一種微載體的回收方法
2023-06-12 03:28:16
專利名稱：一種微載體的回收方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體的說，涉及一種微載體的回收方法。
背景技術：
近十多年來，隨著市場對生物製品需求量的急增，產品供不應求，刺激了細胞大規模培養技術的研究快速發展，生產規模已放大到萬升。微載體的成功發展和應用使貼壁依賴型細胞的大規模培養成為可能。微載體系統提供的高培養表面積/體積比(例如1毫升中使用5毫克就得到30平方釐米表面積)，提供了高細胞產量而無需大容量的設備，相對於其他類型的單層培養而言，微載體培養需要較少的空間，就可產生一定量的細胞或細胞產物，提高了生產規模；另外，微載體系統的自動化控制能夠使培養系統環境均一，保護細胞抵制物理和化學壓力，與其他單層或浮技術相比，一定體積的培養基情況下，攪拌微載體培養的細胞產量能高出100倍；而且由於可以在小體積中培養大量的細胞(高於1億個/毫升)，微載體培養可採用更小的培養容器，例如一個技術工人每周能夠處理900個用於疫苗生產的轉瓶，微載體培養可以生產相當於 50個轉瓶(490平方釐米的轉瓶)的細胞產量，這個微載體相關的簡化過程減少了規模生產所需的勞動力；微載體培養減少了處理步驟。在單個微載體培養系統中與在幾百個轉瓶培養中生產大量的細胞相比，前者大大降低了汙染的風險。因此，目前應用微載體培養動物細胞在生物反應器生產生物製品的種類逐漸增加，在我國先後有遼寧成大生物技術股份有限公司，吉林邁豐藥業，廣州諾誠生物等企業， 採用生物反應器微載體技術培養Vero細胞生產人用狂犬疫苗，並獲得了國家食品藥品監督管理局頒發的人用狂犬疫苗(Vero細胞)的新藥證書和藥品註冊批件，北京百泰生物藥是有限公司採用微載體技術生產治療用抗體，年產能力高達8公斤。目前，以微載體應用代表的生物技術的發展，使得產品的質量和數量有了很大的提升，同時微載體在生產中應用的成本也成為人們關注的問題，以每升溶液使用10克為例，每年每個廠家約需數百千克微載體，價值約1至2千萬元。如能將生產過程中用過的微載體回收再利用，則能大大減低生產成本。因此，本發明將提供一種微載體的回收方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種簡便易行，低成本的微載體回收方法。本發明所述的微載體回收方法，是將微載體用鹼溶液溶液衝洗以去除微載體表面的蛋白質成份，此方法操作簡單，回收率高。具體的說，本發明所述的微載體回收方法，包括以下步驟1)浸泡將微載體以高濃度鹼溶液浸泡24-36小時；2)衝洗取柱長50-100釐米的層析柱空柱，將高濃度鹼溶液處理後的微載體裝入柱內，先以1.5-3倍體積的低濃度鹼溶液衝洗，隨後以1.5-3倍體積的高濃度鹼溶液衝洗；再以1. 5-3倍體積的緩衝液衝洗。其中，所述高濃度鹼溶液為0. 5-1. Omol/L氫氧化鈉溶液；所述低濃度鹼溶液為 0. 1-0. 4mol/L氫氧化鈉溶液；所述緩衝溶液為pH值為7. 4，濃度為0. 01-0. 2mol/L的磷酸鹽緩衝溶液；另外，步驟2)之後，本發明的方法還包括步驟3)保存將衝洗完畢的微載體取出， 保存在保存溶液中；其中所述保存溶液為PH值為7. 4，濃度為0. 01-0. 2mol/L磷酸鹽溶液。本發明所述的方法中，所述微載體為實心微載體；步驟1)中，高濃度鹼溶液的量為可將微載體浸沒即可；浸泡過程中，每隔2-3小時，攪拌一次；步驟2)中，每種溶液按量衝洗一次即可。步驟2)中，所述的磷酸鹽緩衝溶液優選生物技術領域常用的磷酸鹽緩衝溶液，如 PH值為7. 4，濃度為0. 02mol/L的磷酸鹽緩衝溶液。微載體是由葡聚糖，纖維素或膠原等物質製成的小顆粒。細胞培養用微載體大致可分為實心微載體和多孔微載體。實心微載體(如CYT0DEX-1)表面光滑，培養細胞時，細胞貼於其表面生長，本發明適用於該類微載體。本發明中，所述pH值為7. 4，濃度為0. 02mol/L磷酸緩衝溶液的配製方法如下稱取氯化鈉8. 0g、氯化鉀0. 2g、磷酸二氫鉀0. 21g、磷酸氫二鈉3. 6g，加注射用水攪拌溶解定容至1升備用；當然，也可以用生物領域常用的方法來配製。所述鹼溶液和鹽溶液採用本領域常用的的配製方法即可，所用配製用水最好採用注射用水。本發明技術方案的核心在於在類似層析柱裝置中處理微載體。採用層析柱處理可以減少衝洗液的用量，減少衝洗次數，操作簡單。所回收微載體雜質含量符合要求，回收率
尚ο
具體實施例方式以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。實施例1取出剛下罐的3升微載體放入10升塑料桶中，加入0. 5mol/L氫氧化鈉溶液5升， 將微載體浸沒，浸泡24小時，期間每3小時將微載體攪拌一次。取直徑7cm左右長IOOcm層析柱，用注射用水衝洗乾淨，將微載體中多餘的鹼液棄去，留下相當於1個體積微載體的氫氧化鈉溶液，將微載體連同鹼液一同倒入柱中，層析柱頂部不封閉，打開下開口使微載體中的氫氧化鈉溶液流出，沿柱壁向柱中緩緩加入5升 0. lmol/L的氫氧化鈉衝洗，待微載體中的氫氧化鈉溶液全部流出後，沿柱壁向柱中緩緩注入5升，1. Omol/L氫氧化鈉溶液衝洗，待氫氧化鈉溶液全部流出，在沿柱壁向柱中緩緩注入約5升0. lmol/L磷酸鹽緩衝液，待緩衝液流出後，取出微載體保存於0. Olmol/L磷酸鹽溶液中。微載體的回收率為99%。實施例2取出剛下罐的3升微載體放入10升塑料桶中，加入0. 8mol/L氫氧化鈉溶液5升， 將微載體浸沒，浸泡36小時，期間每3小時將微載體攪拌一次。
取直徑7cm左右長IOOcm層析柱，用注射用水衝洗乾淨，將微載體中多餘的鹼液棄去，留下相當於1個體積微載體的氫氧化鈉溶液，將微載體連同鹼液一同倒入柱中，層析柱頂部不封閉，打開下開口使微載體中的氫氧化鈉溶液流出，沿柱壁向柱中緩緩加入約7升左右0. 4mol/L氫氧化鈉衝洗，待微載體中的氫氧化鈉溶液全部流出後，沿柱壁向柱中緩緩注入9升左右0. 8mol/L氫氧化鈉溶液衝洗，待氫氧化鈉溶液全部流出，在沿柱壁向柱中緩緩注入4. 5升0. 2mol/L磷酸鹽緩衝液，待緩衝液流出後，取出微載體保存於0. 02mol/L磷酸鹽溶液中。回收率99. 5%。實施例3取出剛下罐的3升微載體放入10升塑料桶中，加入1. Omol/L氫氧化鈉溶液5升， 將微載體浸沒，浸泡30小時，期間每2小時將微載體攪拌一次。取直徑7cm左右長IOOcm層析柱，用注射用水衝洗乾淨，將微載體中多餘的鹼液棄去，留下相當於1個體積微載體的氫氧化鈉溶液，將微載體連同鹼液一同倒入柱中，層析柱頂部不封閉，打開下開口使微載體中的氫氧化鈉溶液流出，沿柱壁向柱中緩緩加入9升左右，0. lmol/L氫氧化鈉衝洗，待微載體中的氫氧化鈉溶液全部流出後，沿柱壁向柱中緩緩注入4. 5升左右，0. 5mol/L氫氧化鈉溶液衝洗，待氫氧化鈉溶液全部流出，在沿柱壁向柱中緩緩注入0. lmol/L磷酸鹽緩衝液約5升待緩衝液流出後，取出微載體保存於0. lmol/L磷酸鹽溶液中。回收率98%。實施例4取實施例1-3處理過的微載體，放顯微鏡下觀察，可見微載體表面光滑無蛋白及其它成份粘附，另分別取未處理過的微載體和實施例1處理過的微載體各1克加注射用水， 利用功率頻率20000赫茲超聲波超聲三次，每次5分鐘。4000轉/分鐘離心，10分鐘取上清測定蛋白含量，結果如下表
Cytodexl微載體蛋白質含量(mg/ml)未處理15. 90實施例1處理0. 18實施例2處理0. 21實施例3處理0. 15實施例5取2支工作種子批Vero細胞復甦後，培養傳代2次後分別注入兩個生物反應器中，按25克/升量加未用的微載體和實施例1處理過的微載體cytodexl進行對比試驗。進行Vero細胞計數，結果見下表
權利要求
1.一種微載體回收方法，包括以下步驟1)浸泡將微載體以高濃度鹼溶液浸泡24-36小時；2)衝洗取柱長50-100釐米的層析柱空柱，將高濃度鹼溶液處理後的微載體裝入柱內，先以1. 5-3倍體積的低濃度鹼溶液衝洗，隨後以1. 5-3倍體積的高濃度鹼溶液衝洗；再以1. 5-3倍體積的緩衝液衝洗。
2.如權利要求1所述的回收方法，其特徵在於，所述高濃度鹼溶液為0.5-1. Omol/L氫氧化鈉溶液。
3.如權利要求1所述的回收方法，其特徵在於，所述低濃度鹼溶液為0.1-0. 4mol/L氫氧化鈉溶液。
4.如權利要求1所述的回收方法，其特徵在於，所述緩衝溶液為PH值為7.4，濃度為 0. 01-0. 2mol/L的磷酸鹽緩衝溶液。
5.如權利要求1所述的回收方法，其特徵在於，步驟2)之後，本發明的方法還包括步驟 3)保存將衝洗完畢的微載體取出，保存在保存溶液中；其中所述保存溶液為PH值為7. 4， 濃度為0. 01-0. 2mol/L磷酸鹽溶液。
6.如權利要求1或5所述的回收方法，其特徵在於，步驟1)中，浸泡過程中，每隔2-3 小時，攪拌一次。
7.如權利要求1或4所述的回收方法，其特徵在於，所述的磷酸鹽緩衝溶液為pH值為 7. 4，濃度為0. 02mol/L的磷酸鹽緩衝溶液。
8.如權利要求1-7任一所述的回收方法的應用，其特徵在於，用於回收微載體。
全文摘要
本發明涉及一種簡便易行，低成本的微載體回收方法。本發明所述的微載體回收方法，是將微載體用鹼溶液和高鹽溶液衝洗以去除微載體表面的蛋白質成份，此方法在層析柱裝置中處理微載體，可以減少衝洗液的用量，減少衝洗次數，操作簡單；而且所回收微載體雜質含量符合要求，回收率高。
文檔編號C12N11/00GK102174497SQ201010623610
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月30日 優先權日2010年12月30日
發明者馮瓊, 孫衛華, 張豔紅, 楊雪麗, 樊鵬, 王梓慶, 阮承邁 申請人:北京民海生物科技有限公司