一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾穀鐮刀菌方面的應用的製作方法

2023-06-12 22:46:06

一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾穀鐮刀菌方面的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾穀鐮刀菌方面的應用。本發明公開的一株枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），其保藏編號為CGMCC?No.7621。作為小麥赤黴病的生物防治材料，無論開發新的生物農藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好的應用前景。
【專利說明】一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾穀鐮刀菌方面的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾穀鐮刀菌方面的應用。
【背景技術】
[0002]禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一,可引起麥類赤黴病(Fusarium Head Blight，FHB)，禾穀鐮刀菌為限制小麥產量的一個主要因素(Dubin, 1997)。我國氣候條件十分有利於麥類赤黴病的發生，長江中下遊地區常年病害造成產量損失10%-15%，大流行年份減產近50%(黃昌等，2000)。由於全球氣候變暖以及秸杆還田、免耕栽培等耕作制度改變的影響，我國麥類赤黴病的發生區域由長江流域迅速向西北、華北擴展(張昊，2011)，特別是在2008、2010和2012年，全國麥類赤黴病發生十分嚴重，造成了嚴重的產糧損失和不良的社會影響，嚴重威脅我國糧食安全。
[0003]禾穀鐮刀菌產生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(D0N，3，7，15三羥基-12，13環氧單端孢黴-9烯-8酮)是存在於赤黴病菌感染麥粒中的主要天然毒素之一。DON已被認定為最危險的自然發生食品汙染物之一，被列入國際研究的優先地位(Larsen et al.，2004) AON可致人免疫力下降、貧血、頭痛、腹痛、噁心；致動物拒食、生長延滯和流產(Rocha et al.，2005 ；Sobrova et al.，2010 ;Pestka，2010)。DON廣泛存在並大量汙染小麥及其製品，對人畜構成很大危害，嚴重威脅我國食品安全。
[0004]因此，加強禾穀鐮刀菌防控研究已成為保障我國糧食安全和食品安全的迫切需求。
[0005]多年來對麥類赤黴病防治主要依靠化學農藥，但隨著化學農藥帶來的環境問題，加之多年用藥已導致病原 菌抗藥性禾穀鐮刀菌菌株的出現(Changjun Chen et al.,2007),使防治難度加大。雖然在赤黴病抗性品質方面國內外投入大量的精力開展相關研究，但至今尚無理想的高抗小麥品種(李正輝等，2007)。
[0006]生物防治不僅可降低對環境的影響，還不易產生抗藥性，相關理論和技術的研究日益為人們所關注。枯草芽孢桿菌營養簡單，在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不汙染環境，能產生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力，較其他微生物更具有開發為生物防控菌劑的潛力。

【發明內容】

[0007]本發明的目的是提供一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾穀鐮刀菌方面的應用。
[0008]本發明提供的一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其保藏編號為CGMCCN0.7621。
[0009]上述菌株在生物防治鐮刀菌引起的植物病害中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0010]上述應用中，所述鐮刀菌為禾穀鐮刀菌。
[0011 ] 上述任一所述的應用中，所述病害為赤黴病或穗腐病或根腐病。
[0012]上述任一所述的應用中，所述植物為穀物；所述穀物為麥類作物或玉米；所述麥類作物具體為小麥。
[0013]上述菌株在製備抑制鐮刀菌的產品中的應用也屬於本發明的保護範圍。
[0014]上述應用中，所述的鐮刀菌為禾穀鐮刀菌。
[0015]一種防治鐮刀菌引起的植物病害的方法也屬於本發明的保護範圍，該方法是在植物生長過程中進行噴霧處理；所述噴霧為上述枯草芽孢桿菌的菌懸液或發酵液或代謝產物。
[0016]上述方法中，所述生長過程為揚花期。
[0017]上述任一所述的方法中，所述鐮刀菌為禾穀鐮刀菌。
[0018]上述任一所述的方法中，所述病害為赤黴病或穗腐病或根腐病。
[0019]上述任一所述的方法中，所述植物為穀物；所述穀物為麥類作物或玉米；所述麥類作物具體為小麥。
[0020]本發明提供的枯草芽孢桿菌不僅在平板培養時可高效抑制禾穀鐮刀菌，而且在田間小區實驗中其防治效果高達77.4%，是多菌靈1000倍稀釋液防治效果的2倍，即防治效果明顯優於目前普遍施用的多菌靈。作為小麥赤黴病的生物防治材料，無論開發新的生物農藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好的應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為對峙培養 實驗。
【具體實施方式】
[0022]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0023]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0024]NB液體培養基:由溶劑和溶質組成；溶質為蛋白腖、牛肉膏和NaCl，溶劑為水；蛋白腖在NB液體培養基中的濃度為1%，牛肉膏在NB液體培養基中的濃度為0.3%，NaCl在NB液體培養基中的濃度為0.5%，所述％均為質量體積百分比(g/100ml)。
[0025]NA固體培養基:在NB液體培養基中加入瓊脂(瓊脂與液體培養基的比例為1.5g:100ml)，得到NA固體培養基。
[0026]PDA培養基:馬鈴薯200g，加入少量水煮20min，三層紗布過濾，取濾液用水定容至1L,加入20g葡萄糖，15g瓊脂，121°C高壓滅菌20min。
[0027]綠豆湯培養基:綠豆10g，加入少量水煮20min，三層紗布過濾，取濾液用水定容至1L,分裝後121°C高壓滅菌20min。
[0028]禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum) FGl在文獻「楊慧勇，李飛鳳，陸瓊嫻，徐劍宏，史建榮.拮抗菌株AFR0406對小麥赤黴病菌和紋枯病菌的生物活性測定.江蘇農業科學，2006 (06)，142-144.」中公開過，公眾可從中國農業科學院農產品加工研究所獲得。
[0029]小麥石新828品種在文獻「孫志軍，楊曉麗，張輝，張廣輝.小麥新品種石新828選育過程及高產栽培技術.現代農業科技，2011 (09),96-97.」中公開過，公眾可從中國農業科學院農廣品加工研究所獲得。
[0030]實施例1、菌的分離與 鑑定
[0031]一、菌的分離[0032](-)2011年10月，在超淨工作檯中，將京郊採集的絲瓜花葯放在無菌蒸餾水中振蕩15分鐘製備菌懸液,搖床轉速為180rpm。
[0033](二)將菌懸液用無菌蒸餾水進行濃度梯度稀釋後塗布在NA培養基平板上，30°C條件下培養24小時，菌落布滿整個平板，用接種環挑取平板上形態、大小、顏色、透明度不同的菌株平板劃線純化，點接純化後的菌株應用於禾穀鐮刀菌對峙培養實驗。將得到的對禾穀鐮刀菌拮抗能力最強的一株菌命名為SG6。
[0034]二、鑑定
[0035](一)按照「伯傑細菌鑑定手冊」(第八版)和「常見細菌系統鑑定手冊」(東秀珠，蔡妙英等編著，北京:科學出版社，2001.2)中描述的方法，對菌株SG6進行形態特徵、培養特性和生理生化特性鑑定，具體結果如下:
[0036]菌體的形態特徵:
[0037]呈杆狀，周生鞭毛，革蘭氏陽性。
[0038]培養特性:
[0039]菌落呈汙白色或微黃色，表面粗糙不透明，菌落軟而溼潤、質地均勻。
[0040]生理生化特性:
[0041]葡萄糖:+ ;木糖:+ ；L-阿拉伯糖:+ ;甘露醇:+ ;乳糖:_ ;發酵葡萄糖產氣:+ ;利用檸檬酸鹽:+ ;50°C生長:+ ；pH5.7生長:+ ；7%NaCl生長:+ ;澱粉水解:+ ;分解酪素:+ ;硝酸鹽還原:+。
[0042](二)16S rDNA 試驗
[0043]提取SG6的總DNA，以其為模板，利用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，得到長度約為1.4kb的擴增產物，將擴增產物回收並進行測序，測得的序列如SEQ ID N0.1所
/Jn o
[0044]根據Gen-Bank 序列同源性比較，菌株 SG6 與 Bacillus subtilis strainCICC10163 (GenBank 登錄號 DQ005496.1)同源性為 100%，與 Bacillus amyloliquefaciensM20J (GenBank登錄號AB735995.1)同源性為100%，初步判定該菌為芽孢桿菌屬細菌(Bacillus sp.)o
[0045]基於以上特徵，將菌株SG6鑑定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌株已於2013年5月15日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為 CGMCC N0.7621。
[0046]實施例2、枯草芽孢桿菌SG6對禾穀鐮刀菌的拮抗作用
[0047]採用對峙培養法檢測枯草芽孢桿菌SG6對禾穀鐮刀菌的拮抗。
``[0048]—、用直徑為5mm的打孔器在培養好的病原真菌禾穀鐮刀菌(Fusariumgraminearum) FGl菌落邊緣打取菌盤，用滅菌的牙籤將菌盤挑入PDA平板中心。
[0049]二、在距PDA平板中心25mm處四點劃線接種相同體積和濃度的SG6，以僅接種禾穀鐮刀菌菌盤的PDA平板為對照組，28°C培養4-5天，觀察有無抑菌帶形成。每個組做三個平行。結果如圖1和表1所示。
[0050]圖1`中，1:對照組；2:SG6組
[0051]圖1表明，SG6對禾穀鐮刀菌有很強的抑制效果。[0052]表1培養5天後SG6對禾穀鐮刀菌的抑制作用
[0053]
【權利要求】
1.一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)，其保藏編號為CGMCC N0.7621。
2.權利要求1所述的菌株在生物防治鐮刀菌引起的植物病害中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於:所述鐮刀菌為禾穀鐮刀菌。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於:所述病害為赤黴病或穗腐病或根腐病。
5.根據權利要求2-4任一所述的應用，其特徵在於:所述植物為穀物；所述穀物為麥類作物或玉米；所述麥類作物具體為小麥。
6.權利要求1所述的菌株在製備抑制鐮刀菌的產品中的應用。
7.一種防治鐮刀菌引起的植物病害的方法，是在植物生長過程中進行噴霧處理；所述噴霧為權利要求1所述的枯草芽孢桿菌的菌懸液或發酵液或代謝產物。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於:所述鐮刀菌為禾穀鐮刀菌。
9.根據權利要求7或8所述的方法，其特徵在於:所述病害為赤黴病或穗腐病或根腐病。
10.根據權利要求7-9任一所述的方法，其特徵在於:所述植物為穀物；所述穀物為麥類作物或玉米；所述麥類作 物具體為小麥。
【文檔編號】A01P3/00GK103497916SQ201310438739
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月24日 優先權日:2013年9月24日
【發明者】劉陽, 趙月菊, 邢福國, 周露, 王龑 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所