一種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽及其製備方法

2023-06-12 13:09:06 2

一種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽及其製備方法
【專利摘要】本發明的目的是提供一種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽及其製備方法，本發明的鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽的製備方法，包括有膠原蛋白酶解物的製備和金屬螯合肽的分離製備步驟。本方法以二甲基亞碸替代水作為反應介質，然後在此無水體系中對交聯瓊脂糖進行活化，有效抑制了活化過程中的水解反應，該體系中環氧氯丙烷對交聯瓊脂糖凝膠的活化效率大幅度提高，環氧基活化密度範圍為157-165μmol/mL，較目前報導的最高值提高50％，進而獲得了高配基密度和對蛋白質具有高載量的固定化金屬親和層析介質。採用本方法製備的螯合肽對金屬離子的結合能力強，穩定性好，螯合活性大於0.5mmol/g。
【專利說明】一種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬於食品加工【技術領域】，具體一種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽及其製備方 法。

【背景技術】
[0002] 螯合肽是指來源於食源性蛋白，具有一定的礦物質元素螯合能力或者在消化吸收 過程中能發揮潛在的促礦物質元素吸收和提高礦物質元素生物利用度的一類多肽。礦物質 鈣、鋅、鐵和銅在人體內擁有各種各樣的生物功能。飲食中礦物質元素缺乏可能導致各種各 樣的疾病進而影響身體機能。
[0003] 營養學家建議在日常飲食中食用富含礦物質元素和有促礦物質吸收功能的食物。 從健康和飲食偏好的角度考慮，食源營養補充劑更易被人們接受。食源性礦物質元素補充 劑更是在近些年成為研究的熱點。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽及其製備方法，即一種從鱈魚 皮膠原蛋白肽中分離製備的，具有螯合鈣、鐵和銅能力的蛋白肽。
[0005] 本發明的鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽的製備方法，包括如下的步驟：
[0006] 1)膠原蛋白酶解物的製備：
[0007] 在鱈魚皮膠原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶進行水解，水解結束後使胰蛋白酶失 活，離心得到上清液備用；
[0008] 其中膠原蛋白水溶液的濃度為0. 5 % -5 % (w/v)，胰蛋白酶在水溶液中的濃度為 2% -5% (w/w)；
[0009] 2)金屬螯合肽的分離製備：
[0010] 將步驟1)的上清液加入到固定化金屬親和層析柱中進行結合，然後用PH7. 6的去 離子水進行清洗，再用PH為3. 0的鹽酸溶液將結合在固定化金屬親和層析柱上的螯合肽洗 脫下來；收集洗脫液，真空旋轉蒸發去除鹽酸後獲得鱈魚皮膠原蛋白螯合肽；
[0011] 其中鹽酸溶液的濃度為〇· 5-1. 5mol/L ;
[0012] 固定化金屬親和層析柱的製備步驟如下：在以二甲基亞碸溶劑中將環氧氯丙烷活 化的瓊脂糖凝膠Sepharose 6B與亞氨基二乙酸在50-80°C下交聯5-10小時，製備親和層析 柱基質；再分別將3-5個柱體積的0. 1-0. 5mol/L的金屬離子溶液與柱內基質充分結合2-5 小時，再用去離子水洗去未結合的金屬離子，固定化金屬親和層析柱。
[0013] 其中金屬離子溶液為CaCl2、ZnSO4、FeSO4或CuSO 4溶液。
[0014] 本方法以二甲基亞碸替代水作為反應介質，然後在此無水體系中對交聯瓊脂糖進 行活化，有效抑制了活化過程中的水解反應，該體系中環氧氯丙烷對交聯瓊脂糖凝膠的活 化效率大幅度提高，環氧基活化密度範圍為157-165 μ mol/mL，較目前報導的最高值提高 50 %，進而獲得了高配基密度和對蛋白質具有高載量的固定化金屬親和層析介質。採用本 方法製備的螯合肽對金屬離子的結合能力強，穩定性好，螯合活性大於0. 5mmol/g。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1 :膠原蛋白肽的固定化金屬親和層析純化圖。

【具體實施方式】
[0016] 本發明通過胰酶水解鱈魚皮膠原、固定化金屬親和層析分離獲得了螯合肽。
[0017] 實施例1
[0018] 1)膠原蛋白酶解物的製備：
[0019] 將鱈魚皮膠原蛋白溶於蒸餾水中（1:50, w/v)，用NaOH調整pH至7. 5,然後在37°C 預熱10分鐘，向上述反應液中加入胰蛋白酶（1:25, w/w)水解15分鐘，其中胰酶的酶活 4X 105u/g，然後KKTC沸水浴中滅酶10分鐘，4000rpm離心10分鐘，上清液凍幹。
[0020] 相同條件下，對比胰蛋白酶、鹼性蛋白酶Alcalase和木瓜蛋白酶的水解效果，胰 蛋白酶的水解效果最好，胰蛋白酶水解物的金屬螯合活性分別為鹼性蛋白酶Alcalase水 解物的1. 2倍、為木瓜蛋白酶水解物的1. 5倍。
[0021] 2)固定化金屬親和層析柱（IMAC)的製備
[0022] 將瓊脂糖凝膠S印harose 6B用蒸餾水反覆洗滌除去乙醇後，與60% (v/v)的二 甲基亞碸水溶液（即無水體系）混合，攪拌清洗lOmin。稱取處理後的瓊脂糖凝膠，與定量 二甲基亞碸、環氧氯丙烷、水、NaOH混合。混合液於45°C恆溫振蕩器中反應3h。將處理後 的混合液用大量去離子水洗滌至無環氧基檢出。環氧氯丙烷活化的瓊脂糖凝膠Sepharose 6B與亞氨基二乙酸（3:10, w/v)在60°C下交聯8小時，製備親和層析柱基質。然後分別將 5個柱體積的0. 2mol/L CaCl2、ZnS04、FeS04和CuSO4溶液與柱內基質充分結合2小時，再以 5個柱體積的去離子水洗去未結合的金屬離子，製成鈣、鋅、鐵和銅固定化金屬親和層析柱。
[0023] 相對於其他螯合肽分離純化方法，固定化金屬親和層析法的優勢主要體現在：洗 脫條件溫和（本方法pH為7. 6)條件下；再生後配體恢復完全，瓊脂糖凝膠S印harose 6B 可再生幾百次而不改變其層析特性；螯合肽洗脫容易，採用較低pH (pH為3. 0)便可將吸附 螯合肽解吸下來。
[0024] 3)固定化金屬親和層析柱對螯合肽的富集：取2mL膠原蛋白酶解物水溶液（pH 7. 6，15mg/mL)，加入固定化金屬親和層析柱中。用pH 7. 6的去離子水以lmL/min速度洗脫 未與固定化的金屬離子結合的多肽，紫外檢測器檢測214nm吸光值，充分洗脫直至無214nm 吸收。結合在固定化的金屬親和層析柱上的肽用lmol/L的HCl (pH 3.0)洗脫下來，收集 洗脫液，反覆真空旋轉蒸發去除HC1，得到膠原蛋白金屬螯合肽。採用固定化金屬親和層析 柱可以去除沒有螯合活性的多肽，對鈣、鋅、鐵和銅的螯合肽進行富集純化。本方法共鑑定 出11條礦物質螯合肽，即鈣螯合肽WR、SGSTGH和GPAGPHGPPG，鋅螯合肽NI/LGER、GPAGPR、 AGPAGPR、VGLIGPR 和 NGPAGPR，鐵螯合肽 SCH、GPAGPHGPPG，和銅螯合肽 SAC、GPAGPHGPPG 和 GPVGPHGPPGKDG。
[0025] 4)鐵螯合活性
[0026] 膠原蛋白螯合肽（250 μ L，lmg/mL)溶解在緩衝液（0. 05mol/L醋酸鈉 ，pH 5. 0)中 後加到96孔板內在酶標儀（BioTek Instrumentslnc. , VT，USA)內37°C預熱5分鐘，加入 20 μ L 的 0· 25mmol/L FeS0430 分鐘後，加入 15 μ L 的 2. 5mmol/L 的 ferrozine 來終止反應。 10分鐘後測定562nm處的吸光度值。以去離子水代替樣品作為空白對照。酪蛋白磷酸肽 用作正相對照。鐵螯合率（％ ) = (Absse-Abs#s)Absse X 100%。螯合肽的鐵鏊合率為 21. 5±1. 03%。
[0027] 5)膠原蛋白螯合肽銅螯合活性
[0028] 20(^1^膠原蛋白螯合肽（10(^8/1^，0.05111〇1/1醋酸鈉，？!15.0)加到96孔板，在 37°C預熱5分鐘，然後加入20 μ L的CuS04(lmg/mL)。30分鐘後，加入10 μ L(2mmol/L)的 PV終止反應，在632nm處測吸光度值。以去離子水代替樣品作為空白對照。酪蛋白磷酸肽 用作正相對照。銅螯合率（％) = (Absee-Abs^J/AbseeXlOO1%。螯合肽的銅鏊合率 為 8. 45±0· 25%。
[0029] 6)鈣螯合活性
[0030] 4mL膠原蛋白螯合肽（0· 75mg/mL, 20mmol/L磷酸鈉緩衝液溶解，pH 7. 5,），加入 2mL CaC12 (5mmol/L)，在37°C孵育30分鐘。然後將混合液以4000rpm的速度離心20分鐘， 取上清液稀釋至合適濃度後用原子吸收法測溶解鈣的含量。設置不加多肽的空白對照組。 螯合活性結果表示為每mg多肽能結合的Ca (μ g)的量（μ g Ca/mg peptide)。螯合的I丐離 子的量=樣品上清液中溶解鈣的量-空白對照組上清液鈣的量。鈣螯合活性為〇. 32 μ g/ mg 〇
[0031] 7)鈣螯合肽的鑑定
[0032] 膠原蛋白源螯合肽首先用Chelex 100脫鹽，然後過0.22 μ m濾膜過濾，然後凍幹， 用0. 1 %的甲酸（v/v)溶解成lmg/mL，取7 μ L採用液-質聯用分析。液相色譜流動相A為 〇. 1%的甲酸（ν/ν)，流動相B為0. 1%的甲酸（ν/ν)溶於80%的乙腈配製。採用Acquity UPLC C18BH1色譜柱（2. 1_X 100mm，1. 7 μ m)，流速0. 2mL/min。進樣後使用流動相A將樣 品在色譜柱內保留5分鐘，然後以0-40 %流動相B線性洗脫55min。質譜採用電噴霧三重四 極杆液質聯用儀（Agilent G6410B，USA)進行測定，電噴霧乾燥氣溫度300°C，流速6L/min， 25psi的惰性氣體壓力，毛細管電壓4000V。正電子模式條件下掃描範圍50-400m/z，每次掃 描1.03個周期。結果使用PEAKS Studio 6軟體對Mascot資料庫進行搜索，對多肽的氨基 酸序列進行分析，確定金屬螯合肽中多肽的種類和序列（表1)。
[0033] 表1 :鱈魚皮膠原蛋白螯合肽的鑑定
[0034]

【權利要求】
1. 一種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽的製備方法，其特徵在於，所述的方法包括如下的步 驟： 1) 月父原蛋白酶解物的製備： 在鱈魚皮膠原蛋白水溶液中加入胰蛋白酶進行水解，水解結束後使胰蛋白酶失活，離 心得到上清液備用； 2) 金屬螯合肽的分離製備： 將步驟1)的上清液加入到固定化金屬親和層析柱中進行結合，然後用PH7. 6的去離子 水進行清洗，再用pH為3. 0的鹽酸溶液將結合在固定化金屬親和層析柱上的螯合肽洗脫下 來；收集洗脫液，真空旋轉蒸發去除鹽酸後獲得鱈魚皮膠原蛋白螯合肽。
2. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟1)中膠原蛋白水溶液的濃度 為om
3. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟1)中胰蛋白酶在水溶液中的 濃度為2% -5%。
4. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟2)中鹽酸溶液的濃度為 0? 5-1. 5mol/L〇
5. 如權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的步驟2)中固定化金屬親和層析柱 的製備步驟如下：在以二甲基亞碸溶劑中將環氧氯丙烷活化的瓊脂糖凝膠S印harose 6B 與亞氨基二乙酸在50-80°C下交聯5-10小時，製備親和層析柱基質；再分別將3-5個柱體 積的0. 1-0. 5mol/L的金屬離子溶液與柱內基質充分結合2-5小時，再用去離子水洗去未結 合的金屬離子完成製備。
6. 如權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述的金屬離子溶液為CaCl2、ZnS04、 FeS04 或 CuS04 溶液。
7. -種鱈魚皮膠原蛋白源螯合肽，其特徵在於，所述的螯合肽是用權利要求1所述的 方法製備的。
【文檔編號】C12P21/06GK104372054SQ201410539790
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】李八方, 侯虎, 郭立冬, 趙雪, 張朝輝, 彭喆 申請人:中國海洋大學