一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法
2023-06-12 07:35:36
專利名稱：一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法
技術領域：
本發明屬於木質纖維素水解領域，尤其是利用纖維素複合酶高效降解纖維素為還原糖的領域。
背景技術：
長期以來，傳統化石能源消耗越來越大，儲量越來越低，而過度利用化石能源，造成嚴重的溫室效應等環境問題，這成為促進生物質能源興起的關鍵因素。生物能源中，燃料乙醇產業的發展速度快、發展力度最強，尤其是，以農林廢棄物為原料生產燃料乙醇已成為研究開發的熱點。這類技術主要包括木質纖維素水解糖化、酒精發酵及乙醇的提純。其中，木質纖維素的糖化水解形成還原糖，是技術關鍵步驟，它佔整個燃料乙醇生產成本的50%，制約著整個纖維素製備乙醇技術的發展進程。目前，纖維素制乙醇技術領域的關鍵，則主要集中於 原料預處理、優化酶的復配及激活劑的添加等方面。所研究的最終目的都是為了降低酶的用量，提高還原糖得率及纖維素轉化率以及經濟效益。由於木質纖維素的結構較複雜，細胞壁中的半纖維素和木質素通過共價鍵聯結成網絡結構，纖維素鑲嵌其中，造成纖維素複合酶與纖維素的有效接觸面積減少；而且纖維素本身的結晶結構使纖維素聚合物顯示出剛性和高度水不溶性，更增加了纖維素的降解難度。因此，對天然纖維素進行預處理的目的是，改變該木質纖維素的結構，適度破壞纖維素、半纖維素及木質素之間的難以被破壞的連接區域，降低纖維素的結晶度，降低木質素的含量，增加原料的疏鬆性，以增加纖維素酶系與纖維素的有效接觸面積，從而提高還原糖得率。玉米芯是剝取玉米顆粒後的殘餘物，是一種木質纖維素，通常採用燃燒、堆肥等處理方法得到部分利用。這種玉米芯經過機械破碎形成50 200目顆粒材料，該顆粒材料採用鹼與過氧化物處理後，形成可酶解的纖維素原料。現有技術用於纖維素預處理的常用方法有:酸、鹼水解、蒸汽爆破、高溫水熱等。纖維素複合酶的水解過程受水解溫度、pH值、水解時間及底物性質與反應質量濃度等因素的影響。因此，篩選合適的反應條件，可以使纖維素複合酶得到最大化的利用。此外，酶的用量也非常關鍵，它直接制約著燃料乙醇的生產成本。採用酶的復配，如添加β -葡聚糖酶，不僅彌補了纖維素複合酶中β -葡聚糖酶酶活低的缺陷，而且可以避免產物抑制引起的纖維素轉化率低。現有技術如專利CN1806945公開了一種利用秸杆預處理和酶解工藝使秸杆纖維素酶解的方法。秸杆首先經汽爆處理，然後用熱水洗滌，除去半纖維素多糖，乾燥後與離子液體混合，微波加熱或直接加熱，然後將處理後的秸杆用水反覆衝洗，洗滌液中的溶劑可通過蒸餾等方法回收。衝洗乾淨的處理秸杆在50.0°C，ρΗ4.8的緩衝液中用纖維素酶解48.0 72.0小時，纖維素的酶解率達100%，但汽爆處理能耗較大，且設備要求高，成本較聞。現有技術如專利CN102115994公開了一種木質纖維素原料的處理方法，該方法通過粉碎，高度分散和高壓破碎將木質纖維素原料分散到粒徑為10 40 μ m,並通過酶的復配，添加β -葡聚糖酶和木聚糖酶，最終使水解率達95 % 98 %，但該方法預處理能耗大，預處理並沒有使半纖維素得到有效的分離，經木聚糖酶得到的木糖，在後續的發酵過程中不能得到有效的利用。針對木質纖維素的水解糖化工藝，現有技術存在的問題可歸結為:(I)大多數預處理工藝對設備要求高，能耗高，成本高，並且不能將半纖維素得到很好的分離和利用。(2)大多數工藝中，未對纖維素複合酶的最佳反應條件進行試驗，造成酶不能得到有效利用。
(3)現有技術採用酶的復配技術，所添加酶的種類較多，但其應用有效性和成本沒有得到充分考慮。這些現有技術的問題導致迄今仍不能規模化有效處理和經濟性轉化木質纖維素，顯著降低現有技術的創造性和實用性。由於木質纖維素各品種之間結構的差異性以及半纖維素形態與分布的不同，對它們採用的處理方法也不相同。尤其是，處理木屑與處理玉米芯的方法，就有很大差異。針對現有技術的問題，尤其是現有處理木質纖維素技術未能有效利用酶的問題，本發明技術提出在預處理木質纖維素時採用非離子型表面活性劑，促進酶的有效分散，主要是基於纖維素複合酶與反應底物中的木質素無效吸附，會造成部分酶的失活問題而提出的有效方法。本發明所述的非離子型表面活性劑，可以優先與木質素進行吸附結合，優先佔據木質素活性反應位置產生佔位效應，避免了酶的浪費，減少了纖維素的轉化成本，提高還原糖的得率。
發明內容
為了最大化的利用纖維素複合酶，降低成本，提高纖維素轉化率及還原糖得率，本發明對木質纖維素採用2 步法的預處理工藝，所述的預處理過程為:在IL圓底燒瓶中，力口入一定量的木質纖維素，加入濃度為1.2%氫氧化鈉和濃度為0.225%雙氧水，以1: 20固液比加入蒸餾水，溫度70.(TC，轉速300r/min，反應3.0小時。離心後，倒掉上清液，以固液比為1: 20加入濃度1.0%的稀硫酸，溫度120.(TC，反應1.0小時，用鹼調節pH至7.0
9.0,乾燥備用。所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的木質纖維素原料為由經2步法預處理得到的玉米芯，該預處理玉米芯的過程為:將玉米芯材在低於100.(TC烘乾後粉碎至80目，用濃度1.2%氫氧化鈉和濃度0.225%雙氧水於70.(TC水浴中處理3.0小時，過濾，烘乾得到初級處理產品；該產品用濃度1.0%的稀硫酸120.(TC處理
1.0小時，並用鹼調至pH為7.0 9.0，再經烘乾即得到2步法預處理的玉米芯。利用上述預處理得到的玉米芯纖維素，設計處理2步法預處理反應過程。利用正交實驗方法優化實驗組成及酶反應過程，分析優化合適的酶反應條件，添加β -葡聚糖酶和非離子型表面活性劑，提高纖維素複合酶的利用率。所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的複合酶用量為 15.0 120.0FPU/g ο所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的底物質量濃度為10.0 200.0g/L
所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的反應溫度為 30.0 70.(TC所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的反應pH值為3.5 5.5。所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的反應時間為 6.0 72.0h0所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於，所採用的氫氧化鈉濃度為1.2%，雙氧水濃度為0.225%。實施例中還原糖的測定採用DNS法。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的描述，但本發明的實施方式並不僅局限於此。實施例1 玉米芯粉碎成80目粉末，加入濃度1.2%的氫氧化鈉和濃度0.225%的雙氧水，於70.(TC水浴中處理3.0小時，過濾，烘乾；用濃度1.0 %的稀硫酸於120.(TC油浴處理1.0小時，並用鹼調至pH為7.0 9.0，烘乾即可。實施例2配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的2步法預處理的玉米芯分散在緩衝液中，加入30.0FPU/g的纖維素複合酶，置於搖床中45.(TC，轉速150r/min,反應48.0h,還原糖得率為30.7 %。實施例3步驟如實施例2，只是將酶用量改為45.0FPU/g,其還原糖得率為48.0%。實施例4步驟如實施例2，只是將酶用量改為60.0FPU/g,其還原糖得率為56.8%。實施例5步驟如實施例2，只是將酶用量改為75.0FPU/g，其還原糖得率為61.0%。實施例6步驟如實施例2，只是將酶用量改為90.0FPU/g,其還原糖得率為58.9%。實施例7配製pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為20.0g/L的2步法預處理的玉米芯分散在緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素複合酶，置於搖床中45.(TC，轉速150r/min,反應48.0h,還原糖得率為58.9 %。實施例8步驟如實施例7，將底物質量濃度改變為40.0g/L,還原糖得率為61.0%。實施例9步驟如實施例7，將底物質量濃度改變為60.0g/L,還原糖得率為60.5%。實施例10步驟如實施例7，將底物質量濃度改變為80.0g/L,還原糖得率為56.6%。
實施例11步驟如實施例7，將底物質量濃度改變為100.0g/L,還原糖得率為53.0%。實施例12配製好pH為3.6的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的2步法預處理的玉米芯分散在緩衝液中，分別加入75.0FPU/g的纖維素複合酶，置於搖床中45.(TC，轉速150r/min，反應48.0h，實驗所得的還原糖得率為46.8%。實施例13步驟如實施例12，所述的緩衝液的pH值為4.0，實驗所得的還原糖得率為55.9%。實施例14步驟如實施例12，所述的緩衝液的pH值為4.4，實驗所得的還原糖得率為60.2%。實施例15步驟如實施例12，所述的緩衝液的pH值為4.8，實驗所得的還原糖得率為61.0%。實施例16步驟如實施例12，所述的緩衝液的pH值為5.2，實驗所得的還原糖得率為51.0%。實施例17配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的2步法預處理的玉米芯分散在緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素複合酶，置於搖床中35.(TC，轉速150r/min，反應48.0h，還原糖得率為54.4%。實施例18步驟如實施例17，只改變溫度為40.(TC，還原糖得率為58.7%。實施例19步驟如實施例17，只改變溫度為45.(TC，還原糖得率為61.0%。實施例20步驟如實施例17，只改變溫度為50.(TC，還原糖得率為64.1 %。實施例21步驟如實施例17，只改變溫度為55.(TC，還原糖得率為51.9%。實施例22配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的2步法預處理的玉米芯分散在緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素複合酶，置於搖床中45.(TC，轉速150r/min，反應時間為6.0h，實驗得到的還原糖得率為43.8%。實施例23
實驗步驟如實施例22，只是將反應時間確定為12.0h,實驗得到的還原糖得率為54.7%。實施例24實驗步驟如實施例22，只是將反應時間確定為24.0h,實驗得到的還原糖得率為56.5%。實施例25實驗步驟如實施例22，只是將反應時間確定為36.0h,實驗得到的還原糖得率為59.3%。
實施例26實驗步驟如實施例22，只是將反應時間確定為48.0h,實驗得到的還原糖得率為61.0%。實施例27配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的2步法預處理的玉米芯分散在緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，再加入1.5CBU/g β -葡聚糖酶置於搖床中50.(TC，轉速150r/min，反應48.0h，實驗得到的還原糖得率為71.5%實施例28實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變為2.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為73.2%。實施例29實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變為3.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為73.8%。
·
實施例30實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變為4.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為75.1 %。實施例31實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變為5.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為75.7%。實施例32實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變為6.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為78.1 %。實施例33實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改變為7.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為76.9%。實施例34實驗步驟如實施例27，只是將β -葡聚糖酶加量改為8.5CBU/g,實驗得到的還原糖得率為76.0%。實施例35配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的2步法預處理的玉米芯分散在緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶和6.5CBU/g β -葡聚糖酶，然後加Λ 0.075g/g的聚乙二醇置於搖床中50.(TC，轉速150r/min，反應48.0h，所得的還原糖得率為 80.5%。實施例36實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變為0.150g/g，所得的還原糖得率為 86.4%0實施例37實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變為0.225g/g，所得的還原糖得率為 89.3%。
實施例38實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變為0.300g/g，所得的還原糖得率為 89.5%。實施例39實驗步驟如實施例35，只是將聚乙二醇加量改變為0.375g/g，所得的還原糖得率為 89.8%比較例I玉米芯原料烘乾，粉碎至80目，備用。配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的玉米芯分散在上述配製的緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，置於搖床中45.(TC，轉速150r/min，反應48.0h，還原糖得率為35.2%。比較例2玉米芯原料烘乾，粉碎至80目，加入濃度1.2%的氫氧化鈉和濃度0.225%的雙氧水，於70.(TC水浴中處理3.0小時，過濾，烘乾。配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的上述鹼氧處理玉米芯分散在配製的緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，置於搖床中45.(TC，轉速150r/min，反應48.0h，還原糖得率為58.2%。比較例3玉米芯原料烘乾，粉碎至80目，加入濃度1.0%的稀硫酸120.(TC油浴處理1.0小時，並用鹼調至pH為7.0 9.0，烘乾備用。配製好pH為4.8的檸檬酸-磷酸緩衝液，稱取質量濃度為40.0g/L的上述稀硫酸處理玉米芯分散在配製的緩衝液中，加入75.0FPU/g的纖維素酶，置於搖床中45.(TC，轉速150r/min，反應48.0h，還原糖得率為51.3%。表1實施例2-權利要求
1.一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的木質纖維素是採用2步法預處理木質纖維素，預處理木質纖維素的質量組成為: 纖維素35 50% ;半纖維素20 35% ;木質素15 25%及其它； 所述的2步法預處理木質纖維素的處理劑組成(按質量份為):鹼0.5~2.0過氧化物0.02 0.5硫酸0.5 6.0木質纖維素100.0 按上述處理劑的組成，進行木質纖維素的2步法預處理過程為:在IL圓底燒瓶中，加入一定量的木質纖維素，加入濃度為0.5% 2.0% (優選1.2%)氫氧化鈉和濃度為0.02% 0.5% (優選0.225% )雙氧水，以1: 20固液比加入蒸餾水，溫度70.(TC，轉速300171^11，反應3.0小時。離心後，倒掉上清液，以固液比為1: 20加入濃度為0.5% 6.0% (優選1.0%)的稀硫酸，溫度120.(TC，反應1.0小時，用鹼調節pH至7.0 9.0，幹媒備用； 然後，將2步法預處理的木質纖維素分散於檸檬酸與磷酸組成的緩衝溶液中，加入下列所述組分，其質量份為:2步法預處理的纖維素g/L10.0-200.0纖維素複合酶FPU/g15.0 120.0 β-葡聚糖酶 CBU/g1.5-8.5非離子表面活性劑g/g0.075 0.375反應溫度°C30.0-70.0pH3.5 5.5 反應時間h6.0-72.0 按上述組份添加後，進行木質纖維素的酶解過程:在IOOml三角瓶中，加入2步法預處理的木質纖維素10.0 200.0g/L，纖維素複合酶15.0 120.0FPU/g (相對於底物的添加量)，β -葡聚糖酶1.5 8.5CBU/g(相對於底物的添加量)，聚乙二醇0.075 0.375g/g(相對於底物的添加量)，調整反應液pH為3.5 5.5,置於搖床反應器內，設置溫度為30.0 70.(TC，轉速150r/min，反應時間6.0 72.0h，得到還原糖溶液。
2.根據權利要求1，其特徵是將木質纖維素的預處理與糖化水解方法組合，形成組合一體的工藝方法。
3.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的木質纖維素質量濃度為10.0 200.0g/L。
4.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的纖維素複合酶用量為15.0 120.0FPU/g。
5.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的反應溫度為30.0 70.0℃。
6.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的反應PH值為3.5 5.5。
7.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的反應時間為6.0 72.0h。
8.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的非離子表面活性劑為聚乙二醇。
9.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於所述的木質纖維素原料為玉米芯。
10.根據權利要求1所述的一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，其特徵在於採用玉米芯，經2步法預處理和水解糖化後，形成的以還原糖為主成份的水解液，用於直接發酵製備乙 醇。
全文摘要
本發明公開了一種木質纖維素糖化水解製備還原糖的方法，首先，通過鹼氧預處理與硫酸預處理的2步法預處理纖維素原料，再優選纖維素複合酶質量份為15.0～120.0FPU/g及其最佳反應條件，加入β-葡聚糖酶質量份為1.5～8.5CBU/g和表面活性劑質量份為0.075～0.375g/g在緩衝液反應，促進預處理纖維素的反應，實現木質纖維素的高效糖化水解。本發明在纖維素複合酶水解的最佳反應條件下，採用β-葡聚糖酶，彌補纖維素複合酶中β-葡聚糖酶酶活低的缺陷，非離子表面活性劑避免了纖維素酶與木質纖維素中木質素的吸附，使纖維素複合酶水解纖維素的效率提高，還原糖轉化率可達89.8％，所製成的還原糖用於直接發酵制乙醇，形成乙醇新能源的重要技術方法。
文檔編號C12P7/10GK103184258SQ20111044921
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優先權日2011年12月29日
發明者柯揚船, 呂海丹 申請人:中國石油大學(北京)