重組體杆狀病毒載體中B型肝炎病毒抗原的表達的製作方法

2023-06-26 02:16:46

專利名稱:重組體杆狀病毒載體中B型肝炎病毒抗原的表達的製作方法
本發明涉及生產人體病毒性B型肝炎表面抗原(HBsAg)及其有關的Pre-S2蛋白質的方法。
人體B型肝炎病毒HBV，即hepadna病毒種群之一是引起遍及世界的慢性肝病和肝癌的常見病因。該病毒基因組包括小圓形的、部分是單鏈的脫氧核糖核酸(DNA)物種，在病毒顆粒中與病毒DNA聚合酶相連接。DNA聚合酶的功能使病毒DNA成為雙股形式，以及在感染細胞內複製病毒DNA。HBV具有肝細胞向性。人們相信這種向性的分子基礎存在於病毒顆粒的表面蛋白中，在開始感染的某個階段，與存在於受納細胞上的細胞結構(受體)反應。細胞和人體受感染開始可被由人體抗外源病毒蛋白中產生的抗體阻滯。人們通常從急性病開始感染，常常導致長期的慢性病，包括高濃度病毒抗原(某些以所謂22毫微米非感染形式顆粒或澳大利亞病毒抗原)和42毫微米感染病毒(「Dane顆粒」)在傳染期的患者血液中循環的持續性病毒感染。還在其他體液中發現病毒和病毒抗原(精液、唾液、鼻咽分泌物、經血、腹水、膽汁、淚液、乳液、腦脊髓液等)，及隨環境傳播的病毒。人體「病原攜帶者」在急性感染期和慢性感染期，對疾病的流行病學都是重要的。
脂膜小球結構形式的所謂22毫微米顆粒(15～22毫微米)是作為受納細胞活性病毒感染的副產品產生的。它主要由包埋在脂膜中的病毒(主要為HBsAg及一些Pre-S2)表面蛋白(抗原)組成。還在患者血液中發現含這些抗原的其它病毒誘髮結構是絲狀或杆狀結構(有22毫微米寬，但有幾百毫微米長)。HBsAg是用病毒遺傳信息表示蛋白組分的病毒編碼糖蛋白(有多至3個碳水化合物側鏈的蛋白)，以及用病毒所生長的細胞機器表示碳水化合物組分。像傳染病毒那樣，22毫微米脂類組分和其它顆粒是由病毒所生長的宿主細胞脂膜衍生的。這樣，脂類和碳水化合物組分都可用細胞表示。HBsAg蛋白序列、其內在的抗原結構和碳水化合物側鏈的附著位點，以及植入在脂類內的HBsAg蛋白部分都用病毒遺傳序列表示。球形42毫微米傳染的病毒顆粒包括DNA內部核心和結合DNA聚合酶，其包括由7毫微米脂類組成的外殼包圍的核心抗原(HBcAg)和「e」抗原(HBeAg)、HBsAg和一些Pre-S2蛋白。Pre-S2是病毒和其它病毒誘髮結構的微量組分，可代表對HBsAg不完全處理的蛋白質前體，因為它含有整個HBsAg序列及在HBsAg的氨基末端(「上遊」)大約55個額外胺基酸。
在由BN Fields編的「Virology」(Raven Press)NW.1392頁圖5中表示的包含大約3200鹼基長HBV(Robinson，1985年)的限制性內切酶位點(Bam HI，Acc I，等)的位置。在部分雙股病毒DNA的完全(長)鏈中DNA具有4個開譯讀碼(ORF)，ORF包括可從互補信使核糖核酸(mRNA)序列轉譯成胺基酸(蛋白質)連接序列的DNA核苷酸序列。ORF-2包含表達處於同相和163個胺基酸「Pre-S」序列下遊的大概25，000道爾頓HBsAg(約200個胺基酸)的序列。不能確定HBcAg和Pre-S2蛋白質是如何由ORF-2編碼序列衍生而來，ORF-3編碼用於相當於HBcAg(190～220個胺基酸)的主要核心蛋白。ORF-1(多半是病毒聚合酶)和ORF-4的基因產物是否相同還未肯定。
人受HBV感染通常包括熟友(常經皮膚接觸)血清和含個人之間物質的血清的傳輸(此處為血清性肝炎的又一名稱)。該疾病特別流行於發展中國家，如中國、大洋洲、南太平洋、非洲、中東及南美洲和印度的某些地區，在東南亞的一些國家中這種患病率很高(5～20%)，然而這種病還發生在世界的其它地區，尤其在特殊的少數民族人群之中，即與慢性病毒攜帶者的密切接觸、與急性B型肝炎患者的性接觸、受感染母親的新生兒、性亂交者、共用注射針的違法吸毒者、接受血製品的血友病患者、血液滲析患者及與其接觸者，以及醫護人員(牙醫師、護士、外科醫師、臨床化驗室工作人員)。肝癌細胞和B型肝炎病毒感染的結合被認為是由於從慢性抗原血症導致慢性肝炎、肝硬化，然後肝細胞瘤發展的起始病毒感染。
診斷受B型肝炎病毒的感染，通常從疾病患者的臨床主診開始，繼之以檢查妨礙患者代謝的生化試驗(轉氨酶、膽紅素等)。在B型肝炎病毒感染開始以後，產生對HBcAg、HBsAg和HBeAg的抗體，由此鑑定血液中的病毒抗原(包括病毒)(糞便等;1～6月;放射免疫測定〔RIA〕，酶連接的免疫吸附劑測定〔ELISA〕，免疫電泳法，血凝反應等)，或病毒特殊抗體的存在(例如用RIA、ELISA、免疫電泳法、血凝反應等鑑定早期免疫球蛋白M抗HBcAg〔2～8月〕;免疫球蛋白G抗HBeAg〔4～10個月〕和免疫球蛋白G抗HBcAg〔5～6月和終生〕，從而診斷B型肝炎病毒的感染。
雖然細節並未肯定，可相信受納細胞中涉及到HBV的感染過程包括基因組從病毒衣殼組分中脫出，病毒DNA移位至細胞核，病毒DNA的合成使DNA基本上成圓形，在基因組中mRNA的轉錄和從病毒啟動子完全RNA複製，RNA移位至細胞質，病毒蛋白物種從mRNA物種轉譯，以及從病毒RNA轉錄本的基因組DNA複製的蛋白首次接觸抗原(逆轉錄作用)。最後，形成病毒核心結構，包括部分連接核心抗原(蛋白)基因組的雙股DNA形式。轉譯以後，HBsAg(和Pre-S2)的處理和移位至細胞表面，在細胞表面發生核心結構的包膜。病毒從細胞表面釋放使其它細胞受感染。從包含22毫微米顆粒和絲狀形而缺乏病毒DNA但具有HBsAg的未成結構的感染細胞的釋放，也發生在細胞表面。
B型肝炎病毒表面抗原和相關的Pre-S2蛋白在診斷疾病中，可用作鑑別患者體液中誘發病毒抗體的抗原，或者用於產生為了鑑別患者或其它物質中病毒抗原的參照抗體。HBsAg和Pre-S2蛋白也可用於預防由於接種的感染。
從活的病毒取得HBsAg和Pre-S2蛋白質的現代方法存在著原料不足的不利因素，而任何生產的方法包括對感染的病毒的利用，由於存在著使生產工作者受感染的危險，以及活的病毒傳進所需要的產品中的可能性，所以可能是危險的。現今採用的應用重組體DNA技術生產HBsAg和Pre-S2蛋白質的方法包括原核細胞的轉化已經證明不是特別有效的。
已經發現，應用以杆狀病毒為基礎的表達載體感染昆蟲或昆蟲細胞，可以很容易地生產出HBsAg和Pre-S2蛋白質。
因此根據本發明的一個方面，提供了生產多肽的一種方法，至少包括HBsAg或Pre-S2蛋白質的一種抗原部分，這個方法包括在polyhedrin啟動子的表達控制下，用包括具有用於所說的多肽編碼的一個DNA片段的重組體杆狀病毒表達載體來感染敏感的昆蟲或昆蟲細胞。
本發明也包括這種重組體杆狀病毒本身。
這樣，本發明提供包括人體B型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和由生長在昆蟲或昆蟲培養細胞的重組體杆狀病毒合成相關的Pre-S2蛋白的產物。該重組體杆狀病毒可通過帶有傳染性杆狀病毒DNA的昆蟲培養細胞與杆狀病毒轉移載體質粒的共轉染產生，該質粒含有構建代表B型肝炎病毒抗原和代替杆狀病毒多面體(polyhedrin)基因的起始端(5′)編碼序列的基因，但是要在殘餘多面體(polyhedrin)啟動子的控制下。表達肝炎抗原的polyhedrin陰性病毒，存在於共轉染的子代中是傳染性的。當這些病毒生長於昆蟲或昆蟲培養細胞中時，開始可根據非表現型polyhedrin來選擇，接著用以表達B型肝炎抗原。大多數肝炎抗原由像顆粒的重組體病毒感染細胞分泌，在血清學上和結構上都像22毫微米B型肝炎顆粒。它們可以用常規方法如差速離心或平衡梯度離心法和色譜法，從昆蟲提取液或昆蟲培養細胞上清液提純。
昆蟲細胞可以分泌肝炎抗體這個事實，對已經注意到過去未能從其他的重組體系統如由酵母細胞分泌抗原來說是十分驚奇的。再者，十分意外的是集中在類似22毫微米顆粒的顆粒中而發生在一種昆蟲或昆蟲細胞為基礎的系統中。
在本申請中，術語的定義如下質粒(如通常用的pUC8)是含於用受納細胞(如細菌)複製所需序列的雙股DNA的染色體外序列。它是可以通過稱為轉化的方法引入細胞的一種複製子。
啟動子是能從連接啟動子的DNA序列(基因)轉錄信使核糖核酸(mRNA)的DNA序列。mRNA是某單股DNA的複製，mRNA可用來操縱DNA序列中蛋白質的合成(轉譯)，通過能識別包括啟動子的DNA序列的RNA聚合酶催化轉錄作用。
基因是一片藉助其內在序列(連接的或間斷的)，決定著胺基酸蛋白質鏈合成的DNA。
感染是由遺傳物質(以DNA形式或病毒)侵入受納細胞，繼而複製該物質。在通過病毒或代表病毒的DNA感染的情況下，可從傳染性子代病毒的那些細胞中得到結果。
轉染和共轉染涉及將遺傳物質如一種或多種DNA引入細胞的實驗方法，使DNA能感染細胞。凡DNA是共線性的，存在發生重組(交換)過程的可能性。可用包括帶有特殊鹽類(通常為有磷酸鹽、硫酸葡聚糖等參加的氯化鈣)沉澱DNA和把生成的混合物用於含有某些DNA的細胞等方法進行轉染。
參照附圖更詳細介紹本發明的HBsAg和Pre-S2的產生圖1圖2表示構建本發明第一重組體轉移載體的方法。
圖3表示構建本發明第二重組體轉移載體的方法。
圖4(a)圖4(b)表示在用本發明重組體杆狀病毒感染的昆蟲細胞培養物上清液進行放射免疫測定的結果。
圖5表示從HBV感染患者的血液中分離確實為22毫微米顆粒與上述這種上清液的顯微攝影對比。
圖6表示通過本發明重組體杆狀病毒感染的昆蟲細胞隨時間而變化的HBV抗原的產生。
按下述進行本發明重組杆狀病毒的構建從患者血液中分離B型肝炎病毒(adw亞類)的DNA，用限制性核酸內切酶Bam HI將DNA消化成特殊碎片(見BN Fields編的「Virology」，Raven Press，NW 1392頁圖5)。限制性內切酶識別DNA的特殊核苷酸序列，在或鄰近那些序列處催化水解。根據酶的特異性，生成的產物都有「鈍」端，其中每個衍生的DNA片段的兩個DNA鏈都是等長的，在切割位點都不重疊，也不具有一個單鏈長於另一個鏈的「粘性」末端，由限制性內切酶消化的產物最容易用具有互補「粘性」末端的其它酶(連接酶)重連接(例如被連接的Bam HI消化DNA產物一起回復或回復到Bam HI消化另一個DNA的產物)。當DNA片段是有「鈍」端時，連接還是可能的。
用Bam HI限制性內切酶消化的HBV DNA產生約1400 HBV DNA鹼基對的片段，該鹼基對包圍(見圖1，圖2，L單鏈順時針方向5′至3′)「Pre-S2」區的附加部分、所有HBsAg ORF-2編碼序列和鄰近3′序列。大量必需的HBV序列轉移後，可按下述進行基因的重新構建。
將含HBsAg序列的Bam HI衍生片段連接到細菌質粒pUc8的Bam HI位點(圖1，圖2)，該pUc8質粒在特定細菌細胞中複製，並在外來序列如HBV DNA序列插入後，重組體pUc8質粒可以被複製、克隆和選擇。重組體pUc8-HBs可用這些方法衍生，即分離並用Bam HI消化它的DNA，然後回收含大量HBsAg基因的Acc I和生成的DNA大片段(圖1，圖2)。將該片段連接到合成寡核苷酸序列，正確地構建HBsAg轉譯終止序列，提供連續處理的限制位點(如Bam HI位點)，以及提供代表切割Hind Ⅲ序列的末端序列(「粘性」末端)。這種連接之後，這些產物重新連接到預先用Bam HI和Hind Ⅲ(圖1，圖2)消化的pUc8質粒，導致形成和回收重組體質粒pHBsYK2。這種重組體質粒的DNA用Bam HI消化，分離含HBV序列的片段，並將其連接到以pAcRP6表示的杆狀病毒轉移載體。在連接前，轉移載體pAcRP6用Bam HI切割。在細菌中克隆後，得到以pAcRP6-HBsYK14表示的重組體質粒轉移載體(圖1，圖2)。轉移載體pAcRP6-HBsYK14保存在美國典型菌種保藏委員會，登記號為ATCC 67203(1986年9月12日)。
由Possee(5Virus Research 43頁，1986年)，Matsuura等67J.Gen.Virol 67期1515頁，1986年)介紹pAcRP質粒轉移載體的來源。質粒pAcRP6類似於由Smith、Summers和Fraser(Mol.and Cell.Biol.1983年3卷No.12，2150～2165頁)所介紹的從Autographa Californica核多面體病毒(AcNPV)衍生的質粒轉移載體，具有合成寡核苷酸短「聯結子」序列，含有Bam HI限制性內切酶識別位點代替polyhedrin基因殘基-8～+175。其原始polygedrin ATG密碼子計作+1至+3(參見Hooft van Iddekinge，Smith和Summers 131 Virology 561頁，1983年)。該Bam HI位點只是在通過Bam HI酶可以在該位點上完全消化的質粒中的Bam HI位點。此外，可用杆狀病毒轉移載體。還可構建pAcRP6質粒衍生物，其中，放置合成Bam HI-Sma I-Bam HI短結合器序列代替Bam HI聯結子，可以在它們唯一Sma I位點消化質粒。
pAcRP6-HBsYK14重組體轉移載體用於Spodoptera frugiperda昆蟲細胞與從AcNPV分離的傳染性DNA共轉染。從共轉染、重組體、polyhedrin-negative的子代病毒中，通過感染細胞的克隆中缺乏肉眼可見的polyhedra來鑑定和回收這些病毒，並將空斑克隆在S.frugiperda培養細胞中。重組體病毒如AcNPV-HBsYK14用來表達昆蟲和昆蟲培養細胞中的HBsAg。為了測定HBV抗原用感染的昆蟲培養細胞上清液，從1/1連續稀釋至1/64，對125I示蹤的抗HBV進行放射免疫測定。結果示於圖4，由此可見稀釋和結合抗體之間存在線性關係。
對細胞上清液(ⅰ)、淨化的細胞上清液(ⅱ)、20x濃縮的細胞上清液(ⅲ)和含真實的22毫微米顆粒的血清(ⅳ)，進行顯微鏡檢查(圖5)，結果證明用本發明的重組體轉移載體感染的昆蟲細胞產生的顆粒與22毫微米HBV抗原難以區分。
用重組體病毒AcNPV-HBsYK14和起始(未轉換)病毒AcPNV感染昆蟲細胞，對每一種病毒，測量隨時間變化的HBV抗原的產生，可以看到只有轉換載體得到陽性的測定結果。
據證明Pre-S2對提高HBsAg的免疫性是重要的，為此構建第二重組體轉移載體，這種載體含有HBsAg和整個必需的上遊Pre-S2序列。將代表在pHBsYK2質粒DNA中缺少Pre-S2上遊序列的合成寡核苷酸連接至含從pHBsYK2 DNA回收的HBV序列的Bam HI衍生片段的兩端。除了連續操作所需的限制性內切酶序列(例如Xho I)和用於合成Pre-S2蛋白的ATG轉譯起始密碼子以外，寡核苷酸具有適當末端序列可使「粘性」末端連接到Bam HI衍生DNA的末端(見圖3)。然後將寡核苷酸的連接產物和Bam HI衍生pHBsYK2片段連接到質粒PJM119和重組體質粒，該重組體質粒含有回收的寡核苷酸序列，並用序列分析證明(圖4，PJM119-PsSYK25)，具有HBsAg序列的55個胺基酸Pre-S2上遊的整個編碼區，並在3′末端相反方向具有重複的寡核苷酸序列(超出HBsAg基因的TAA轉譯終端密碼子的範圍)。質粒PJM119-PsSYK25的DNA用Xho I消化，通過用DNA聚合酶的克列諾夫片段和適宜的脫氧核糖核苷三磷酸鹽處理，末端成為鈍端，將產物連接到含有唯一Sma I位點的pAcRP6轉移載體。得到圖3所示的帶有基因排列的重組體(pAcRP6-PsSYK27)。
上述pAcRP6-PsSYK27重組體轉移載體用於Spodoptera frugiperda昆蟲細胞及從AcNPV分離得到的傳染性DNA的共轉染。從這些共轉染、重組體、polyhedrin陰性的子代病毒中，鑑定這些病毒，將空班克隆到培養的S.frugiperda細胞中。重組體病毒用於表達昆蟲和昆蟲培養細胞中的Pre-S2 HBsAg。
涉及本文的重組體載體和轉化的病毒已經另外儲存以美國形式培養收集如下(1)E.coli MC1061(pAcRP6-HBsYK14)-ATCC 67220(2)E.coli MC1061(pAcRP6-PsSYK27)-ATCC 67221(上述兩者於1986年9月25日保存)(3)A.californica AcNPV-PsSYK27(4)A.californica AcNPV-HBsYK14-VR 2158(上述兩者於1986年12月30日保存)
權利要求
1.一種生產至少含有一種HBsAg或Pre-S2蛋白質的抗原部分的多肽的方法，該方法包括用一種含有重組體杆狀病毒的表達載體，在一種polyhedrin啟動子的表達控制下，感染敏感的昆蟲或昆蟲細胞，所說的重組體杆狀病毒具有用於上述多肽編碼的一種DNA片段。
2.根據權利要求
1的方法，其中重組體杆狀病毒具有Polyhedrin-非表現型(negative phenotype)。
3.根據權利要求
1或2的方法，其中重組體杆狀病毒是從Autographa californica核多角體病毒衍生出的重組體杆狀病毒。
4.根據上述任何一項權利要求
的方法，其中表達載體是由含有所說的DNA片段和所說的杆狀病毒的感染性DNA的重組體轉移載體的重組作用而形成的。
5.根據權利要求
4的方法，其中所說的重組作用是由用含有所說的DNA片段和所說的杆狀病毒的感染性DNA的重組體轉移載體轉染敏感的昆蟲或細胞來進行的。
6.根據上述的任何一項權利要求
的方法，其中所說的DNA片段含有Bam HI插入的轉移載體pAcRP6-HBsYK14(ATCC 67203)。
7.一種重組體杆狀病毒，具有至少為HBsAg或Pre-S2蛋白質的一種抗原部份編碼的DNA片段。
8.一種能夠在細菌中繁殖並適應於應用杆狀病毒重組的轉移質粒，所說的杆狀病毒具有用於至少一種HBsAg或Pre-S2蛋白質的抗原部份編碼的DNA片段。
專利摘要
本發明介紹在昆蟲和昆蟲培養細胞中，人體B型肝炎病毒(HBV)抗原的表達。用重組體杆狀病毒感染受納昆蟲和受納細胞。在杆狀病毒polyhedrin基因啟動子的控制下，重組體杆狀病毒具有必需的插入杆狀病毒基因組的人體HBV基因，並代替病毒polyhedrin蛋白的起始(5′)編碼順序。
文檔編號C12N15/866GK87106266SQ87106266
公開日1988年6月29日 申請日期1987年9月8日
發明者戴維·H·L·畢曉普, 康賜永 申請人:戴維·H·L·畢曉普, 康賜永導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan