切位點)，採用RT-PCR獲得CfORC6的cDNA。
3、雙酶切後插入克隆載體pFastBac，轉化DH5a，擴增基因。
4、以pFastBac質粒為模板，採用PCR及融和PCR技術獲得CfORC6的突變體。
5、突變的CfORC6克隆到pFastBac。
操作步驟如圖8所示。
實施例二獲得重組杆狀病毒殺蟲劑的方法1、利用雙酶切方法，將CfORC6突變體插入到pFastBac質粒的多克隆位點中，紅色代表插入基因的位置；將重組質粒轉化DH5α，利用氨苄抗性及X-gal-IPTG(籃白斑)平板過夜培養(37±0.5℃)篩選陽性克隆，即重組pFastBac-CfORC6突變體，繁殖陽性克隆(37±0.5℃，220rpm，LB-AMP培養基)，鹼性-SDS裂解法製備pFastBac-CfORC6突變體質粒。
2、重組質粒pFastBac-CfORC6突變體轉化相應的含Bacmid的感受態細胞系DH10Bac，30±0.5℃培養4小時後，在抗生素平板上44±0.5℃培養過夜，經過同源重組，使突變的CfORC6插入Bacmid。
3、利用卡那黴素、四環素的抗性及X-gal產生的藍色，選擇含重組的Bacmid-CfORC6突變體的克隆(白色菌落)。
4、將含重組的Bacmid-CfORC6突變體的克隆接種到新製備的平板上過夜培養(37±0.5℃)進一步確定為陽性克隆。將陽性克隆37±0.5℃，300rpm過夜培養在含卡那黴素、慶大黴素和四環素的液體培養基中，利用鹼性-SDS法製備重組Bacmid DNA。
5、將BacmidDNA與細胞轉染試劑CellFectin混勻一起轉染昆蟲細胞系。27±0.5℃下培養72小時。
6、收穫重組的杆狀病毒在顯微鏡下觀察細胞及病毒生長情況，一般生長72±1小時，即可看到細胞破裂及病毒粒子的產生，此時收穫上清液。
7、利用噬菌斑法測定重組杆狀病毒滴度，同時利用重組杆狀病毒感染昆蟲細胞測定突變CfORC6的表達，以確定重組杆狀殺蟲劑的毒力。
8、最終利用重組杆狀病毒加入昆蟲的食物中，如噴灑葉片，測定其毒力。
操作步驟如圖9所示。
110河南農業大學120雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基基因及其應用160221012111014212DNA213雲杉毛蟲(Choristoneura fumiferana)4001atggcttcgt acaataaaac tcttcaactt ctagcatcaa aaatgggtct aagggaggaa 60gataaagtgt taagtaaggc tgccgagttt gaacgactac tgcagactaa aactgttgcc 120gggagcaact tgagcgacac gagcaaggtg gtgatctgtc ttgacttagc tgcaggcatt 180tatggagtcg aattagatgt gaaaacagca gtgaaatact cgggtctgaa gccagtagca 240tatacaagta accgcaagac tgtggaaaac cttctagagc tgaacaccag caagctatcg 300gtgccattgc tgtgtgtctc cttgcagtgc acgggggttc aggagactgc tgtaaagata 360cttgaggagt accagagaca tgcaaaagtg gaggtggatc taagtctccc acaatatgta 420tgcatggctg tatttcaagc ttgtagaatt aacaaagtga aagtgtcgaa agtcaaaata 480aacgagaaat gtcgcctgaa gcctgcacaa tgggccaagc ttgaggctga ctgggctagc 540tttgtgaacg agaaattcaa catcgccaag aaaaaaaggg ggaggcctgc caagaatgct 600gtgaacagtg atgataatca agagatggaa gcagattcta aagaggaagg ccccacggaa 660attgagatag aaccatatga gacttggaaa cagcgcatgc tagaaagcgc ctatgaagaa 720ctcaaacaat taaagatgaa agaaaatgag actaggctga aatcgcctag aaaagccaca 780gttaaagaaa ctaataaaat cttatcgaaa gaagttacta tgggtacccc gcagaaaaaa 840gttactaggg gtaccccaca aaaagaggtt tctaggggta ccccacaaaa agttactagt 900ggaaccccat cgaaagaaat actaggggta gcccacaaaa agaggtttct agaggtaccc 960cacacaaaga agttactaga tatacgccac cggaagatat gtttggaaat atcc 10142102211338212PRT
213雲杉毛蟲(Choristoneura fumiferana)4002Met Ala Ser Tyr Asn Lys Thr Leu Gln Leu Leu Ala Ser Lys Met1 5 10 15Gly Leu Arg Glu Glu Asp Lys Val Leu Ser Lys Ala Ala Glu Phe20 25 30Glu Arg Leu Leu Gln Thr Lys Thr Val Ala Gly Ser Asn Leu Ser35 40 45Asp Thr Ser Lys Val Val Ile Cys Leu Asp Leu Ala Ala Gly Ile50 55 60Tyr Gly Val Glu Leu Asp Val Lys Thr Ala Val Lys Tyr Ser Gly65 70 75Leu Lys Pro Val Ala Tyr Thr Ser Asn Arg Lys Thr Val Glu Asn80 85 90Leu Leu Glu Leu Asn Thr Ser Lys Leu Ser Val Pro Leu Leu Cys95 100 105Val Ser Leu Gln Cys Thr Gly Val Gln Glu Thr Ala Val Lys Ile110 115 120Leu Glu Glu Tyr Gln Arg His Ala Lys Val Glu Val Asp Leu Ser125 130 135Leu Pro Gln Tyr Val Cys Met Ala Val Phe Gln Ala Cys Arg Ile140 145 150Asn Lys Val Lys Val Ser Lys Val Lys Ile Asn Glu Lys Cys Arg155 160 165Leu Lys Pro Ala Gln Trp Ala Lys Leu Glu Ala Asp Trp Ala Ser170 175 180Phe Val Asn Glu Lys Phe Asn Ile Ala Lys Lys Lys Arg Gly Arg185 190 195Pro Ala Lys Asn Ala Val Asn Ser Asp Asp Asn Gln Glu Met Glu200 205 210Ala Asp Ser Lys Glu Glu Gly Pro Thr Glu Ile Glu Ile Glu Pro215 220 225Tyr Glu Thr Trp Lys Gln Arg Met Leu Glu Ser Ala Tyr Glu Glu230 235 240
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權利要求
1.一種雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基CfORC6基因，其特徵是該基因全長cDNA序列，具有如下所示的1014bp的核苷酸序列1 atggcttcgt acaataaaac tcttcaactt ctagcatcaa aaatgggtct aagggaggaa61 gataaagtgt taagtaaggc tgccgagttt gaacgactac tgcagactaa aactgttgcc121 gggagcaact tgagcgacac gagcaaggtg gtgatctgtc ttgacttagc tgcaggcatt181 tatggagtcg aattagatgt gaaaacagca gtgaaatact cgggtctgaa gccagtagca241 tatacaagta accgcaagac tgtggaaaac cttctagagc tgaacaccag caagctatcg301 gtgccattgc tgtgtgtctc cttgcagtgc acgggggttc aggagactgc tgtaaagata361 cttgaggagt accagagaca tgcaaaagtg gaggtggatc taagtctccc acaatatgta421 tgcatggctg tatttcaagc ttgtagaatt aacaaagtga aagtgtcgaa agtcaaaata481 aacgagaaat gtcgcctgaa gcctgcacaa tgggccaagc ttgaggctga ctgggctagc541 tttgtgaacg agaaattcaa catcgccaag aaaaaaaggg ggaggcctgc caagaatgct601 gtgaacagtg atgataatca agagatggaa gcagattcta aagaggaagg ccccacggaa661 attgagatag aaccatatga gacttggaaa cagcgcatgc tagaaagcgc ctatgaagaa721 ctcaaacaat taaagatgaa agaaaatgag actaggctga aatcgcctag aaaagccaca781 gttaaagaaa ctaataaaat cttatcgaaa gaagttacta tgggtacccc gcagaaaaaa841 gttactaggg gtaccccaca aaaagaggtt tctaggggta ccccacaaaa agttactagt901 ggaaccccat cgaaagaaat actaggggta gcccacaaaa agaggtttct agaggtaccc961 cacacaaaga agttactaga tatacgccac cggaagatat gtttggaaat atcc。
2.根據權利要求1所述的CfORC6基因，其特徵是該基因編碼的蛋白，編碼長為338個胺基酸，蛋白的胺基酸序列為1 MASYNKTLQL LASKMGLREE DKVLSKAAEF ERLLQTKTVA GSNLSDTSKV51 VICLDLAAGI YGVELDVKTA VKYSGLKPVA YTSNRKTVEN LLELNTSKLS101 VPLLCVSLQC TGVQETAVKI LEEYQRHAKV EVDLSLPQYV CMAVFQACRI151 NKVKVSKVKI NEKCRLKPAQ WAKLEADWAS FVNEKFNIAK KKRGRPAKNA201 VNSDDNQEME ADSKEEGPTE IEIEPYETWK QRMLESAYEE LKQLKMKENE251 TRLKSPRKAT VKETNKILSK EVTMGTPQKK VTRGTPQKEV SRGTPQKVTS301 GTPSKEILGV AHKKRFLEVP HTKKLLDIRH RKICLEIS。
3.權利要求1所述的CfORC6基因在獲得CfORC6突變體中的應用。
4.權利要求3所述的CfORC6突變體在獲得重組杆狀病毒殺蟲劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及昆蟲基因工程技術領域，特別是涉及一種雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基CfORC6基因及其應用。本發明所分離的基因長1014bp，編碼338個胺基酸，分子量約42kD。利用雲杉毛蟲DNA複製原點識別蛋白第六亞基基因，採用PCR和融和PCR方法構建CfORC6突變體，並利用CfORC6突變體插入到杆狀病毒多角體蛋白的啟動子下，病毒大量表達突變CfORC6，直接引起宿主細胞死亡，提供了CfORC6突變體在重組杆狀病毒殺蟲劑中的應用。CfORC6的功能特點為設計高效的新型重組杆狀病毒殺蟲劑奠定基礎，而且為進一步研製癌症的基因治療載體提供理論依據和實踐指導。
文檔編號C07K14/435GK101029307SQ200610017860
公開日2007年9月5日 申請日期2006年5月30日 優先權日2006年5月30日
發明者王小純, 艾裡克·卡斯特恩 申請人:河南農業大學