一種胸腺五肽的製備方法

2023-06-12 15:03:11 1

專利名稱：一種胸腺五肽的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域中多肽的合成方法，具體說是一種胸腺五肽液相合成製備方法。 可適用於大規模。
技術背景胸月泉五肽，英文名Thymopoietin pentapeptide; TP-5; Thymopentin， 結構式為 Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-0H，分子式及分子量C,。H化NA，679.77 。胸腺五肽通過促進或抑制的雙向調節作用使免疫能力趨於7H常，是一種很有發展前景的 免疫功能調節藥物。而且迄今為止的實驗藥理學研究和臨床藥理學研究以及臨床應用均未發 現胸腺五肽有任何毒副作用。胸腺五肽於1985年在義大利上市，商品名為Timunox 。傳統的胸腺五肽合成均由固相合成法完成，成本高，難於規模化生產，產物純化難度很大，有時甚至用高壓液相色譜法也難於達到所希望的純度。發明內容本發明提供了一種採用混合酸酐法合成胸腺五肽Arg-Lys- Asp- Val-Tyr-0H的方法。 所述方法過程有二肽合成-三肽合成-四欣合成-五肽合成-粗品生成；它是以N-甲基嗎啉 為催化劑，採用氯甲酸垸基酯為活化劑，活化被保護的胺基酸形成高反應活性的混合酸酐， 與氨基端裸露的胺基酸或肽反應來合成胸腺五肽；各肽合成中均採用N-甲基嗎啉為催化劑， 氯甲酸烷基酯為活化劑，氯甲酸烷基酯(ClC0具，RpEt、 'Bu)選用氯甲酸乙酯、氯甲酸異丁 酯。各肽合成過程包括混合酸酐的生成-過濾-減壓濃縮-酸鹼洗滌-千燥除水-各肽生成-脫保 護基的過程，合成五肽後，脫掉保護基團，生成粗品胸腺五肽，再純化；所述被保護的胺基酸按各肽合成順序是酪氨酸苄酯與纈氨酸的混合酸酐反應得到二肽、天門冬氨酸的混合酸酐 與二肽反應得到三肽、賴氨酸的混合酸酐與三肽反應得到四肽、精氨酸的混合酸酐與四肽反 應得到五肽粗品，所用胺基酸的2-氨基採用芴甲氧羰基(Fmoc)保護，精氨酸的2-氨基由叔 T氧羰基(Boc)保護，天門冬氨酸的側鏈羧基採用叔丁酯基保護，賴氨酸的側鏈氨基用叔丁 氧羰基基保護，精氨酸的側鏈胍基HC1保護，酪氨酸的酚羥基用苄基保護，羧基用酯基保護； 酪氨酸酯為酪氨酸苄酯。混合酸酐的生成過程中的反應溫度為-20 -15°C;各肽合成過程中 的反應溫度為-10 (TC。酸洗滌-乾燥除水，分別用稀鹽酸和飽和食鹽水洗滌，用無水硫酸鈉 乾燥；脫保護基過程為，加入哌啶脫除芴甲氧羰基(Fmoc)保護基團，減壓濃縮後，用醚洗； 加入有機溶劑溶解，有機溶劑可以是二氯甲垸、氯仿，在用二氯甲烷或氯仿溶解並冷藏備用， 其中溶劑優選二氯甲垸；所述粗品生成是指合成五肽後，用三氟乙酸-巰基茴香醚系統脫除所 有保護基團。在粗品生成後的純化過程為，用製備性高壓液相色譜純化，得到純度大於99%的胸腺五 肽水溶液，然後用冷凍乾燥機冷凍乾燥得到白色凍乾粉狀物固體，純度可以達到99%以上。 所用的各種保護胺基酸均能很容易從廠家購得。本發明與現有技術相比有如下優點 1產成本相對較低，以固相合成胸腺五肽為例，其實際產率僅為理論產率的50%,而本發明 的產率大於理論產率的60%;2在整個的生產工藝中所用的試劑價格相對較低；3在整個的生產過程中所主要採用的是通用設備，而不象現有技術中需依賴大型設備，因此 生產費用較低；4生產工藝較為簡單，反應過程易於控制，生產工藝的可重複性強； 5綜合生產周期較短，進一步減小生產成本，提高生產效率； 6合成規模可大幅度提高，容易實現工業化的大規模生產。
具體實施方式
以下通過實施例、實驗例詳細說明本發明的內容，但這些實施例並不構成對本發明的限制。實施例1 二肽化合物Val-Try(Bzl)0bzl HC1的合成把13. 58克的Fmoc-Val-0H溶解於160ml 二氯甲垸中，加入35ml的N-甲基嗎啉，反應 瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反應10分鐘後，將15. 92 克酪氨酸苄醚苄酯鹽酸鹽的二氯甲垸溶液160ml預冷至-15 -l(TC加入反應瓶內，再向其中 加入8ml的N-甲基嗎啉，加樣完畢後，反應自然恢復至室溫。並繼續反應l小時，至反應完 全。加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3次和飽和食鹽水洗滌3次，有機層用無水硫酸鈉十燥，過濾 出乾燥劑，加入80ml哌啶，攪拌20分鐘，減壓蒸T-，得黃色油狀物，用石油醚洗滌乾燥得 固體18. 29克。實施例2 三肽化合物Asp(OBut)-Val-Try(Bzl)Obzl HC1的合成。將實施例1中合成的二肽化合物18.29克，用160ml 二氯甲垸溶解預冷至-15'C ，備用。 將16. 46克Fmoc-Asp-OH溶解於160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基嗎啉，反 應瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反應10分鐘後，再向反 應瓶內加入上述預冷的脫Fmoc-保護後的二肽的二氯甲烷溶液，將反應自然恢復至室溫，並 繼續攪拌1小時左右，用TLC和HPLC檢測反應至完全結束後，加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3 次和飽和食鹽水洗滌3次，有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾出乾燥劑，加入80ml哌啶，攪拌20分鐘，減壓蒸乾，得黃色油狀物，用石油醚洗滌乾燥得固體25.36克。 實施例3 四肽化合物Lys(OBut)- Asp (OBut)-Val-Try (Bzl) Obzl HC1的合成。將實施例2中合成的三肽化合物25. 36克，用160ml 二氯甲烷溶解預冷至-15。C，放置冰相備用o使18. 74克Fmoc-Lys ( OBut)-OH溶於160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基嗎啉， 反應瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6.76ml的氯甲酸丁酯，反應10分鐘後，再向 反應瓶內加入上述預冷的脫Fmoc-保護後的三肽的二氯甲烷溶液，將反應自然恢復至室溫， 並繼續攪拌1小時左右，用TLC和HPLC檢測反應至完全結束後，加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3 次和飽和食鹽水洗滌3次，有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾出乾燥劑，加入80ml哌啶，攪 袢20分鐘，減壓蒸乾，得黃色油狀物，用石油醚洗漆乾燥得固體34.45克。 實施例4 五肽化合物Arg- Lys(OBut)- Asp(0But)-Va1-Try (Bzl)Obzl HC1的合成。將實施例3中合成的三肽化合物34. 45克，用160ml 二氯甲垸溶解預冷至-15'C ,放置冰 箱備用。將13. 12克Boc-Arg-OH HC1溶於160ml 二氯甲烷中，向其中加入35ml N-甲基嗎啉， 反應瓶冷卻，在-20 -15'C條件下向其中加入6. 76ml的氯甲酸丁酯，反應10分鐘後，再向 反應瓶內加入上述預冷的脫Fmoc-保護後的四肽的二氯甲垸溶液，將反應自然恢復至室溫， 並繼續攪拌1小時左右，用TLC和HPLC檢測反應至完全結束後，加入2%稀鹽酸水溶液洗滌3 次和飽和食鹽水洗滌3次有機層用無水硫酸鈉乾燥，過濾出乾燥劑，加入80ml哌啶，攪 拌20分鐘，減壓蒸乾，得黃色油狀物，用石油醚洗滌乾燥得固體50.65克。 實施例5胸腺五肽粗肽的合成向50.65克五肽化合物Arg- Lys(0But)- Asp (OBut) -Val-Try (Bzl) Obzl HC1中加入 400 ml切割液(95%TFA、 2. 5%水、2. 5%巰基茴香醚)反應2小時，冷卻至-40。C。加入用乙 醚5L和石油醚10L (預先冷卻至-4CTC)的混合溶液析出結品。然後離心乾燥得胸腺五肽粗 品約40克。實施例6胸腺五肽的純化將40克胸腺五肽粗品溶於200ml水中，調PH值8. 0，製備型高壓液相色譜柱純化(C18 柱乙腈/水梯度洗脫)冷凍乾燥機乾燥得胸腺五肽為白色凍乾粉狀固體16克，收率60%。
權利要求
1.一種合成胸腺五肽Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH的方法，其特徵在於進行如下步驟的反應(1)酪氨酸苄酯鹽酸鹽為起始原料，以N-甲基嗎啉為催化劑，採用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Fmoc-Val-OH形成高活性的混合酸酐，與Tyr(Bzl)-Obzl·HCl反應，得到Fmoc-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl二肽；(2)採用脫保護試劑將(1)中製得的二肽的氨端脫保護，得到Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl二肽；(3)以N-甲基嗎啉為催化劑，採用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Fmoc-Asp(OBut)-OH形成高活性的混合酸酐，使(2)中製得的產物與Fmoc-Asp(OBut)-OH反應得到Fmoc-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl三肽；(4)採用脫保護試劑將(3)中製得的三肽的氨端脫保護，得到Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl三肽；(5)以N-甲基嗎啉為催化劑，採用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Fmoc-Lys(OBut)-OH形成高活性的混合酸酐，與(4)中製得的產物反應，得到Fmoc-Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl四肽；(6)採用脫保護試劑將(5)中製得的四肽的氨端脫保護，得到Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl·HCl四肽；(7)以N-甲基嗎啉為催化劑，採用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化Boc-Arg-OH·HCl形成高活性的混合酸酐，與(6)中製得的產物反應，得到保護的Boc-Arg-Lys(OBut)-Asp(OBut)-Val-Tyr(Bzl)-Obzl五肽；(8)將(7)中製得的五肽中加入適量的TFA/H2O/TIS＝95/2.5/2.5脫保護，得到Arg-Lys-Asp-Val-Tyr-OH五肽。
2. 權利要求1的方法，所述方法還包括將(8)中製得的產物經C18反相柱純化脫鹽，得到純 化產物。
3. 權利要求1的方法縮合步驟採用氯甲酸乙酯或氯甲酸異丁酯為活化劑。
4. 權利要求1的方法所述，其步驟(1)、 (3)、 (5)和(7)中混合酸酐生成過程中的反應溫 度為-20'C -lOt:,各肽生成反應溫度為-1(TC (TC，其步驟(2)、 (4)、 (6)脫保護反應溫 度為20"C 30。C，其步驟(8)脫保護反應溫度為10'C 4(TC。
5. 權利要求1的方法所述，其步驟(1)、 (3)、 (5)和(7)中混合酸酐生成過程中的反應時 間為0.5 1小時，各肽生成反應為] 4小時，其步驟(2)、 (4)、 (6)脫保護反應時間為 20分鐘~40分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種胸腺五肽的製備方法。包括如下步驟以酪氨酸苄酯鹽酸鹽為起始原料，以N-甲基嗎啉為催化劑，採用氯甲酸烷基酯為活化劑，活化被保護的胺基酸形成高活性的混合酸酐與氨基端裸露的胺基酸或肽反應。通過二肽合成-三肽合成-四肽合成-五肽合成-粗品生成-純化，製備高純度胸腺五肽。本發明的方法簡化了工藝，三廢汙染少，便於工業化實施。
文檔編號C07K1/02GK101597318SQ20081006465
公開日2009年12月9日 申請日期2008年6月3日 優先權日2008年6月3日
發明者任仲輝, 冷國慶, 李會成, 李鄭武, 勝 梁, 王永存, 田學萍, 葛存慧, 趙華南, 陳玉軍 申請人:哈藥集團生物工程有限公司