豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋白共表達載體及其構建和表達方法

2023-06-26 02:35:31

豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋白共表達載體及其構建和表達方法
【專利摘要】本發明公開了豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋白共表達載體及其構建和表達方法，所述的共表達載體基於分子克隆技術將豬瘟病毒的主要囊膜蛋白(E2c)和非結構蛋白(NS2-3c)及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白(E2b)和非結構蛋白(NS2-3b)的編碼基因分別與雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-1連接。本發明的共表達載體能夠同時表達豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋白，可用於製備多價亞單位疫苗、防控豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒。
【專利說明】豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋 白共表達載體及其構建和表達方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋白共 表達載體，屬於生物基因工程領域。

【背景技術】
[0002] 豬癌（Classical swine fever，CSF)是由豬癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)引起豬的一種高度接觸性、致死性的傳染病，臨床上以發病急、高熱稽留、全身 泛發性點狀出血和脾梗死為主要特徵，給全世界養豬業造成了巨大的經濟損失。近年來，豬 瘟在亞洲、歐洲、南美洲等地區呈現復發的趨勢，其流行趨勢發生了很大的變化，呈現典型 豬瘟和非典型豬瘟共存，隱性感染和持續感染並現，以及豬瘟疫苗免疫失敗的現象。牛病毒 性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV)與豬癌病毒同屬黃病毒科、癌病毒屬成 員。BVDV不僅感染牛，而且能感染豬、綿羊、山羊及野生動物，很多國家地區的研究證實了 BVDV在豬群中存在不同程度的感染。豬感染BVDV可出現類似豬瘟的臨床症狀和病理變化， 導致繁殖障礙、產仔數下降和流產。此外，先天性感染的仔豬出生後還可能形成持續感染和 免疫耐受，並長期帶毒。
[0003] 目前，世界各國主要推廣使用的豬瘟疫苗為弱毒疫苗，這種疫苗存在安全性不高， 無法區分野毒感染和免疫接種，以及弱毒疫苗返強等缺陷。當前控制BVDV感染的手段為傳 統的滅活疫苗和基因修飾弱毒疫苗接種，但滅活疫苗只能起到部分保護，而BVDV基因修飾 弱毒疫苗會抑制機體淋巴細胞和中性粒細胞的活性，產生免疫抑制，增強其他病毒的致病 力。此外，在CSFV和BVDV弱毒疫苗的生產過程中，使用BVDV汙染的血清，造成了疫苗的汙 染更增加了病毒的潛在傳播。
[0004] 近年來，本領域也開始嘗試使用病毒活載體疫苗、DNA疫苗、基因缺失疫苗等新型 疫苗，但這類疫苗無法避免使用過程中基因重組的問題，導致其防治效果不穩定。
[0005] 因此本領域亟待發明一種可以長期使用而不產生毒力返強，培養生產過程中避免 使用血清，並且能有效預防和控制豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒感染的多價亞單位疫苗。


【發明內容】

[0006] 針對現有技術的需要，本發明公開了一種豬癌病毒（Classical swine fever virus，CSFV)和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV)的主要囊膜蛋 白（E2)和非結構蛋白（NS2-3)共表達載體，能夠在宿主菌中同時表達CSFV主要囊膜蛋白 (E2 C)和非結構蛋白（NS2-3J及BVDV主要囊膜蛋白（E2b)和非結構蛋白（NS2-3b)，並且蛋 白的免疫原性不受破壞和改變。
[0007] 為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的：
[0008] 豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋白共表達載體，是在 同一宿主菌中表達的雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-Ι，二者分別連接有豬瘟病毒的 主要囊膜蛋白E2。和非結構蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2b和非結 構蛋白NS2-3b的編碼基因，雙表達載體與編碼基因的連接關係為ρΕΤ0ικ^-Ε2ε-Ν52-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b。
[0009] 本發明所用的載體pETDuet-1、pRSFDuet-1是雙表達載體，每一個載體上有兩個 啟動子，屬於單一載體雙啟動子系統，每一個蛋白的編碼基因都有獨立的一個啟動子，每個 啟動子獨立驅動外源蛋白的表達。
[0010] 與傳統的構建融合基因相比，本發明的雙表達載體避免了基因之間的相互影響， 保證了蛋白穩定表達，克服了串聯表達表達量不足的缺點。並且通過在同一宿主菌中表達 的雙質粒表達系統，pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι作為複製子相同不相容的兩個質粒，在Amp 和Kana兩種抗生素存在的壓力下子代菌能夠有效存活，不會被抗生素殺死，從而可以同時 轉化進入同一宿主菌後有效的表達外源基因。
[0011]為了便於規模化生產，降低培養難度，本發明所用的宿主菌為大腸桿菌，其培養簡 單，可以採用發酵罐實現規模化生產，從而有效控制質量，保證疫苗生產的安全性和有效 性。
[0012] 常規的生物工程中所用的大腸桿菌均可用於本發明，包括大腸桿菌BL21(DE3)，和 BL21(DE3)PLySs 等。
[0013] 相應的，本發明公開了上述共表達載體的構建方法，通過將豬瘟病毒的主要囊 膜蛋白E2。和非結構蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2 b和非結構蛋白 NS2-3d^編碼基因連接到雙表達載體pETDuet-UpRSFDuet-Ι中，具體的製備過程包括下述 步驟：
[0014] 1)擴增豬瘟病毒的主要囊膜蛋白E2。和非結構蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒 的主要囊膜蛋白E2 b和非結構蛋白NS2-3b的編碼基因；
[0015] 2)利用 Nde I 酶切 pETDuet-1、pRSFDuet-Ι 和 pET-32a (+)載體，將酶切後的 pETDuet-UpRSFDuet-Ι分別與pET-32a(+)載體酶切回收後的Trx-tag序列片段連接得到 改造後的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι載體；
[0016] 3)將改造後的pETDuet-1、pRSFDuet-Ι載體分別進行EcoR I、Pst I雙酶切和 Pst I、Hind III雙酶切，豬瘟病毒的主要囊膜蛋白E2。編碼基因用EcoR I、Pst I雙酶 切，牛黏膜病毒的非結構蛋白NS2-3b編碼基因用Pst I、Hind III雙酶切；將雙酶切之 後的pETDuet-1、pRSFDuet-Ι載體分別與雙酶切後的豬瘟病毒主要囊膜蛋白E2。編碼基 因、牛病毒性腹瀉病毒非結構蛋白NS2-3 b編碼基因連接得到表達載體pETDuet-l-E2。和 pRSFDuet-l-NS2-3b；
[0017] 4)對步驟3)所得表達載體pETDuet-l-E2。進行Bglll、Xho I雙酶切，表達載體 pRSFDuet-l-NS2-3b進行Nae I、Xho I雙酶切，同時用Bgl II、Xho I雙酶切豬瘟病毒非結 構蛋白NS2-3。編碼基因，用Nae I、Xho I雙酶切牛病毒性腹瀉病毒主要囊膜蛋白E2b編碼 基因，將上述雙酶切後的表達載體與病毒蛋白編碼基因進行連接，構建pETDuet-E2 e-NS2-3c 和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 雙表達載體。
[0018] 通過上述製備過程，將E2b和NS2_3b編碼基因經酶切、連接、轉化後插入雙表達載 體pETDuet-Ι，將NS2-3 b和E2b編碼基因插入雙表達載體pRSFDuet-Ι，然後把攜帶四個蛋白 對應的編碼基因的兩個載體共同轉化入一個宿主菌，實現高線穩定的同時表達四種蛋白， 這是本發明與現有技術中的其它技術方案相比所具有的突破性的技術優勢。
[0019] 其中，步驟1)的編碼基因即可從相關的生物製品公司和實驗室購買成品或者合 成，也可以豬瘟病毒株、牛病毒性腹瀉毒株的基因組為模版結合相應的特異性引物採用PCR 方法自行擴增，可採用的引物序列對應如下所示：
[0020] E2C-F ： CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC (含 EcoR I 酶切位點）
[0021] E2C-R ：GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT (含 Pst I 酶切位點）
[0022] NS2-3C-F ：CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG(含 BglII 酶切位點）
[0023] NS2-3C-R ：CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG (含 Xho I 酶切位點）
[0024] NS2-3b-F ：CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG (含 Pst I 酶切位點）
[0025] NS2-3b-R ：CATAAGCTTTTACGCGTTCTGATCAAAATCAG(含 Hind III 酶切位點）
[0026] E2b-F :CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG (含 Nae I 酶切位點）
[0027] E2b-R ：CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA (含 Xho I 酶切位點）
[0028] PCR的條件和參數採用本領域常規實驗條件即可。
[0029] 其中，步驟 2)採用 Nde I 對 pETDuet-1、pRSFDuet-Ι 和 pET_32a(+)酶切，切開的 pET-32a(+)的315bp小片段作為Trx-tag回收，再將切開的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι分 別與Trx-tag小片段連接，將讀碼框正確插入的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι在大腸桿菌中擴 增。通過此種方式，本發明利用pETDuet-1、pRSFDuet-Ι第二個多克隆位點（MCS2)的Nde I位點插入了 Trx-tag,使表達的外源蛋白在N端融合Trx標籤，改善了蛋白的可溶性。
[0030] 通過上述構建方法所得到的共表達載體在菌株中誘導表達的四種抗原蛋白以包 涵體形式存在，純化的蛋白經Western-blot檢測表明，能夠與抗CSFV和抗BVDV的陽性血 清發生反應，證明表達的多種蛋白具有很好的免疫原性。
[0031] 在此基礎上，本發明公開了所述共表達載體的表達方法，將共表達載體轉化到同 一宿主菌進行塗板，過夜培養，挑取單克隆菌落接種於LB培養基中，搖菌過夜，轉接至新LB 培養基中，加入IPTG進行誘導。
[0032] 其中，培養最終達到0D值0· 6-0. 8,所用IPTG濃度為(λ 8mmol/L。
[0033] 其中，所用的載體菌株採用適合於外源蛋白表達的菌株，優選的是BL21 (DE3)、 BL21(DE3)PLySs 等。
[0034] 與傳統的疫苗相比，用本發明所涉及的共表達方法製備的疫苗可以用發酵罐規模 化生產，實現質量控制，保證所生產的疫苗安全有效；本發明涉及的疫苗用抗原是蛋白質， 與其他新型疫苗（如活載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失疫苗）相比不會發生可能出現基因重 組問題，因此不存在生物安全性問題，可大規模推廣應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖 1 為 pETDuet-E2e-NS2-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 的酶切結果，其中 1 為 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 的雙酶切，2 是 pETDuet-ESc-NSS-S。的雙酶切，Μ 是 lOOOObp Marker ;
[0036] 圖2是共表達載體在大腸桿菌中表達的四種免疫蛋白表達的SDS-PAGE圖，其 中：Μ為蛋白質分子質量標準；1為未誘導的菌體；2為質粒pETDuet-E2 e-NS2-3。；3為質粒 pRSFDuet-NS2-3b-E2b ;4 為質粒 pETDuet-E2e-NS2-3。和質粒 pRSFDuet-NS2-3b-E2b
[0037] 圖3是四種表達的蛋白抗原性效果圖，其中1是未誘導的菌體；2為表達的蛋白與 標籤抗體的反應；3為表達的蛋白與陽性血清的反應；4為表達的蛋白與陰性血清的反應。

【具體實施方式】
[0038] 在下述實施例中， 申請人:提供了一種具體的共表達載體構建和表達過程，並且詳 細描述了所用原料的來源，僅為示意，並非構成特別限定。本領域技術人員採用符合公知定 義的相關原料和實驗條件也可實現本發明的發明目的。
[0039] 在下述實施中，所用原料來源如下：
[0040] 豬瘟病毒株：石門株（Shimen)，實驗室常規保存，也可從其他實驗室或國家菌種 保藏中心購買。
[0041] 牛病毒性腹瀉毒株：VEDEVAC，實驗室保存，也可從其他實驗室或國家菌種保藏中 心購買。
[0042] pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 雙表達載體，pET_32a(+)載體，均購自 Novagen 公司。
[0043] BL21(DE3)是四個外源蛋白的表達宿主菌，購自北京全式金生物技術有限公司。
[0044] 所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0045] 所用酶和試劑：限制性內切酶 Nde I、Bgl II、EcoR I、Pst I、Hind III、Nae I、 Xho I，T4DNA連接酶、PrimeSTAR HS DNA Polymerase聚合酶和AMV反轉錄酶均購自大連 寶生物有限公司；IPTG、SDS (十二燒基橫酸鈉）、核酸Marker、Agarose DNA extraction kit、DNA快速純化回收試劑盒和質粒快速提取試劑盒均購自大連寶生物工程公司；QIAamp Viral RNA Mini Kit,購自QIAGEN公司；瓊脂糖購自Invitrogen公司；預染蛋白Marker購 自 Fermentas 公司。
[0046] 實施例1 :共表達載體的構建
[0047] 1. E2C、NS2-3C、NS2-3b和E2b蛋白編碼基因的擴增
[0048] 按QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說明提取 Shimen株PK15 細胞上清和VEDEVAC 株MDBK細胞培養上清的病毒RNA。以E2e-R、NS2-3e-R、NS2-3b-R、E2 b-R為反轉錄引物進行 反轉錄，合成cDNA。然後分別以此為模板擴增出各個目的基因。
[0049] RT-PCR 25 μ L 反應體系：PrimeSTAR 0· 25 μ L，5XPrimeSTAR 緩衝液 5 μ L，dNTP 2 μ L，上、下遊引物各1 μ L，模板3 μ L，去離子水12. 75 μ L。PCR產物用DNA膠回收試劑盒 回收，從而得到四個蛋白目的蛋白的編碼基因。
[0050] 2. pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 載體的改造
[0051] 將 pETDuet-Ι 和 pRSFDuet-Ι 和 pET_32a(+)載體分別用 Nde I 酶切，40 μ L 酶切體 系：10ΧΗ緩衝液4μ L，Nde I各2μ L，載體24μ L，去離子水10μ L。
[0052] 用膠回收試劑盒回收切開的pETDuet-1和pRSFDuet-1，將切開的pET-32a(+)的 315bp小片段（即Trx-tag編碼基因）也同樣回收；再將切開的pETDuet-Ι和pRSFDuet-1 分別與315bp的Trx-tag編碼基因連接，連接體系：10XT4DNALigase Buffer 2.5yL， Trx-tag 編碼基因膠回收產物 14μ L，pETDuet-l 或者 pRSFDuet-12y L，T4DNALigase 1 μ L， 去離子水5. 5 μ L。對改造後的載體進行測序。
[0053] 3. pETDuet-l-E2c 和 pRSrouet-l-NS2_3b 載體的構建
[0054] pETDuet-1 和 pRSFDuet-1 兩個載體分別進行 EcoR I、Pst I 雙酶切和 Pst I、Hind m雙酶切，40 μ L酶切體系：10XH或10XΜ緩衝液4 μ L，對應的限制性內切酶各2 μ L，載 體24 μ L，去離子水10 μ L。
[0055] 酶切產物經1%瓊脂糖電泳後膠回收。
[0056] E2。編碼基因用EcoR I、Pst I雙酶切，NS2-3b編碼基因用Pst I、Hind III雙酶 切；40yL酶切體系：10XH或10XM緩衝液4yL，對應的限制性內切酶各2yL，目的基因 24 μ L，去離子水10 μ L。
[0057] 酶切產物經1 %瓊脂糖電泳後膠回收，然後分別與雙酶切的pETDuet-1、 pRSFDuet-1的載體連接，兩個連接體系分別是：①10XT4DNA Ligase Buffer 2.5yL， E2C 編碼基因膠回收產物 14yL，pETDuet-12yL，T4DNALigase lyL，去離子水 5.5yL; ② 10XT4DNALigase Buffer 2· 5μ L，NS2-3b 編碼基因膠回收產物 14μ L，pRSFDuet-12y L， T4DNALigase lyL，去離子水 5.5yL。
[0058] 16°C連接過夜，分別轉化Transl09感受態細胞，挑取單克隆菌落分別進行 菌液PCR鑑定、酶切鑑定，並對構建的載體測序，確定成功構建了 pETDuet-l-E2。和 pRSFDuet-l-NS2-3b 表達載體。
[0059] 4· ρΕΤ0ι?Θ?-Ε2ε-Ν52-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 載體的構建
[0060] 對 pETDuet-l-E2。和 pRSFDuet-l-NS2-3b*別進行 Bgl II、Xho I 和 Nae I、Xho I 雙酶切，40 μ L酶切體系：10XH或10XL緩衝液4 μ L，限制性內切酶各2 μ L，載體24 μ L， 去離子水10 μ L。
[0061] 酶切產物經1%瓊脂糖電泳後膠回收。
[0062] 用Bgl II、Xho I雙酶切NS2-3。編碼的基因，用Nae I、Xho I雙酶切E2b編碼的基 因，40 μ L酶切體系：10XH或10XL緩衝液4 μ L，限制性內切酶各2 μ L，目的基因24 μ L， 去離子水10 μ L。
[0063] 酶切產物經1 %瓊脂糖電泳後膠回收。回收的酶切產物分別與雙酶切後的 pETDuet-l-E2。和卩1--〇116卜1-呢2-313載體連接，兩個連接體系分別是：①10XT4DNALigase Buffer 2. 5 μ L，NS2-3。編碼基因回收產物 14 μ L，pETDuet-l-E2。回收產物 2 μ L， T4DNALigase 1 μ L，去離子水 5. 5 μ L ;② 10 X T4DNALigase Buffer 2. 5 μ L，E2b 的編碼基 因膠回收產物14以1^，？1--〇1?^-1-呢2-313回收產物2yL，T4DNA Ligase lyL，去離子水 5. 5 μ L〇
[0064] 16°C連接過夜，分別轉化Transl09感受態細胞，挑取單克隆菌落分別進行菌 液PCR鑑定、酶切鑑定，並對構建的載體測序，確定成功構建了 pETDuet-E2e-NS2-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 表達載體（參考圖 1)。
[0065] 實施例2 :共表達載體的表達
[0066] 將 pETDuet-E2e-NS2-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b 表達載體各 0· 5 μ L，同時轉化 BL21(DE3)宿主菌，塗板，過夜培養，挑取單克隆菌落接種於新鮮10mL LB培養基中，搖菌過 夜，按1 : 100比例轉接新鮮10mL LB培養基中，0D值達0. 6-0. 8時取lmL菌液作為未誘導 樣品，其餘加入終濃度〇. 8mM的IPTG，誘導4h，每小時收取lmL菌液樣品。
[0067] 表達完成後，進行SDS-PAGE檢測以確定表達是否有效。
[0068] SDS-PAGE溶液組成如下：
[0069] Tris-甘氨酸緩衝液：25mmol/L Tris、250mmol/L 甘氨酸（pH 8. 0)、0· 1 % SDS。
[0070] 2XSDS Loading buffer :100mmol/L Tris Cl (ρΗ8· 0)、200mmol/L 疏基乙醇、4% SDS、0. 2%溴酚藍、20%甘油。
[0071] 考馬斯亮藍染色液：45mL甲醇、45mL水、10mL冰醋酸中溶解0. 25g考馬斯亮藍 R250。
[0072] 脫色液：30%甲醇、10%冰乙酸，蒸餾水補體積至100mL。
[0073] SDS-PAGE檢測過程如下：
[0074] (1)洗淨玻璃板，固定在電泳槽上，用2. 0%瓊脂糖封邊。常規方法配製15%的分 離膠5mL，迅速注入兩玻璃板之間，膠頂覆蓋lmL雙蒸水。待分離膠凝固後傾出覆蓋層液體， 用去離子水衝洗凝膠頂部數次，倒置空幹液體，加入2mL 5%的濃縮膠溶液，插上梳子，垂直 放置電泳槽使其凝固。
[0075] (2)小心移去梳子，在電泳裝置上、下槽間加入Tris-甘氨酸緩衝液，用注射器衝 洗加樣孔數次，將電源負極與上槽相連。
[0076] (3)收集的菌液12000rpm離心2min，用50 μ LpH7. 4的PBS懸浮，加入等體積的 2XSDS上樣buffer，混勻，水浴煮沸lOmin，用微量進樣器上樣10yL，打開電源，用80V電 壓電泳至溴酚藍進入分離膠，把電壓提高到120V，繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部。
[0077] (4)染色：取下凝膠用蒸餾水衝洗，用5倍凝膠體積的考馬斯亮藍染色液浸泡凝 膠，放在脫色搖床上室溫染色3h。
[0078] (5)脫色：用30%甲醇、10%冰乙酸的混合液，在脫色搖床上脫色過夜，其間更換 染色液3?4次。待藍色背景完全脫淨後，將凝膠浸入蒸餾水中終止脫色。
[0079] 結果如附圖2所示，由附圖2可見，成功實現了四種蛋白的共表達。
[0080] 在上述基礎上，本發明還進行了四種蛋白的免疫原性檢測（Western Blot)， SDS-PAGE結束後，取下凝膠，切掉濃縮膠，根據分離膠的大小裁剪PVDF膜，然後將膜在甲醇 中浸泡20s，轉移至去離子水中漂洗一下，最後置於蛋白轉移液中浸泡5min。在蛋白轉移 液中按照濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙的順序鋪好，注意凝膠對應負極，膜對應正極，夾緊夾子， 放入轉移槽內，接通電源，350mA轉漬150min，將蛋白轉印至PVDF膜上。將膜置於5%脫脂 奶粉中封閉非特異性蛋白質，室溫，2h。將膜置於標籤抗體或陽性血清工作液中，在搖床上 4°C搖晃過夜，PBST洗膜4次，每次15min，將膜置於二抗工作液中，在搖床上，室溫搖晃孵育 1. 5h，PBST洗膜4次，每次15min。洗滌結束後，用去離子水清洗PVDF膜一次，稍微晾乾，將 膜置於塑料保鮮膜內，在暗室中等量混合ECL顯色系統中A、B液，滴加至PVDF膜上，作用 lmin ;裁剪X-膠片，放在膜上，蓋上膠片夾，曝光適當時間，取出膠片顯影，定影，掃描膠片， 進行分析。
[0081] 參考圖3所示，顯示了本發明的共表達載體表達的蛋白與血清的免疫反應效果， 顯示了本發明共表達的四種蛋白具有良好的免疫原性。
【權利要求】
1. 豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白和非結構蛋白共表達載體，其特徵 在於在同一宿主菌中表達的雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-Ι上分別連接有豬瘟病毒的 主要囊膜蛋白E2。和非結構蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2 b和非結 構蛋白NS2-3b的編碼基因，雙表達載體與編碼基因的連接關係為ρΕΤ0ικ^-Ε2 ε-Ν52-3。和 pRSFDuet-NS2-3b-E2b。
2. 根據權利要求1的共表達載體，其特徵在於宿主菌為大腸桿菌。
3. 權利要求1的共表達載體的構建方法，其特徵在於包括將豬瘟病毒的主要囊膜蛋白 E2。和非結構蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2b和非結構蛋白NS2-3b的 編碼基因連接到雙表達載體pETDuet-1、pRSFDuet-Ι的步驟。
4. 根據權利要求3的構建方法，其特徵在於具體包括下述步驟：1)擴增豬瘟病毒的主 要囊膜蛋白E2。和非結構蛋白NS2-3。及牛病毒性腹瀉病毒的主要囊膜蛋白E2 b和非結構蛋 白 NS2-3b 的編碼基因；2)利用 Nde I 酶切 pETDuet-l、pRSFDuet-l 和 pET-32a(+)載體，將 酶切後的pETDuet-l、pRSFDuet-l分別與pET-32a(+)載體酶切回收後的Trx-tag序列片段 連接得到改造後的pETDuet-Ι和pRSFDuet-Ι載體；3)將改造後的pETDuet-l、pRSFDuet-l 載體分別進行EcoR I、Pst I雙酶切和Pst I、HindIII雙酶切，豬瘟病毒的主要囊膜蛋白 E2C編碼基因用EcoR I、Pst I雙酶切，牛黏膜病毒的非結構蛋白NS2-3b編碼基因用Pst I、 Hind III雙酶切；將雙酶切之後的pETDuet-1、pRSFDuet-Ι載體分別與雙酶切後的豬瘟病 毒主要囊膜蛋白E2。編碼基因、牛病毒性腹瀉病毒非結構蛋白NS2-3 b編碼基因連接得到表 達載體 pETDuet-l-EZ。和 pRSFDuet-l-NS2-3b ;4)對步驟 3)所得表達載體 pETDuet-l-E2c 進行Bgl II、Xho I雙酶切，表達載體pRSFDuet-l-NS2-3b進行Nae I、Xho I雙酶切，同時 用BglII、Xho I雙酶切豬瘟病毒非結構蛋白NS2-3。編碼基因，用Nae I、Xho I雙酶切牛病 毒性腹瀉病毒主要囊膜蛋白E2b編碼基因，將上述雙酶切後的表達載體與病毒蛋白編碼基 因進行連接，構建pETDuet-E2 e-NS2-3。和pRSFDuet-NS2-3b-E2b雙表達載體。
5. 根據權利要求4的構建方法，其特徵在於步驟1)以豬瘟病毒基因組為模版，擴增出 主要囊膜蛋白E2。和非結構蛋白NS2-3。的編碼基因，以牛病毒性腹瀉病毒基因組為模版，擴 增出主要囊膜蛋白E2 b和非結構蛋白NS2-3b的編碼基因。
6. 根據權利要求5的構建方法，其特徵在於各編碼基因對應的引物分別為 E2C-F ：CTCGAATTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGATTAC E2C-R ：GGCCTGCAGACCAGCGGCGAGTTGTTCTGT NS2-3C-F ：CGCAGATCTAGGGCCTGCCGTTTGCAAGAAG NS2-3C-R ：CCGCTCGAGTAGACCAACTACTTGTTTTAG NS2-3h-F ：CGCCTGCAGGGGCCTGCCGTGTGTAAGAAG NS2-3h-R ：CATAAGCTTITACGCGTTCTGATCAAAATCAG E2h-F ： CGCGCCGGCCACTTGGATTGCAAACCTG E2h-R : CCGCTCGAGCCCTAAGGCCTTCTGTTCTGA。
7. 權利要求1的共表達載體的表達方法，其特徵在於將共表達載體轉化到同一宿主菌 進行塗板，過夜培養，挑取單克隆菌落接種於LB培養基中，搖菌過夜，轉接至新LB培養基 中，加入IPTG進行誘導。
8. 根據權利要求7的表達方法，其特徵在於培養最終達到0D值0. 6-0. 8,所用IPTG濃 度為 0. 8mmol/L。
【文檔編號】C12N15/66GK104152479SQ201410377167
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月1日 優先權日:2014年8月1日
【發明者】周繼章, 宮曉煒, 曹小安, 李兆才, 陳啟偉 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所