凍幹水痘疫苗的製備方法
2023-06-25 19:40:31 1
專利名稱：凍幹水痘疫苗的製備方法
技術領域：
本發明屬於疫苗生產製備工藝技術領域，具體涉及一種水痘疫苗的製備方法。
背景技術：
水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)是水痘和帶狀皰疹的病原體。水痘為該病毒原發感染的表現，主要侵染兒童，以皮膚和黏膜上出現皰疹為特徵，本病症狀較輕，但傳染性很強，幾乎對20歲以下的絕大多數人感染，患病後終生免疫，一般不再發生第二次感染；帶狀皰疹則是一種散發疾病，為具有部分免疫的人由潛伏在脊髓後根神經節或腦神經感覺神經節的神經細胞內的潛伏水痘-帶狀皰疹病毒被激活後引起，患者主要為成年人，特別是那些正在接受免疫抑制劑治療的癌症患者和老年人，其特徵為脊髓神經後根及神經節發炎，由此神經支配的皮膚上出現皰疹，有疼痛或神經痛。水痘和帶狀皰疹均可伴有嚴重的併發症。
VZV屬皰疹病毒科α皰疹病毒亞科家族的成員。人是VZV的唯一宿主。體外分離培養VZV以人二倍體成纖維細胞(原代人胚肺纖維細胞、WI-38、MRC-5細胞)為佳。進行病毒傳代時，通常以接種感染細胞為主。VZV在體外極不穩定。
1974年，日本大阪大學微生物疾病研究所(BIKEN)的M.Takahashi先生建立了VZV Oka疫苗株。1981年，美國學者報導了KMcC株候選水痘疫苗。1994年，中國報導了北京株候選水痘疫苗的研製。目前在世界各地廣泛使用的水痘疫苗均為Oka株疫苗。臨床研究證明，Oka株水痘疫苗接種反應輕微，能誘導機體產生良好的、持久的免疫應答和保護效果。
目前，使用水痘減毒活疫苗進行普遍的兒童免疫接種已成為世界各國降低乃至切斷水痘流行的重要手段及趨勢。
發明內容
本發明提供了一種凍幹水痘疫苗的製備方法，以解決目前疫苗穩定性差的問題。本發明採取的技術方案是包括水痘病毒Oka株在MRC-5株人二倍體細胞中的擴增傳代、疫苗液收穫及凍幹，其特徵在於採用如下凍幹保護劑，終濃度為明膠0.5-1.2％(g/ml)；穀氨酸鈉0.6-1.2％(g/ml)；尿素0.3-0.9％(g/ml)；精氨酸0.05-0.2％(g/ml)。
本發明一種實施方式是取人二倍體細胞MRC-5按1∶2-1∶4比例，以pH7.2-7.6、添加10-15％小牛血清的MEM細胞培養基為細胞傳代用培養基，37℃下，培養3-5天擴增傳代，33代以內；待MRC-5細胞形成均勻、緻密的細胞單層後，更換pH7.2-7.6、含2-5％小牛血清的MEM培養基維持液，在培養瓶內按毒種與細胞接種比例1∶60-120加入水痘病毒Oka株感染細胞；當MRC-5細胞上出現75％以上典型病變時，倒去原維持液，用原維持液二倍體積以上的Earle’s液或PBS緩衝液洗滌細胞表面，洗去牛血清；加入含有0.3-2％人血白蛋白、3-10％蔗糖的199綜合培養基或PBS緩衝液疫苗液，收穫細胞培養物；將細胞培養物經-70℃以下凍融、20KHz超聲破碎細胞、過濾收集上清液，即為原液；原液內加入終濃度為明膠0.5-1.2％(g/ml)、穀氨酸鈉0.6-1.2％(g/ml)、尿素0.3-0.9％(g/ml)、精氨酸0.05-0.2％(g/ml)的凍幹保護劑製成半成品，檢定合格的半成品冰浴下將分裝於適宜的可藥用容器內，以適宜的凍幹方式進行凍幹；檢定合格即為凍幹水痘疫苗成品。
本發明的優點在於凍幹保護劑採用自行研製的疫苗凍幹保護溶液，確保疫苗穩定性良好，2～8℃保存穩定性試驗結果顯示保存18個月的樣品與0月樣品各項檢測結果沒有顯著差別。
具體實施例方式
實施例1取人二倍體細胞MRC-5按1∶2比例，以pH7.2、添加10％小牛血清的MEM細胞培養基為細胞傳代用培養基，37℃下，培養3天擴增傳代，33代以內；待MRC-5細胞形成均勻、緻密的細胞單層後，更換pH7.2、含2％小牛血清的MEM培養基維持液，在培養瓶內按毒種與細胞接種比例1∶60加入水痘病毒Oka株感染細胞；當MRC-5細胞上出現75％以上典型病變時，倒去原維持液，用相當於原維持液二倍體積以上的Earle’s液液洗滌細胞表面，洗去牛血清；加入含有0.3％人血白蛋白、10％蔗糖的199綜合培養基疫苗液，收穫細胞培養物；將細胞培養物經-70℃以下凍融、20KHz超聲破碎細胞、經澄清過濾後，即為原液；原液內加入終濃度為0.5％明膠、1.2％穀氨酸鈉、0.9％尿素、0.05％精氨酸的凍幹保護劑製成半成品，檢定合格的半成品冰浴下將分裝於適宜的可藥用容器內，以適宜的凍幹方式進行凍幹。
實施例2取人二倍體細胞MRC-5按1∶4比例，以pH7.6、添加12％小牛血清的MEM細胞培養基為細胞傳代用培養基，37℃下，培養5天擴增傳代，33代以內；待MRC-5細胞形成均勻、緻密的細胞單層後，更換pH7.4、含5％小牛血清的MEM培養基維持液，在培養瓶內按毒種與細胞接種比例1∶100加入水痘病毒Oka株感染細胞；當MRC-5細胞上出現75％以上典型病變時，倒去原維持液，用相當於原維持液2倍體積的PBS緩衝液洗滌細胞表面，洗去牛血清；加入含有2％人血白蛋白、3％蔗糖的PBS緩衝液疫苗液，收穫細胞培養物；將細胞培養物經-70℃以下凍融、20KHz超聲破碎細胞、經澄清過濾後，即為原液；原液內加入終濃度為1.2％明膠、0.9％穀氨酸鈉、0.6％尿素、0.1％精氨酸的凍幹保護劑製成半成品，檢定合格的半成品冰浴下將分裝於適宜的可藥用容器內，以適宜的凍幹方式進行凍幹。
實施例3取人二倍體細胞MRC-5按1∶3比例，以pH7.4、添加15％小牛血清的MEM細胞培養基為細胞傳代用培養基，37℃下，培養4天擴增傳代，33代以內；待MRC-5細胞形成均勻、緻密的細胞單層後，更換pH7.6、含3.5％小牛血清的MEM培養基維持液，在培養瓶內按毒種與細胞接種比例1∶120加入水痘病毒Oka株感染細胞；當MRC-5細胞上出現75％以上典型病變時，倒去原維持液，用原維持液3倍體積的Earle’s液洗滌細胞表面，洗去牛血清；加入含有1％人血白蛋白、8％蔗糖的199綜合培養基疫苗液，收穫細胞培養物；將細胞培養物經-70℃以下凍融、20KHz超聲破碎細胞、過濾收集上清液，即為原液；原液內加入終濃度為0.8％明膠、0.6％穀氨酸鈉、0.3％尿素、0.2％精氨酸的凍幹保護劑製成半成品，檢定合格的半成品冰浴下將分裝於適宜的可藥用容器內，以適宜的凍幹方式進行凍幹。
實施例4按實施例1-3生產的凍幹水痘疫苗的各項檢定結果如下表
實施例5，凍幹水痘疫苗的穩定性考察結果表1 加速穩定性試驗結果
表2 2～8℃保存效期內穩定性試驗結果
權利要求
1.一種凍幹水痘疫苗的製備方法，包括水痘病毒Oka株在MRC-5株人二倍體細胞中的擴增傳代、疫苗液收穫及凍幹，其特徵在於採用如下凍幹保護劑，終濃度為明膠0.5-1.2％(g/ml)；穀氨酸鈉0.6-1.2％(g/ml)；尿素0.3-0.9％(g/ml)；精氨酸0.05-0.2％(g/ml)。
2.權利要求1所述的凍幹水痘疫苗的製備方法，包括下列步驟1)以水痘病毒Oka株為毒種，MRC-5株人二倍體細胞為培養基質；2)用培養基對MRC-5株人二倍體細胞進行擴增傳代，其中細胞傳代比例為1∶2-1∶4，以37℃培養3～5天；3)待MRC-5株人二倍體細胞生長成均勻、緻密的單層細胞後，加入毒種感染細胞；4)當MRC-5株人二倍體細胞出現75％以上典型病變時，倒去原維持液，用相當於維持液2倍～3倍體積的洗滌液洗滌細胞表面；5)加入疫苗液收穫細胞培養物；6)將細胞培養物經-70℃以下凍融、20KHz超聲破碎細胞、經澄清過濾後，即為原液；7)原液內加入凍幹保護劑；8)冰浴條件下，分裝於最終容器內，凍幹。
3.如權利要求2所述的凍幹水痘疫苗的製備方法，其中步驟3)中維持液為pH7.2-7.6、含2-5％小牛血清的MEM培養基。
4.如權利要求2所述的凍幹水痘疫苗的製備方法方法，其中步驟3)毒種與細胞接種比例為1∶60～1∶120。
5.如權利要求2所述的凍幹水痘疫苗的製備方法方法，其中步驟4)洗滌液為Earle’s液或PBS緩衝液
6.如權利要求2所述的凍幹水痘疫苗的製備方法方法，其中步驟5)疫苗液為含0.3-2％人血白蛋白、3-10％蔗糖的199綜合培養基或PBS緩衝液。
全文摘要
本發明涉及一種凍幹水痘疫苗的製備方法，屬於生物技術領域。包括水痘病毒Oka株在MRC－5株人二倍體細胞中的擴增傳代、疫苗液收穫及凍幹，其特徵在於採用如下凍幹保護劑，終濃度為明膠0.5－1.2％(g/ml)；穀氨酸鈉0.6－1.2％(g/ml)；尿素0.3－0.9％(g/ml)；精氨酸0.05－0.2％(g/ml)。優點在於凍幹保護劑採用自行研製的疫苗凍幹保護溶液，確保疫苗穩定性良好，2～8℃保存穩定性試驗結果顯示保存18個月的樣品與0月樣品各項檢測結果沒有顯著差別。
文檔編號A61P31/00GK1927395SQ20061001713
公開日2007年3月14日 申請日期2006年8月25日 優先權日2006年8月25日
發明者朱昌林, 魏巍, 孫會來, 孔維, 王忠誠, 郭麗姝, 萬鐵軍, 曾智, 姜春來 申請人:長春百克生物科技有限公司