利用PhotobacteriumleiognathiYL菌株檢測環境汙染物的製作方法

2023-06-12 23:10:36 2

專利名稱：：利用PhotobacteriumleiognathiYL菌株檢測環境汙染物的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種微生物，特別是涉及一株可用於環境汙染物檢測的海洋發光細菌Photobacteriumleiognathi菌株。
背景技術：
：據本發明人通過查閱資料、文獻檢索所知，目前已知的海洋發光細菌只有三屬，分別是弧菌屬(Vibrio),明亮發光菌屬(Photobacterium)，及希瓦氏菌屬(Shewanella)，陸地上則有異短桿菌屬(Xenorhabdus)。在有氧的自然環境下，發光細菌可產生螢光素酶(LE)，催化黃素單核苷酸(FMNH2)及長鏈脂肪醛類發生氧化反應，而發出藍綠色的螢光。目前在我國應用較廣的是明亮發光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)，利用明亮發光桿菌進行環境汙染物檢測的研究有所報導。而除了明亮發光桿菌以外，均沒有利用其他種屬的發光細菌進行環境汙染物檢測的報導。本發明中涉及的菌種鰒發光桿菌(Photobacteriumleiognathi)與明亮發光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)為同屬異種，在菌體形態特徵、生理生化特徵及16SrDNA序列上二者均有很大差異。但該菌株PhotobacteriumleiognathiYL表現出穩定的發光性能，對環境汙染物敏感，作為環境汙染物的指示菌，可以用於環境汙染物的檢測。
發明內容本發明的目的是提供一株來源於海洋環境的發光細菌菌株PhotobacteriumleiognathiYL(鰒發光桿菌YL)以及利用該菌株進行環境汙染物的定量檢測。本發明分離純化出一株來源於海洋環境的發光細菌YL，該菌種為革蘭氏陰性菌，杆狀(附圖1)。結合16SrDNA測序結果構建的系統發育樹(附圖2)和生理生化結果(表1)，發光細菌YL被鑑定為鰒發光桿菌(Photobacteriumleiognathi)。該菌株於2006年12月27日委託中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)保藏，保藏號為M206139。該菌株的16SrDNA基因序列已經提交GenBank核酸序列資料庫，存取號為EF017227。該菌株具有發光特性，能夠用來檢測環境汙染物。該菌株具有生長快、發光性能穩定、對營養要求低、對環境汙染物敏感等特點，螢光掃描確定該發光細菌的發光強度在474nm形成最大峰。多種受試環境汙染物的濃度與汙染物對該菌株PhotobacteriumleiognathiYL發光強度抑制率呈正比，能夠實現對受試環境汙染物的定量檢測。利用本菌株檢測環境汙染物具有成本低、操作簡便、靈敏度高等特點，能夠滿足多種汙染物的快速檢測的需要。附圖1發光細菌YL掃描電鏡照片。附圖2根據細菌16SrDNA序列分析結果構建的系統發育樹，括號內為該菌株在GenBank中的收錄號，分支上的數字代表置信度。附圖3發光細菌YL的發光光譜圖。附圖4Zn"濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關係圖。附圖5Cu"濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關係圖。附圖6Pb2—濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關係圖。附圖7氯黴素濃度與發光細菌YL發光抑制率的線性關係圖。具體實施方式實施例1從青島近海捕得常見海產品，包括魷魚、對蟲下、黃魚、黑頭魚、安康魚等。將各種水產品分割成小塊置於固體培養基平板內，在隔水式恆溫培養箱25t:恆溫培養10h，暗室觀察發光情況。標記發光的菌落，進行平板劃線培養。經過多次分離純化，得到發光細菌YL。實施例2取發光細菌YL單菌落接種於100ml液體培養基中(培養基組成蛋白腖5g、酵母膏lg、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養8hr使菌體達到對數生長末期。取5ml不同濃度的重金屬鋅溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養反應20min。反應完畢後，於微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和Zn"濃度成正比(圖4)，因而在進行食品或環境中該種汙染物的測定時，可根據抑制率推測出汙染物的含量。實施例3取發光細菌YL單菌落接種於100ml液體培養基中(培養基組成蛋白腖5g、酵母膏lg、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養8hr使菌體達到對數生長末期。取5ml不同濃度的重金屬銅溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養反應20min。反應完畢後，於微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和Cu2+的濃度成正比(圖5)，因而在進行食品或環境中該種汙染物的測定時，可根據抑制率推測出汙染物的含量。實施例4取發光細菌YL單菌落接種於100ml液體培養基中(培養基組成蛋白腖5g、酵母膏lg、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養8hr使菌體達到對數生長末期。取5ml不同濃度的重金屬鉛溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養反應20min。反應完畢後，於微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和Pb2+的濃度成正比(圖6)，因而在進行食品或環境中該種汙染物的測定時，可根據抑制率推測出汙染物的含量。實施例5取發光細菌YL單菌落接種於100ml液體培養基中(培養基組成蛋白腖5g、酵母膏lg、FeP040.lg、NaCl20g、甘油3ml、蒸餾水1000ml)，27。C搖床培養6hr使菌體達到對數生長初期。取5ml不同濃度的氯黴素溶液加入到5ml菌液中，27。C搖床培養反應20min。反應完畢後，於微弱發光測量儀中測量發光值，測量時間為50s，結果取平均值。從測定結果可知抑制率和氯黴素的濃度成正比(圖6)，因而在進行食品或環境中該種汙染物的測定時，可根據抑制率推測出汙染物的含量。表1YL與其他相近菌種的生理生化特徵比較tableseeoriginaldocumentpage5[OO31]注"+"表示所有菌株為正反應，"-"表示所有的菌株為負反應，數值說明正反應菌株的百分數。"+"表示直的桿菌，"-"表示彎的桿菌。+++++++++10+++90+—+—++++75+++—++—++++++1050—++'98++++++++++++++—+++++++25_+—_++—55——47_—+—一++—+++++—9$+—++30+++形成3—羥基丁酮和/或二乙醯生長在4'C30°C35°C>40°C形成澱粉酶明膠酶脂酶幾丁質酶海藻酸酶利用D—核糖L一阿拉伯糖D—葡萄糖D—甘露糖D—半乳糖D-果糖蔗糖海藻糖麥芽糖纖維二糖水楊苷酸甘露醇甘油甘氨酸L一亮氨酸L一絲氨酸L一蘇氨酸琥珀酸+++一III++I+I++++Il+ll+lIII1+1糖酸酸酸酸萄乙丙己壬葡權利要求一種能定量檢測環境汙染物的鰒發光細菌PhotobacteriumleiognathiYL菌株，其保藏號為CCTCCM206139。2.權利要求1所述的菌株在環境汙染物檢測中的應用。全文摘要本發明的目的是提供一株來源於海洋環境的鰒發光細菌PhotobacteriumleiognathiYL以及利用該菌株進行環境汙染物的定量檢測。本發明分離純化出一株來源於海洋環境的發光細菌YL，該菌種為革蘭氏陰性菌，杆狀。結合根據16SrDNA測序結果構建的系統發育樹和生理生化結果，發光細菌YL被鑑定為鰒發光桿菌(Photobacteriumleiognathi)。保藏單位為中國典型培養物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號為M206139。該發光細菌的16SrDNA基因序列已經提交GenBank核酸序列資料庫，存取號為EF017227。該菌株具有生長快、發光性能穩定、對營養要求低、對環境汙染物敏感等特點，螢光掃描確定該發光細菌的發光強度在474nm形成最大峰。發光強度抑制率與多種受試環境汙染物的濃度呈正比，能夠實現對受試環境汙染物的定量檢測。利用本菌株檢測環境汙染物具有成本低、操作簡便、靈敏度高等特點，能夠滿足汙染物的快速檢測的需要。文檔編號C12R1/01GK101712936SQ20081015762公開日2010年5月26日申請日期2008年10月6日優先權日2008年10月6日發明者朱蘭蘭,林洪,王亞群,王靜雪申請人:中國海洋大學