一種用於治療眼睛血管增生的蛋白質的製作方法

2023-06-12 08:28:31

專利名稱：一種用於治療眼睛血管增生的蛋白質的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蛋白質，具體涉及一種用於治療眼睛血管增生的蛋白質。
背景技術：
致盲的原因有多種，由於各種原因導致眼睛的血管增生是主要的致盲原因之一。 引起眼睛的血管增生的常見病因有1、各種慢性進行性高血壓或動脈硬化以及視網膜靜脈炎等疾病並發的視網膜中央靜脈總幹或分支阻塞和糖尿病視網膜病變等引起的視網膜大面積慢性毛細血管缺血、缺氧、產生血管生成因子，從而導致新生血管形成。2、早產兒視網膜病變，多見於過量吸氧。早產兒視網膜尚未發育完善，以周邊部最不成熟，處於高氧環境下，視網膜血管收縮、阻塞，使局部缺血、缺氧，誘發視網膜血管異常增生。3、滲出性年齡相關性黃斑變性、病理性近視等眼底退行性變性。大多位於後極部，是典型的脈絡膜毛細血管-玻璃膜-視網膜色素上皮複合體病變。玻璃膜連同色素上皮皸裂，脈絡膜血管增生並由皸裂處向視網膜神經上皮層下生長。4、各種原因所致的角膜損傷、潰瘍或炎症引起的角膜或結膜血管增生。目前對於上述原因所致的眼睛的血管增生主要是採取中醫療法或雷射等物理療法，但是療效不理想，尚沒有特效的抑制眼睛的血管增生的藥物。致使血管增生導致的盲症還沒能得到有效的控制，而是隨著老齡人口的增加等原因，血管增生所致的盲症呈增多之趨勢。當前，亟待於開發新的抑制眼睛血管增生的藥物。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於治療眼睛血管增生的蛋白質。本發明所採用的技術方案是一種用於治療眼睛血管增生的蛋白質 (Canstatin-N)，具有以下基因序列ATG GTC AGC ATC GGC TAC CTC CTG GTG AAG CAC AGC CAG ACG GACCAG GAG CCC ATG TGC CCG GTG GGC ATG AAC AAA CTC TGG AGT GGA TACAGC CTG CTG TAC TTC GAG GGC CAG GAG AAG GCG CAC MC CAG GACCTG GGG CTG GCG GGC TCC TGC CTG GCG CGG TTC AGC ACC ATG CCC TTCCTG TAC TGC MC CCT GGT GAT GTC TGC TAC TAT GCC AGC CGG MC GACMG TCC TAC TGG CTC TCT ACC ACT GCG CCG CTG CCC CAT CAT CAT CATCAT CATTAG0上述蛋白質(Canstatin-N)由基因序列編碼的胺基酸組成如下Met Val Ser lie Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu Pro Met CysPro Val Gly Met Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln GluLys Ala His Asn Gln Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr MetPro Phe Leu Tyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys SerTyr Trp Leu Ser Thr Thr Ala Pro Leu Pro His His His His His His。本發明所提供的蛋白質(Canstatin-N)的製備方法是提取人臍帶靜脈基因組 DNA作為模板，根據血管能抑素(canstatin)的N端1 89胺基酸基因片段(canstatin-N) 的序列合成基因片段特異引物
上遊引物5，CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT3，；下遊引物5，CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCC A 3，；用反轉錄PCR方法從人基因組中擴增血管能抑素(canstatin)的N端1 89胺基酸基因片段canstatin-N，並在其序列的C末端加上his純化標籤(經DNA序列分析證明正確)；然後將這一基因片段重組於Pichia pastoris基因組，在Pichia pastoris中表達Canstatin-N蛋白；再用離子交換方法和親和層析方法純化Canstatin-N蛋白。通過蛋白電泳(在SDS-PAGE上呈現純化的目標蛋白的分子量符合Canstatin-N的分子量)和蛋白印跡實驗證明純化的目標蛋白正確(純化的目標蛋白能夠與Canstatin-N蛋白的抗體發生特異結合)；通過抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成試驗證明純化的Canstatin-N蛋白具有抑制新生血管生成的活性。利用上述蛋白質製備醫藥製品，可有效地治療人眼睛血管增生。本發明所提供的Canstatin-N蛋白是一種血管生成抑制因子，用Canstatin-N 蛋白進行抑制人血管內皮細胞試驗，證明Canstatin-N蛋白致使人血管內皮細胞凋亡率達93% ；通過建立試驗小鼠眼睛血管增生模型，然後用Canstatin-N蛋白進行治療，證明 Canstatin-N蛋白能有效地治療眼睛視網膜血管增生，是一種治療眼睛血管增生的藥物。本發明以人臍帶靜脈基因組DNA為模板進行擴增得到canstatin-N基因，將 canstatin-N基因重組於Pichia pastoris基因組進行表達獲得的Canstatin-N蛋白，可有效地提高血管內皮細胞凋亡率，抑制人血管內皮細胞，有效地抑制和治療眼睛視網膜血管增生，為生產特效的抑制眼睛血管增生的藥物的研究和開發創造了必要的條件，具有重要的理論和實踐意義。
具體實施例方式下面對本發明做進一步說明。Canstatin-N 蛋白的製備1、提取人臍帶靜脈基因組DNA作為模板，根據血管能抑素的N端1 89胺基酸基因片段的序列合成基因片段特異引物上遊引物5，CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT3，；下遊引物5，CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCC A 3，；用反轉錄PCR方法從人基因組中擴增血管能抑素(canstatin)的N端1 89胺基酸基因片段canstatin-N，並在其序列的C末端加上his純化標籤。2、從Pichia pastoris中擴增pGAP啟動子(三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子)(pGAP 是Pichia pastoris的組成型強啟動子)；3、通過DNA的酶切和連接作用，將步驟1獲得的融合了 his純化標籤的 canstatin-N DNA插入Pichia pastoris表達載體(pGAP為啟動子，G418抗性基因作為篩選標記，不含引導蛋白分泌的信號肽)的多克隆位點，將這一載體轉化Pichia pastoris基因組，並將轉化物塗布於G418-YPD平板含G418為彡300 μ g/mL的YPD平板。4、從步驟3的G418-YPD平板在挑選Pichia pastoris重組子作為工程菌株；
5、將工程菌株菌液接種於液體培養基中液體培養基的配方(每升):85%磷酸 26. 7ml，CaSO4 · 2H20 0. 93g, K2SO4 18. 2g, MgSO4 · 7H20 14. 9g, KOH 4. 13g,葡萄糖 40g,蛋白腖 20g，Yeast extract IOg, PTM4 微量元素 4ml(PTM4 配方(每升):CuS04 · 5H20 2. Og, NaI · 2H20 0. lg, MnSO4 · H2O 3. Og, Na2MoO4 · 2H20 0. 2g, H3BO3O. 02g, CoCl2 · 6H20 1. 05g, ZnCl27. Og, Fe2(SO4)3 · 7H20 22g，生物素0. 2g，硫酸lml)，在生物反應器中進行發酵表達 Canstatin-N蛋白。其發酵參數為溫度觀 30°C，pH5. 0，攪拌轉速200-900r/min。發酵 1 2d後離心收穫細胞。用蝸牛酶(6mg/mL，用lmol/L的山梨醇配置)裂解細胞，離心收穫上清。先用離子交換劑(SP-kpharose FastFlow)進行純化，然後用Ni-Agarose His標籤蛋白純化試劑盒進行進一步純化Canstatin-N蛋白。通過蛋白電泳(在SDS-PAGE上呈現純化的目標蛋白的分子量符合Canstatin-N的分子量)和蛋白印跡實驗(純化的目標蛋白能夠與Canstatin-N蛋白的抗血清特異結合)證明純化的目標蛋白正確；通過抑制雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成試驗(純化的目標蛋白能抑制6天齡雞胚絨毛尿囊膜的新生血管的生成)證明純化的Canstatin-N蛋白具有抑制新生血管生成的活性。實用例一、取Canstatin-N蛋白0. 8mg溶解於5ml生理鹽水(0. 85% NaCl)，用孔徑為0. 1 μ m的濾膜過濾除去細菌及病毒，然後加於995ml無菌的生理鹽水中製備成滴眼液。實用例二、取Canstatin-N蛋白0. 5mg溶解於5ml PBS溶液(每升PBS溶液的製備=NaCl 8g, KCl 0. 2g, Na2HP041. 44g, KH2P040. 24g 溶解於 800ml 蒸餾水中鹽酸調 pH 到 7. 4然後加水補充到1000ml，15磅20分高壓滅菌冷卻至室溫)，用孔徑為0. 1 μ m的濾膜過濾除去細菌及病毒，然後加於995ml無菌的PBS溶液中製備成滴眼液。滴眼液療效檢測實驗一(一 )視網膜血管增生模型的製作取30隻7天齡新生昆明種小鼠。將其中的20隻7天齡新生昆明種小鼠與母鼠一起放置於密閉的玻璃器中，輸入醫用純氧氣，用自動調控測氧儀維持箱內氧飽和度75%，持續5天。5天後，將這些新生大鼠移入正常氧環境中再飼養7天，誘發新生鼠視網膜血管新生。另外10隻7天齡新生昆明種小鼠與母鼠置於正常氧環境中再飼養12天。作為正常對照鼠(C組)。( 二 )滴眼液治療視網膜血管增生方法將以上製備的視網膜血管增生模型鼠分成兩組(A，B)，每組10隻。A組鼠的左(AL) 眼滴實例1製備的滴眼液，每隻眼睛滴25 μ 1/次，每天3至5次；右眼(AR)滴生理鹽水，每隻眼睛滴25μ 1/次，用藥頻率同左眼；B組鼠的左眼(BL)滴實例2製備的滴眼液，每隻眼睛滴25 μ 1/次，每天3至5次；右眼(B 滴PBS溶液，每隻眼睛滴25 μ 1/次，用藥頻率同左眼。治療時間為三周。(三)滴眼液治療視網膜血管增生的療效分析將以上20隻試驗鼠處死，眼球摘除後放入多聚甲醛溶液中。C固定Mh，組織切片計算突破內界膜的血管內皮細胞核的數量。每隻眼睛觀察20個視野(表1)。結果分析(表 2)表明與對照組(右眼)相比，試驗組A和B的右眼的血管內皮細胞核的數量呈顯著性減少(P < 0. 05)。因此Canstatin-N眼藥水對於眼睛的血管增生有治療作用。結果分析(表2)表明與負對照(AR、BR組)比較，試驗組(AL、BL組)的血管內皮細胞核呈顯著性減少(P < 0. 05)。結論=Canstatin-N蛋白對眼睛血管增生有治療作用。表1.用Canstatin-N蛋白治療眼睛血管增生結果血管內皮細胞核數量(個)
權利要求
1.一種用於治療眼睛血管增生的蛋白質，其特徵在於，具有以下基因序列ATG GTC AGC ATC GGC TAC CTC CTG GTG AAG CAC AGC CAG ACG GACCAG GAG CCC ATG TGC CCG GTG GGC ATG AAC AAA CTC TGG AGT GGA TACAGC CTG CTG TAC TTC GAG GGC CAG GAG AAG GCG CAC AAC CAG GACCTG GGG CTG GCG GGC TCC TGC CTG GCG CGG TTC AGC ACC ATG CCC TTCCTG TAC TGC AAC CCT GGT GAT GTC TGC TAC TAT GCC AGC CGG AAC GACAAG TCC TAC TGG CTC TCT ACC ACT GCG CCG CTG CCC CAT CAT CAT CATCATCATTAG。
2.根據權利要求1所述的用於治療眼睛血管增生的蛋白質，其特徵在於，所述蛋白質由基因序列編碼的胺基酸組成如下Met Val SerIle Gly Tyr Leu Leu Val Lys His Ser Gln Thr Asp Gln Glu Pro Met Cys Pro Val GlyMet Asn Lys Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Leu Tyr Phe Glu Gly Gln Glu Lys Ala HisAsn Gln Asp Leu Gly Leu Ala Gly Ser Cys Leu Ala Arg Phe Ser Thr Met Pro Phe LeuTyr Cys Asn Pro Gly Asp Val Cys Tyr Tyr Ala Ser Arg Asn Asp Lys Ser Tyr Trp LeuSer Thr Thr Ala Pro Leu Pro His His His His His His。
3.—種權利要求1所述的用於治療眼睛血管增生的蛋白質的製備方法，其特徵在於 是提取人臍帶靜脈基因組DNA作為模板，根據血管能抑素的N端1 89胺基酸基因片段的序列合成基因片段特異引物上遊引物5』 CCGCGAATTCATGGTCAGCATCGGCTACCT 3』 ；下遊引物5， CAAGCGGCCGCCTAATGATGATGATGATGATGGGGCAGCGGCGCAGTGGTAGAGAGCCA3，；用反轉錄PCR方法從人基因組中擴增血管能抑素的N端1 89胺基酸基因片段 canstatin-N,並在其序列的C末端加上his純化標籤；然後將這一基因片段重組於Pichia pastoris基因組，在Pichia pastoris中表達Canstatin-Ν蛋白；再用離子交換方法和親和層析方法純化Canstatin-N蛋白。
4.根據權利要求1所述的用於治療眼睛血管增生的蛋白質，其特徵在於利用所述蛋白質製備治療人眼睛血管增生的醫藥製品。
全文摘要
本發明涉及一種用於治療眼睛血管增生的蛋白質，是以人臍帶靜脈基因組DNA作為模板，設計基因片段特異引物，用反轉錄PCR方法擴增血管能抑素的N端1～89胺基酸基因片段，並在其序列的C末端加上his純化標籤；然後再重組於Pichia pastoris基因組，在Pichia pastoris中表達Canstatin-N蛋白；再用離子交換方法和親和層析方法純化Canstatin-N蛋白，所得蛋白質具有序列表中1項下的序列。本發明以人臍帶靜脈基因組DNA為模板進行擴增得到的Canstatin-N蛋白，可有效地抑制人血管內皮細胞，有效地抑制和治療眼睛視網膜血管增生，為生產特效的抑制眼睛血管增生的藥物的研究和開發創造了必要的條件，具有重要的理論和實踐意義。
文檔編號C12R1/84GK102250914SQ20101021612
公開日2011年11月23日 申請日期2010年6月17日 優先權日2010年6月17日
發明者尹慧祥, 張添元, 張愛聯, 羅進賢 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所