一種豬精液凍存液及豬精液處理方法

2023-06-26 04:08:36 2

專利名稱：：一種豬精液凍存液及豬精液處理方法
技術領域：
：本發明涉及生物技術，尤其涉及豬精液凍存液和豬精液的處理方法。
背景技術：
：精液冷凍技術對於充分發揮優良種豬的遺傳潛力以及地方豬種遺傳資源的保存均有極其重要的應用價值。豬的精液冷凍技術研究始於1956年，Polge等首次報導應用豬冷凍精液獲得產仔。但幾十年來，與牛、羊等家畜相比，豬的冷凍精液應用還相當有限，部分原因是因為豬凍精活力低、受胎率低、產仔數較鮮精少；部分原因是因為豬精液量大，傳統的麥管(0.25/0.5ml)實際應用中操作不便；而顆粒法冷凍，易造成汙染且不易標記。國外畜牧研究人員一直在探索豬大容量包裝，如5ml塑膠袋、大管(5ml)等精液冷凍技術，使之像牛、羊等家畜一樣做到一支麥管精液輸一頭母豬。但在使用大管法時，目前還沒有理想的豬精液的稀釋液添加劑、精子密度、冷凍及解凍方法等的提供。因此，本領域迫切需要從精子活力、活率、彎尾率、頂體完整率等參數檢查精子質量，以解凍後的精子質量、人工輸精結果作為評價指標，篩選出最佳的豬精液冷凍方法和程序，從而提供高效、實用的豬精液冷凍生產工藝。
發明內容本發明旨在提供一種豬精液的凍存液。本發明的另一個目的是提供一種如上述的豬精液的凍存液的用途。本發明的再一個目的是提供一種豬精液的處理方法。在本發明的第一方面，提供了一種豬精液凍存液，所述的凍存液每lOOml中含有-(a)5—20g乳糖；(b)0.005—0.05gN-乙醯-D-氨基葡萄糖;(c)0.05—0.5g二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA);(d)1.0—5.0ml甘油；(e)0.2—1.5ml氨基-鈉-十二烷基硫酸脂(O醒EsPaste，0EP)(f)10—40ml卵黃；和(g)5—20萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。在另一優選例中，所述的凍存液每100ml中含有(a)8—15g乳糖；(b)0.008—0.04gN-乙醯-D-氨基葡萄糖；(c)0.08—0.4gDHA;(d)1.5—4.0ml甘油；(e)0.3—1.0ml0EP;(f)15—30ml卵黃；和(g)8—15萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。在本發明的第二方面，提供了一種如上所述的凍存液的用途，所述的凍存液可用於保存豬精液。本發明的第三方面，提供了一種豬精液的處理方法，所述的方法包括步驟-.(1)將豬精液和如上所述的凍存液混合，得到含豬精液的混合物；(2)將步驟(1)得到的混合物加入5ml大管；和(3)將裝有豬精液的大管投入液氮中凍存，得到冷凍保存的豬精液。在另一優選例中，在步驟(l)得到的混合物中，豬精液的密度為0.5-4xl09個/ml;更佳地，密度為0.8-3.0xl9個/ml。在另一優選例中，所述的步驟(1)包括以下步驟(l')將豬精液和乳糖、N-乙醯-D-氨基葡萄糖、DHA、卵黃、和青黴素和/或鏈黴素混合，得到含豬精液的初始混合物，在每100ml初始混合物中含有l一8g乳糖，0.008—0.05gN-乙醯-D-氨基葡萄糖，0.05—0.6gDHA，3—20ml卵黃，1.5—10萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素；和(l")將步驟(l')所得到的含豬精液的初始混合物和乳糖、甘油、0EP、卵黃、和青黴素和/或鏈黴素混合，得到如上述步驟(1)中所述的含豬精液的混合物。在另一優選例中，所述的步驟(l')在室溫下進行；所述的步驟(1〃)在2—8'C進行；更佳地，步驟(l")在3—6'C進行。在另一優選例中，步驟(1)中得到的含豬精液的混合物每100ml中含有2一16g乳糖、0.004—0.03gN-乙醯-D-氨基葡萄糖、0.03-0.3gDHA、0.5—4ml甘油、0.125—1.0ml0EP、5—30ml卵黃、和2—10萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。在另一優選例中，步驟(1)中得到的含豬精液的混合物每100ml中含有3.5—12g乳糖、0.006—0.02gN-乙醯-D-氨基葡萄糖、0.06—0.25gDHA、0.8一3ml甘油、0.18—0.7ml0EP、8—20ml卵黃、和3—8.5萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素；優選步驟(1)中得到的含豬精液的混合物每100ml中含有5.5—8.5g乳糖、0.008—0.013gN-乙醯-D-氨基葡萄糖、0.10—0.15gDHA、1.0一2.0ml甘油、0.25—0.5ml0EP、10—15ml卵黃、和5—7.5萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。在另一優選例中，所述的方法還包括步驟(4)將步驟(3)得到的冷凍保存的豬精液和解凍液在25—7(TC混合10一100秒；所述的每100ml解凍液中含有2.0—8.0g葡萄糖、0.05—0.25gEDTA、0.3—1.2g擰檬酸三鈉、0.05—0.25g碳酸氫鈉、0.03—0.20g氯化鉀；優選在37—60。C混合25—80秒。據此，本發明提供了最佳的豬精液冷凍方法和程序，從而提供了高效、實用的豬精液冷凍生產工藝。圖l顯示了大管冷凍工藝。圖2顯示了大管冷凍的主要器具。圖3顯示了不同解凍溫度解凍後精子質量變化曲線。具體實施例方式發明人經過廣泛而深入的研究，意外地發現了一種豬精液的冷凍保存液，它可以長久而有效地保持豬精液中精子的活力、活率、質膜完整性和頂體完整性。另外，發明人發現使用大管對上述處理的豬精液進行冷凍保存，能克服常規顆粒法易造成汙染好不易標記的缺點。進一步地，發明人還發現了解凍溫度和時間對上述凍精活力等的影響。具體地，發明人發現可以將豬精液和含有DHA的溶液混合後，在大管中進行凍存。較佳地，將豬精液通過兩次稀釋後所得到的混合溶液進行凍存，所述混合溶液中含有DHA。如本文所用，"二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid，DHA，含6個不飽和鍵)"是一種"-3脂肪酸，所謂的"-3脂肪酸是指在多不飽合脂肪酸分子中，距羧基最遠端的雙鍵在倒數第3個碳原子上。本發明中的DHA可以由本領域技術人員所熟知的方式獲得，例如通過化學合成、或提取自海洋生物(如海魚)等。本發明所使用的DHA中可以含有少量其它的屬於"-3脂肪酸的物質，例如但不限於二十碳五烯酸(Eicosapentaenoicacid，EPA，含5個不飽和鍵)，所述的少量物質的含量為0—10wt。/。，較佳地為0—5wt°/。，更佳地為0—2wt0/o。如本文所用，"大管"是指在冷凍豬精液中所使用的放置豬精液和相關處理溶液的管狀容器，容器材料可以是本領域技術人員所熟知的；其容量可以是2-10ml，較佳地是4-6ml。在本發明的一個優選例中，所述的大管是本領域熟知的可以通過任何商業渠道所獲得的，例如但不限於德國米尼圖公司所生產的。如本文所用，"卵黃"是指雞蛋黃。如本文所用，"室溫"和"常溫"可互換使用，都是指10—3(TC，優選15—25。C。本發明提到的上述特徵，或實施例提到的特徵可以任意組合。本案說明書所揭示的所有特徵可與任何組合物形式並用，說明書中所揭示的各個特徵，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特徵取代。因此除有特別說明，所揭示的特徵僅為均等或相似特徵的一般性例子。本發明的主要優點在於1、本發明提供的豬精液凍存液可以使凍存的豬精液保持活力；2、利用本發明冷凍後的精液經過檢測其精子的活力達到0.3-0.6，精子頂7體完整率超過50%，完全符合目前人工授精的要求。下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數按重量計。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用於本發明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示範之用。精子活力檢測方法、精子彎尾率檢測方法、和精子頂體完整率檢測方法可參閱《動物繁殖學》，江蘇科學技術出版社，王元興，郎介金主編，1997，327-331頁。上述檢測方法都是在解凍後進行。精子活力的測定採用平板壓片法，取一滴精液(10W)於預熱(38°C)的載玻片上，蓋上蓋玻片，400X相差顯微鏡下鏡檢，估測活力(十級評分法)。質膜完整性的檢査採用低滲腫脹法，取50W精液加入lml低滲液(37。C預熱)中，37。C恆溫水浴30分鐘。取一滴(20W)混合液於血細胞計數板上，40X相差顯微鏡下觀察5個視野，鏡檢計數200個精子，計算彎尾精子的百分率。彎尾率=尾部彎曲精子數/總精子數乂100%頂體完整性的檢査姬姆莎染色後，相差顯微鏡1000X下隨機觀察200個精子，計算頂體異常率。姬姆薩染色製片①製片取精液於載玻片一頭，用一邊緣整齊的玻片呈35°角將精液樣品均勻拖布於載玻片上，自然風乾，製成精液塗片。②固定立即吸取10%福馬林固定液l一2ml滴於自然風乾的塗片上，固定15min，用水輕輕衝洗，洗去固定液，自然風乾。③染色將姬姆薩染液滴於塗片上，染色1.5h，然後用水輕輕衝洗，晾乾備檢。本發明實施例中的主要物質的來源為:tableseeoriginaldocumentpage9本發明實施例中的通用操作一、精液準備購自上海市南匯區瓦屑豬場的上海白豬，11頭成年、體質健康、性慾旺盛、採精頻率正常的公豬，輪流採精，共採精23次；購自上海市嘉定修清豬場的6頭小型梅山種公豬精液。二、精液採集手握法採精，收集中段精液濃厚部分，經四層紗布過濾，除去膠狀物。用HA固ONY稀釋液(購自上海東晉畜牧技術有限公司)在等溫條件下作1:1稀釋，保存於保溫瓶中，2小時內運回實驗室。三、精液預處理和品質檢査室溫下(15—25°C)靜置2小時，使精液緩慢降溫到室溫(20—23°C)。用顯微鏡於37'C下進行常規品質檢查。選擇無異味、色澤乳白色、精子形態正常、活力在0.7以上、密度為"密"(每毫升含2億精子以上為"密")的精液供試。四、精液的稀釋與平衡室溫下靜置2小時，每隔0.5小時輕輕晃動貯精瓶。用大離心管(250ml)分裝精液，室溫下離心，1730轉/分，IO分鐘，棄上清液。採用二次稀釋法進行稀釋，先在室溫下用稀釋液I液(見表1)作一定體積比的稀釋，然後將稀釋精液和稀釋液II液一起放入4T:冰箱內，緩慢降溫到4'C(約2小時)。用稀釋液n液(見表i)作一定體積比稀釋，得到含豬精液的混合物。檢查精子活力，取活力在0.6以上的精液直接進行冷凍。tableseeoriginaldocumentpage10五、製作冷凍精液大管法5ml大管由德國米尼圖公司生產。用小鋼球先將5ml大管的一端封口，在管壁上做好標記，然後於4。C預冷2小時。用20ml注射器吸取5ml處理好的精液，從大管未封口一端注入，剩約3cm的一段空管時停止注入，也用小鋼球將這端封口。擦乾大管外面的水珠，傾斜大管，使空氣泡段位於大管的中央。將大管置於廣口冷凍容器內充分預冷的管架上，距離液氮面以上3—5cm處(以3cm為最佳)，燻蒸20分鐘，然後投入液氮罐提桶內保存。見圖1和圖2。顆粒法(對照)將平衡好的精液，用鋁盒蓋冷凍。向廣口冷凍容器(大泡沫聚苯乙烯盒)內注入2/3左右液氮，將鋁飯盒飄浮於液氮面上，再將鋁盒蓋反蓋於飯盒上。待冷卻平衡約5分鐘，冷凍面充分預冷後，用20ml注射器吸取稀釋好的精液，在鋁盒蓋上連續滴凍，每滴劑量約為0.lml，滴凍時間一般在40—50秒，滴30滴左右後，待顆粒充分凝固。將顆粒鏟下，放入標記好的紗布袋內投入液氮中保存。六、解凍操作大管法用鑷子將大管迅速從液氮罐中取出，於在一定溫度的水浴中放置一定時間。待精液溶解約1/2—2/3時，取出大管，剪開兩端，將精液與預熱的37'C解凍液混合。顆粒法(對照)溼解凍法，用試管盛一定量解凍液，39'C水浴，然後，用長鑷子將顆粒凍精迅速從液氮罐中取出，空氣中停留io秒後投入解凍液中，快速震蕩試管使之融化。幹解凍法，將乾淨鋁盒於39'C水浴，用長鑷子將顆粒凍精迅速從液氮罐中取出，放入鋁盒中，待顆粒融化後，與同溫解凍液混合。七、人工授精取解凍好的精液，倒入輸精瓶中，再緩慢倒入同溫度的常溫保存液，稀釋至80ml，凍精解凍後每個輸精劑量為40ml，活精子數達30億以上。以母豬接受爬跨開始計算受體母豬的發情時間，輸精兩次，首次輸精在發情後12—14小時內進行，12小時後再輸一次。實施例1-4經過上述通用操作步驟一至四得到如表2的各成分的使用濃度的含有豬精液的混合溶液；然後根據步驟五進行大管法冷凍。tableseeoriginaldocumentpage11tableseeoriginaldocumentpage12效果例1-4將實施例1-4得到的冷凍精液經過上述的通用操作步驟六的大管法解凍(45°C70秒)後，進行精子活力、彎尾率和頂體完整率的檢測，結果如表3。表3tableseeoriginaldocumentpage12注同列肩標小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05),大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01),試驗重複10次。以下各表同。結果表明，稀釋液I液中添加0.15%、0.3柳HA對解凍後精子活力和頂體完整性影響顯著(P〉0.05)。實施例5-9經過上述通用操作步驟一至四得到如表4的各成分的使用濃度的含有豬精液的混合溶液；然後根據步驟五進行大管法冷凍。表4tableseeoriginaldocumentpage12tableseeoriginaldocumentpage13效果例5-9將實施例5-9得到的冷凍精液經過上述的通用操作步驟六的大管法解凍(45°C70秒)後，進行精子活力、彎尾率和頂體完整率的檢測，結果如表5。表5tableseeoriginaldocumentpage13結果表明，稀釋精液中1%—3%的甘油濃度能有效保護精子質膜，精子凍後彎尾率高於甘油濃度為4%、5%的稀釋精液，但差異不顯著(》0.05)。2%、3%的甘油濃度對精子頂體有較好的保護作用，頂體完整性顯著高於4%、5%甘油濃度(代O.05)。實施例10-14經過上述通用操作步驟一至四得到如表6的各成分的使用濃度的含有豬精液的混合溶液；然後根據步驟五進行大管法冷凍。表6tableseeoriginaldocumentpage13乳糖(g/100ml)5.505.505.505.505.50N-乙醯-D-氨基葡萄糖(g/100ml)00.010.050.100.15腿(g/100ml)0.150.150.150.150.15甘油(ml/100ml)22222OEP(ml/訓ml)0.250.250.250.250.25卵黃(ml/100ral)2525252525青黴素和/或鏈黴素(萬國際單位/100ml)55555效果例10-14將實施例10-14得到的冷凍精液經過上述的通用操作步驟六的大管法解凍(45°C70秒)後，進行精子活力、彎尾率和頂體完整率的檢測，結果如表7。表7實施例活力活率(％)彎尾率(％)頂體完整率(％)實施例100.42±0.0451.59±8.8750.85±2.9757.88±9,92b實施例110.43±0.0448.68±6.9453.30±7.4761.58±6.63ab實施例120.40±0.0554.21±3.1149.97±3.1970.83±7.80a實施例130.45±0.0553.76±5.8048.24±7.4773.59±4.87a實施例140.40±0.0648.22±6.1851.64±5.1561.41±3.37ab結果表明，稀釋液中添加不同劑量的N-乙醯-D-氨基葡萄糖對精子的活力、活率和彎尾率影響不顯著(/^0.05)，終濃度為0.05%和0.1%組N-乙醯-D-氨基葡萄糖對精子頂體有保護作用，頂體完整率顯著高於未添加組(K0.05)。實施例15-19經過上述通用操作步驟一至四得到如表8的各成分的使用濃度的含有豬精液的混合溶液；然後根據步驟五進行大管法冷凍。表8使用濃度實施例15實施例16實施例17實施例18實施例19豬精子(xl09個/ml)1.51.51.51.51.514tableseeoriginaldocumentpage15效果例15-19將實施例15-19得到的冷凍精液經過上述的通用操作步驟六的大管法解凍(45°C70秒)後，進行精子活力、彎尾率和頂體完整率的檢測，結果如表9。表9tableseeoriginaldocumentpage15結果表明，冷凍保護液中添加的卵黃終濃度分別為5%、10%、20%、25%和30%。由表3可知，10%和20%的卵黃能有效保護精子活力、質膜和頂體，顯著高於卵黃濃度為25%和30%組(屍<0.05)。實施例20-22經過上述通用操作步驟一至四得到如表10的各成分的使用濃度的含有豬精液的混合溶液；然後根據步驟五進行大管法冷凍。表10tableseeoriginaldocumentpage15乳糖(g/100ml)5.505.505.50N-乙醯-D-氨基葡萄糖(g/100nd)0.050.050.05DHA(g/100ml)0.150.150.15甘油(ml/100ml)222OEP(ral/100ml)0.250.250.25卵黃(ml/100ml)252525青黴素和/或鏈黴素(萬國際單位/100ml)555效果例20-22將實施例20-22得到的冷凍精液經過上述的通用操作步驟六的大管法解凍(45°C70秒)後，進行精子活力、彎尾率和頂體完整率的檢測，結果如表ll。表11實施例活力活率OO彎尾率(％)頂體完整率(％)實施例200.44±0.0555.35±4.9553.61±4.1162.84±9.04實施例210.41±0.0552.14±7.5157.91±3.7467.92±9.84實施例220.41±0.0554.18±8.5949.75±7.0460.02±8.01結果表明，精子密度為1.0X109個/ml時，解凍後精子活力和活率最高，但與其他兩組相比差異不顯著(乃0.05)。精子密度為1.5Xl(T個/ml時，解凍後精子彎尾率和頂體完整率最高，與其他兩組相比差異也不顯著("0.05)，三個密度下冷凍豬精子效果差異不顯著，在此範圍內用高密度精子進行冷凍是可行的。實施例23經過上述通用操作步驟一至四得到如表12的各成分的使用濃度的含有豬精液的混合溶液；然後根據步驟五進行大管法冷凍。表12^^■^^^^使用濃度^^^^實施例23豬精子(xl9個/inl)1.5乳糖(g/100ml)5.5016N-乙醯-D-氨基葡萄糖(g/100ml)0.05DHA(g/100ml)0.15甘油(ml/100ral)2OEP(ml/100ml)0.25卵黃(ml/100ml)25青黴素和/或鏈黴素(萬國際單位/100ml)5將上述得到的冷凍精液經過上述的通用操作步驟六的大管法解凍，但解凍條件如表13所示，然後進行精子活力、彎尾率和頂體完整率的檢測，結果如表13和圖3。表13解凍溫度('c)和解凍時間(s)融後溫度('C)活力活率(％)彎尾率(％)頂體完整率(%)37'C30s8.60.23±0.05"33.43±7.55c"31.50±8.34M56.44±8.t>537°C60s23.40.34±0.07,"43.76±6.2f40.64±5.36A,d58.90±7.76"b37°C90s29.20.43±007^Babc52.54±8.14"b48.03±3.90,56.35±3.60ABab45'C50s22.30.29±0.04,'39.10±7.72BM42.69±8.60*,58.63±5.43Aab45°C60s26.80.39±0.03,47.89±51.36±62.51±6.61"45°C70s31.60.45±0.04歸55.98±4.69A"51.49±2.79歸63.70±5.70"52°C25s8.90.39±0.06A,48.65±4.92歸51.27±4.90脇'65.40±4.86*°52'C35s21.60.46±0.04歸55.54±3.68Aa54.35±8.14Aa65.40±4.86*"52°C45s32.40.45±46.82±51.49±55.40±170.og脇7IQABaliL2.79歸9.51*B"b60°C20s11.00.43±0.07味45.34±4.29,34.01±56.61±7.5660。C30s21.40.48±0.05""47.58±6.13腸'43.76±48.76±6.18,c"60'C40s27.10.49±0,05"53.21±5.07*ab53.86±5.88"53.71±8.50,BCa"68°C20s14.20.49±0.07"52.07±7.55'ab35.77±5.58CDc"40.47±5.45Bcd68'C30s24.30.46±0.03,Bab47.89±2.43編"37.22±78341.23±9.25BCcd68'C40s30.80.47±0.07""51.21±4.06ABjb33.86±6.51""37.45±9.16Cd結果表明，45°C、70s、52°C、35s是5ral大管解凍效果較好的組合。實施例24經過上述通用操作步驟一至四得到如表14的各成分的使用濃度的含有豬精液的混合溶液；然後根據步驟五進行大管法冷凍。表14實施例24豬精子(xl9個/ml)1,5乳糖(g/100ml)5.50N-乙醯-D-氨基葡萄糖(g/100ml)0.05DHA(g/100ml)0.15甘油(ml/100ml)2OEP(ml/100ml)0.25卵黃(ml/100ml)25青黴素和/或鏈黴素(萬國際單位/100ml)5將上述得到的冷凍精液經過上述的通用操作步驟六的大管法解凍(45°C1870秒)後，精液經過檢測其精子的活力達到0.3-0.6，精子頂體完整率超過50%,完全符合目前人工授精的要求，在進行上述的通用操作步驟七的人工授精後，效果顯示如下上海白豬應用上述程序製備的精液進行人工輸精，一共輸精18頭母豬。結果13頭母豬妊娠產仔(受胎率72.2%)，平均每窩產仔7.8頭，最少的產2頭，最多的產12頭。小型梅山豬輸精22頭母豬。結果18頭母豬妊娠產仔(受胎率81.8%),平均每窩產仔8.6頭，最少的產4頭，最多的產13頭。以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，並非用以限定本發明的實質技術內容範圍，本發明的實質技術內容是廣義地定義於申請的權利要求範圍中，任何他人完成的技術實體或方法，若是與申請的權利要求範圍所定義的完全相同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋於該權利要求範圍之中。權利要求1.一種豬精液凍存液，其特徵在於，所述的凍存液每100ml中含有(a)5-20g乳糖；(b)0.005-0.05gN-乙醯-D-氨基葡萄糖；(c)0.05-0.5g二十二碳六烯酸；(d)1.0-5.0ml甘油；(e)0.2-1.5ml氨基-鈉-十二烷基硫酸脂(f)10-40ml卵黃；和(g)5-20萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。2.如權利要求1所述的凍存液，其特徵在於，所述的凍存液每100ml中含有(a)8—15g乳糖；(b)0.008—0.04gN-乙醯-D-氨基葡萄糖；(c)0.08—0.4gDHA;(d)1.5—4.Oml甘油；(e)0.3—1.OmlOEP;(f)15—30ml卵黃；禾口(g)8—15萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。3.—種如權利要求1所述的凍存液的用途，其特徵在於，所述的凍存液可用於保存豬精液。4.一種豬精液的處理方法，其特徵在於，所述的方法包括步驟(1)將豬精液和如權利要求1所述的凍存液混合，得到含豬精液的混合物；(2)將步驟(1)得到的混合物加入5ml大管；和(3)將裝有豬精液的大管投入液氮中凍存，得到冷凍保存的豬精液。5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，在步驟(1)得到的混合物中，豬精液的密度為0.5-4xl09個/ml;優選密度為0.8-3.0xl9個/ml。6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的步驟(1)包括以下步驟(l')將豬精液和乳糖、N-乙醯-D-氨基葡萄糖、DHA、卵黃、和青黴素和/或鏈黴素混合，得到含豬精液的初始混合物，在每100ml初始混合物中含有1—8g乳糖，0.008—0.05gN-乙醯-D-氨基葡萄糖，0.05—0.6gDHA，3—20ml卵黃，1.5—10萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素；和(l")將步驟(l')所得到的含豬精液的初始混合物和乳糖、甘油、OEP、卵黃、和青黴素和/或鏈黴素混合，得到如權利要求4的步驟(1)中所述的含豬精液的混合物。7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述的步驟(l')在室溫下進行；所述的步驟(1〃)在2—8。C進行；優選步驟(1〃)在3—6。C進行。8.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中得到的含豬精液的混合物每100ml中含有2—16g乳糖、0.004—0.03gN-乙醯-D-氨基葡萄糖、0.03—0.3gDHA、0.5—4ml甘油、0.125—1.0ml0EP、5—30ml卵黃、和2—10萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中得到的含豬精液的混合物每100ml中含有3.5—12g乳糖、0.006—0.02gN-乙醯-D-氨基葡萄糖、0.06—0.25gDHA、0.8—3ml甘油、0.18—0.7ml0EP、8—20ml卵黃、和3一8.5萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素；優選步驟(1)中得到的含豬精液的混合物每100ml中含有5.5—8.5g乳糖、0.008-0.013gN-乙醯-D-氨基葡萄糖、0.10—0.15gDHA、1.0—2.0ml甘油、0.25—0.5ml0EP、10—15ml卵黃、和5—7.5萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。10.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的方法還包括步驟(4)將步驟(3)得到的冷凍保存的豬精液和解凍液在25—7(TC混合10一100秒；所述的每100ml解凍液中含有2.0—8.0g葡萄糖、0.05—0.25gEDTA、0.3—1.2g擰檬酸三鈉、0.05—0.25g碳酸氫鈉、0.03—0.20g氯化鉀；優選在37—6(TC混合25—80秒。全文摘要本發明公開了一種豬精液凍存液，所述的凍存液每100ml中含有(a)5-20g乳糖；(b)0.005-0.05gN-乙醯-D-氨基葡萄糖；(c)0.05-0.5gDHA；(d)1.0-5.0ml甘油；(e)0.2-1.5mlOEP；(f)10-40ml卵黃；和(g)5-20萬國際單位的青黴素和/或鏈黴素。本發明還公開了一種豬精液的處理方法，並提示通過本發明提供的方法處理的豬精液經過檢測其精子的活力達到0.3-0.6，精子頂體完整率超過50％，完全符合目前人工授精的要求。文檔編號A01N1/02GK101595866SQ20081003864公開日2009年12月9日申請日期2008年6月6日優先權日2008年6月6日發明者東劉,吳華莉,吳彩鳳,張德福,戴建軍,殷方芝申請人:上海市農業科學院