Morphine在製備治療帕金森病的藥物中的應用的製作方法
2023-06-26 07:46:51 1
專利名稱：Morphine在製備治療帕金森病的藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及Morphine在製備治療帕金森病的藥物中的應用，確切地說涉及 Morphine的醫藥新用途，屬醫藥技術領域。
背景技術：
嗎啡是鴉片中最主要的生物鹼，低濃度的嗎啡可以保護神經細胞免受缺血再灌注 的損傷。使用嗎啡預處理後進行缺血再灌注，神經元存活率得到明顯提高。這種保護作 用是通過鴉片受體的激活實現的(Lim， YJ， Zheng， S and Zuo， Z. Morphin印reconditions Purkinje cells against cell death under in vitro simulatedischemiar印erfusion conditions. Anesthesiology 2004 ;100 :562-568)。所以，嗎啡對神經元的保護作用可能 對臨床醫療有非常積極的作用。然而，嗎啡保護神經元免於1 +的作用尚未報導。
MPP+是1-甲基-4-苯基_1，2，3，6-四氫妣啶(l-methyl-4-phenyl-l， 2， 3， 6-tetrahydropyridine， MPTP)經過單胺氧化酶B (MA0-B)催化後生成的具有細胞毒 性的活性代謝產物，它與線粒體複合物-I結合抑制其活性，使細胞線粒體ATP的下 降和膜電位的破壞，最終導致線粒體功能障礙和氧自由基生成增加，細胞凋亡。MPP+ 通常用來做帕金森病的細胞模型，MPP+抑制PC12細胞的生長增殖，誘導細胞凋亡 (Jie Bai， Hajime Nakamura， Shugo Ueda， Yong_Won Kwon， Toru Tanaka， Sadayuki Ban， and Junji YodoiProteasome—dependent Degra_dation of CyclinDl in l_Methyl_4_phenylpyridinium Ion(MPP+)-induced Cell Cycle Arrest. J. Biol. Chem.， 2004 ;279 :38710-38714.)。 硫氧還蛋白(thioredoxin， Trx)是一種普遍存在於原核生物和真核生物中的 小分子蛋白質，它與NAPDH和硫氧還蛋白還原酶共同組成細胞內主要的氧化還原系統。 Trx-1是生物體所必須的基因，如果選擇性地敲除小鼠的Trx-l基因，會造成小鼠早期 胚月臺至文死(Matsui M. ， Oshima M. ， Oshima H. ， Takaku K. ， Maruyama T. ， Yodoi J. ， and Taketo M. M. Early embryonic lethality caused by targeteddisruption of the mouse thior-edoxin gene. Dev. Biol. 1996， 178 :179-185)。作為細胞內的抗氧化劑，Trx-1能保 護細胞、減輕氧化應激所致的損傷，並且能抑制p38MAPK和凋亡信號調節激酶1活性，增強 細胞的抗凋亡能力(Saito M. ， Nishitoh， H. ， Fujii， M. ， Takeda， K. ， Tobiume， K. ， Sawada， Y. ， Kawabata， M. ， Miyazono， K. ， and Ichijyo， H. Mammalian thioredoxin is a direct inhibitorof apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1. EMBO，1998，17 :2596-2606 ; Hashimoto S. ， Mats咖oto K. ， Gon Y. ， Furuichi S. ， Maruoka S. ， Takeshi ta I.， Hirota K. ， Yodoi J. ， and Horie T.Thioredoxin negatively regulates p38 MAPkinase activation and IL_6 production by tumor necrosis factor—alpha. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1999,258 :443-447)。到目前為止，Trx與人類疾病有關的研究很多，Trx具 有保護神經元抑制帕金森病的作用(Thioredoxinsuppresses l-methyl-4-phenylpyri dinium—induced neurotoxicity in rat PC12cells. Bai J， Nakamura H， Hattori I，Lett. 2002Mar 15 ;321(1-2) :81-4.Does thioredoxin-l prevent mitochondria—andendoplasmic reticulum—mediated neurotoxicity of l_methyl_4_phenyl_l，2，3，6—tetrahydropyridine Bai J，Nakamura H，Kwon YW，Tanito M， Ueda S， Tanaka T， Hattori I， Ban S， Momoi T， Kitao Y， Ogawa S， Yodoi J Antioxid RedoxSignal. 20079(5) :603-8)。 迄今為止，現有技術中未見Morphine保護神經元免受MPP+損傷的作用的報導。
發明內容
本發明旨在提供Morphine的醫藥新用途，則發明一種Morphine在製備治療帕金 森病的藥物中的應用。 本發明的上述目的是用下面的技術方案得以實現的
Morphine在製備治療帕金森病的藥物中的應用。 本發明經四噻唑藍(MTT)法，發現Morphine能促進大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12 細胞)的生長。Morphine具有促進神經細胞增殖的活性，並且抑制帕金森毒性物MPP+( l-Methyl-4-Phenylpyridinium ion)導致的神經細胞的損傷；蛋白質免疫印跡法表明， Morphine可以誘導PC12細胞中硫氧還蛋白的表達水平。因此，Morphine保護神經細胞免 於MPP+毒性與誘導硫氧還蛋白表達有關。
圖1 :四噻唑藍(MTT)法測定morphine對PC12細胞的存活率的影響； 圖2 :四噻唑藍(MTT)法測定morphine對MPP+剌激的PC12細胞的保護作用； 圖3 :Western Blot檢測morphine對MPP+剌激的PC12細胞Trx蛋白表達的影響。
具體實施例方式
下面用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此來限定本 發明。 實施例1 :把Morphine (Morphine購自瀋陽第一製藥廠)250mg，溶於1000ml水中 製成0. 25%濃度的水溶液加熱溶解，混合均勻後，裝入藥瓶中密封，消毒製成產品。
實施例2 :把Morphine (Morphine購自瀋陽第一製藥廠)125mg，溶於1000ml水中 製成0. 125%濃度的水溶液加熱溶解，混合均勻後，裝入藥瓶中密封，消毒製成產品。
實施例3 :把Morphine (Morphine購自瀋陽第一製藥廠)2500mg，溶於1000ml水中 製成水溶液，加熱溶解，混合均勻後，分裝成5mg/2ml/支濃度的注射液於藥瓶密封，消毒制 成產品。 實施例4 :把Morphine (Morphine購自瀋陽第一製藥廠)1500mg，溶於1000ml水中 製成水溶液，加熱溶解，混合均勻後，分裝成3mg/2ml/支濃度的注射液於藥瓶密封，消毒制 成產品。 實施例5 :把Morphine (Morphine購自瀋陽第一製藥廠)5000mg，溶於1000ml水中 製成水溶液，加熱溶解，混合均勻後，分裝成10mg/2ml/支濃度的注射液於藥瓶密封，消毒
4製成產品。 實施例6 :取100克Morphine (Morphine購自瀋陽第一製藥廠)、560克微晶纖維 素、380克無水乳糖、200克硬脂酸鎂、30克氧化矽，按公知的製片技術和裝備製成片劑，即 取上述配方中除硬脂酸鎂外所有成分混合25-30分鐘，再篩入硬脂酸鎂，繼續混勻，爾後用 12/32英寸(約1. 03cm)標準凹衝壓成片。 下面結合附圖，用本發明的試驗例來證明本發明的藥理效果，描述本發明的具 體實驗方法，但並不以此來限定本發明，本發明的內容不局限於此。通過下列實驗證明 Morphine能促進PC12細胞生長和保護PC12細胞免於帕金森病毒性物損傷。
下述的試驗例所用的試劑、儀器為 細胞用PC12細胞大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞，購自中國科學院昆明動物所。
藥品及主要試劑 Morphine購自瀋陽第一製藥廠；MPP+購自美國sigma公司；一抗Anti-mouseTrx， 由日本京都大學澱井溶司教授提供；一抗Anti-mouse P-actin購自santa ;Protein Marker購自Fermentas公司；RPMI Medium 1640購自Invitrogencorporation ;蛋白質 定量試劑盒(BCA法)購自Bio-Rad公司；Chemiluminesentsubstrate購自生物晶美公 司;PVDF膜購自Millipore公司；TRIS Base購自N0V0N公司;Acrylamide購自Solarbio 公司；十二焼基硫酸納購自xiamen sanlandchemicals company limited ;瓊月旨糖、考馬 斯亮藍R_250、 Aprotimin、 PMSF禾口 NP_40，均購自Sanland-chem International InC ; TEMED購自HUALVYUAN BIOTECHNOLOGY ;X射線膠片購自中國樂凱膠片集團公司；二抗 affinity purified antibodyperoxidase labled goat anti-mouse lgG(H+L)HSA liquid conjugate禾口 affinitypurified antibody peroxidase labled goat anti_rabbit lgG(H+L)HSA liquidconjugate，購自美國Kirkegaard & laboratories ;四噻唑藍(MTT)購 自美國Promega公司。
主要實驗儀器 BHC-1300II A/B3生物安全櫃，蘇州安泰空氣技術有限公司生產；TS100生物倒置 相差顯微鏡，日本NIKON公司生產；C02培養箱，美國NBS公司生產；TS-1脫色搖床，金紜 市傑瑞爾電器有限公司生產；電子分析天枰，北京塞多利斯儀器系統有限公司生產；旋渦 混合器，海門市其林貝爾儀器製造有限公司生產；BYY-6C雙穩定時電泳儀，北京六一儀器 有限公司生產；酶標儀，美國MD公司生產；J-25離心機，美國貝克曼公司生產；XJX-IIX射 線攝影暗匣，上海躍進醫用光學器械廠生產；血球計數板，上海市求精生化試劑儀器有限公 司；96孔板細胞培養板，BiousingBiotechnology有限公司生產。
試驗例1 : 四噻唑藍(MTT)法測定PC12細胞的存活率
( — )PC12細胞株的培養PC12細胞用含10X馬血清，5X胎牛血清、100U/mL青黴素和100 y g/mL鏈黴素的 RPMI1640培養基，於37°C、5% C02和95%溼度下進行貼壁培養。每2_3天更換培養液一 次，細胞達約70% 80%融合時，傳代或用於實驗。
(二)PC12細胞的排板用0. 25%的胰酶將貼壁的PC12細胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將細胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1 X 10cel 1/孔，在含有10%馬血清，5%胎牛血清、 100U/mL青黴素和100 ii g/mL鏈黴素的RPMI 1640培養基，於37°C、5% C02和95%溼度的 培養箱中培養。 梯度濃度Morphine剌激 細胞培養過夜，換新鮮RPMI 1640培養液，對照組不加Morphine,實驗組分別用10、 20、50、100、200 ii M的濃度Morphine剌激。各組設5個平行實驗。 [OO35](四)四噻唑藍(MTT)實驗 取出待測的96孔細胞培養板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，繼續孵育4小時 後，3000rpm室溫下離心15min，小心去掉上清，每孔加入150 二甲基亞碸，小心混勻，用 酶標儀在波長570nm處測定吸光度值。 [OO37](五)細胞的存活率計算 存活率％ =加藥組A值/對照組A值X 100%
試驗例2 : 四噻唑藍(MTT)法測定Morphine對MPP+剌激的PC12細胞的保護作用
( — )PC12細胞株的培養 PC12細胞用含10X馬血清，5X胎牛血清、100U/mL青黴素和100 ii g/mL鏈黴素的 RPMI1640培養基，於37°C、5% C02和95%溼度下進行貼壁培養。每2_3天更換培養基一 次，細胞達約70% 80%融合時，傳代或用於實驗。
(二)PC12細胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的PC12細胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將 細胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1 X lOcel 1/孔，在含有10%馬血清，5%胎牛血清、 100U/mL青黴素和100 ii g/mL鏈黴素的RPMI 1640培養基，於37°C、5% C02和95%溼度下 進行貼壁培養。 (三)Morphine和MPP+剌激 細胞培養過夜，換新鮮RPMI1640培養基，對照組不加Morphine,實驗組分別用 100 iiM濃度的Morphine, 0. 3mM濃度的MPP+， 100 ii M的濃度Morphine力口上0. 3慮濃度1^+ 分別剌激剌激。各組設5個平行實驗。 [OO47](四)四噻唑藍(MTT)試驗 取出待測的96孔細胞培養板，每孔加MTT溶液(5mg/ml) 10 y 1，繼續孵育4小時 後，3000rpm室溫下離心15min，小心去掉上清，每孔加入150 二甲基亞碸，小心混勻，用 酶標儀在波長570nm處測定吸光度值。 [OO49](五)細胞的存活率計算 存活率％ =加藥組A值/對照組A值X 100%
試驗例3:Western Blot檢測Morphine對MPP+剌激的PC12細胞Trx蛋白表達的影響 [OO53] ( — )PC12細胞株的培養 PC12細胞用含10X馬血清，5X胎牛血清、100U/mL青黴素和100 ii g/mL鏈黴素的 RPMI1640培養基，於37°C、5% C02和95%溼度下進行貼壁培養。每2_3天更換培養基一 次，細胞達約70% 80%融合時，傳代或用於實驗。
6[OO55] (二)PC12細胞的排板 用0. 25%的胰酶將貼壁的PC12細胞消化起來，1500rpm離心5min，除去胰酶。將 細胞均勻的排在96孔板中，排板密度為1 X 104cel1/孔，在含有10%胎牛血清、100U/mL青 黴素和100 ii g/mL鏈黴素的RPMI1640培養基，於37°C、5% C02和95%溼度下進行貼壁培養。 (三)Morphine和MPP+剌激 細胞培養過夜，換新鮮RPMI 1640培養基，對照組不加Morphine,實驗組分別用實 驗組分別用100 iiM Morphine, 0. 3mM MPP+， 100 ii mM Morphine加上0. 3mM MPP+剌激。各
組設三個以上平行實驗。
(四)免疫印跡
1.蛋白含量的測定 用BCA試劑盒測定將10 ii 1標準品或待測樣本與200 ii 1 WR工作溶液混合，37°C 孵育30min，將反應管溫度冷卻至室溫。測定562nm光密度值，繪製標準曲線，並計算蛋白濃 度。 2.蛋白免疫印跡(Western Blot) 總蛋白加樣量為6ii g，與2XSDS凝膠加樣緩衝液混合後，95t:熱變性5min，用 15X的SDS-PAGE膠電泳分離後，將蛋白條帶用電轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶4°〇封 閉過夜；取出PVDF膜，用含0. 1% Tween-20的TPBS衝洗後，加入1000倍稀釋的一抗室溫 孵育75min ;用含0. 1 % Tween-20的TPBS衝洗，加入5000倍稀釋的二抗室溫孵育75min ; 用含0. 1 % Tween-20的TPBS衝洗，將PVDF膜浸入發光底物溶液中反應lmin， X射線膠片 曝光。 本發明旨在證實低濃度Morphine保護神經細胞免於MPP+的損傷。
不同濃度的嗎啡對神經元的作用不一樣。低濃度嗎啡可以促進神經元增殖，相反， 高濃度嗎啡則誘導神經元凋亡。這些都提示我們Morphine的濃度不同所產生的作用亦不 同。MPP+具有抑制PC12細胞的生長增殖並誘導PC12細胞的凋亡的作用。PC12細胞中加 入Morphine,結果表明10-100 y M的Morphine能促進PC12細胞的生長(圖1)。而且，用 100 ii M的Morphine預剌激PC12細胞時，明顯保護細胞免受由MPP+所致細胞損傷作用(圖 2)，並且加入Morphine後能使MPP+所致的Trx的蛋白表達有所回升(圖3)。這些結果都 說明，適當濃度的Morphine可用於促進神經細胞增殖，保護神經細胞免於帕金森病毒性物 的損傷。 由於Morphine能促進PC12細胞的生長，保護神經細胞免於帕金森病毒性物的損 傷是首次發現的，因此，以適當濃度Morphine作為促進神經細胞生長和保護神經細胞免於 帕金森病毒性物損傷。 與對照組相比，在低濃度時，Morphine能增加PC12細胞生長繁殖並且誘導Trx蛋 白表達水平。由於Trx具有抗凋亡、保護細胞的作用，因此，Morphine還可以保護PC12細 胞免於帕金森毒性物MPP+損傷。因此，Morphine通過誘導Trx的表達來促進神經細胞的 生長以及保護神經細胞。
權利要求
Morphine在製備治療帕金森病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及Morphine在製備治療帕金森病的藥物中的應用確切地說涉及Morphine的醫藥新用途，屬醫藥技術領域。本發明經四噻唑藍(MTT)法，發現Morphine能促進大鼠腎上腺嗜鉻瘤細胞(PC12細胞)的生長。Morphine具有促進神經細胞增殖的活性，並且抑制帕金森毒性物MPP+(1-Methyl-4-Phenylpyridiniumion)導致的神經細胞的損傷；蛋白質免疫印跡法表明，Morphine可以誘導PC12細胞中硫氧還蛋白的表達水平。因此，Morphine保護神經細胞免於MPP+毒性與誘導硫氧還蛋白表達有關。
文檔編號A61K31/485GK101766621SQ200910218370
公開日2010年7月7日 申請日期2009年12月16日 優先權日2009年12月16日
發明者白潔, 陳妍 申請人:昆明理工大學