一種快速克隆和鑑定細菌β－半乳糖苷酶基因的方法

2023-06-12 16:05:26

專利名稱：一種快速克隆和鑑定細菌β－半乳糖苷酶基因的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術和分子生物學領域，尤其涉及一種克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法，本方法為快速獲得β-半乳糖苷酶基因奠定基礎。
背景技術：
β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)，商品名為乳糖酶(lactase，Lac)，能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖，使牛乳中的乳糖易於吸收。β-半乳糖苷酶廣泛分布於動物、植物和微生物中(高煥春，1996)，但是對於人類，隨著年齡的增長，腸道內乳糖酶活性迅速降低，出現「乳糖不耐症」；乳酸菌細胞內一般具有β-半乳糖苷酶活性，經過乳酸菌發酵的乳製品乳糖含量大幅度降低(de Vrese M，et al，2001)，添加外源乳糖酶也是降低乳製品乳糖的有效途徑(萬國餘，1999)。目前乳糖酶主要來自於酵母和黴菌發酵。酵母菌中的乳糖酶為胞內酶，提純工藝複雜，黴菌產生的乳糖酶通常不耐受高溫，因此，利用重組工程菌株生產乳糖酶受到重視。克隆β-半乳糖苷酶基因，實現其高效表達，獲得大量的乳糖酶，對生產低乳糖乳製品具有重要的作用。
目前克隆細菌中β-半乳糖苷酶基因的方法主要有2種一是根據已公開的基因序列設計引物，利用PCR技術直接擴增(汪川，2004；冉雪琴，2003)；另一種是鳥槍法，即通過構建DNA文庫，篩選含有β-半乳糖苷酶活性的轉化子，然後進行序列測定。由於不同來源的β-半乳糖苷酶基因序列的差異，利用第一種方法對克隆新種屬β-半乳糖苷酶基因及其啟動子序列存在很大困難；而後一種方法用於構建DNA文庫的常用克隆載體大多以β-半乳糖苷酶作為報告基因(例如商品化載體pUC18、pUC19)，若以此類載體克隆外源β-半乳糖苷酶基因，因無法與自身攜帶的β-半乳糖苷酶基因片段區別，而不能用於β-半乳糖苷酶基因的克隆。
鑑於目前實驗方法的局限性，研究和開發一種快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法十分必要。

發明內容
針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一種快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法。利用該方法可以對外源DNA片段是否含有β-半乳糖苷酶基因以及其攜帶的啟動子類型進行快速鑑定和克隆。
本發明方法的技術方案總體是通過對商品化的、能與宿主菌E.coli形成α互補的克隆載體如pUC18、pUC19載體上攜帶的β-半乳糖苷酶N-端基因片段的刪除，而獲得遺傳改造後的載體pUC18(lac-)、pUC19(lac-)；並利用這類載體，構建DNA文庫，根據在IPTG，X-gal平板上形成藍色/白色菌落的篩選，鑑別含有β-半乳糖苷酶基因的重組子；並根據藍色菌落形成是否需要IPTG誘導，鑑別β-半乳糖苷酶基因的啟動子類型。
本發明所述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法，由以下步驟組成(1)Lac-載體的構建選擇市售能與宿主菌E.coli JM109或E.coli DH5α形成α互補的載體pUC18、pUC19[TaKaRa公司的商品化載體，大小為2.69kb，其中，篩選標記是氨苄青黴素抗性、大腸桿菌的複製子、β-半乳糖苷酶的N-端序列，和多種限制型內切酶的內切位點(即多克隆位點)]之一，以其任何一種質粒DNA為模板，通過反向PCR(polymerase chainreaction，PCR)進行擴增，擴增後的PCR產物經過切膠回收，再使用Xho I內切酶37℃處理，並對酶切片段純化，然後加入T4DNA連接酶連接；取上述連接液與E.coli JM109或E.coli DH5α感受態細胞混合，冰浴，42℃熱衝擊90s，冰上放置2min後，加入LB培養基37℃培養2h，塗布含有100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板，37℃培養過夜，挑取轉化子，提取質粒DNA，即得到遺傳改造後的載體pUC18(lac-)或pUC19(lac-)；其中上述反向PCR使用的引物序列為引物pUCF5』GTTCTCGAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3』；引物pUCR5』ACGCTCGAGCACACCGCATATGGTGCACTC 3』；PCR條件94℃ 4min；94℃40s，58℃ 40s，72℃ 2min，共30個循環；72℃延伸10min；上述步驟(1)構建的載體pUC18(lac-)或pUC19(lac-)其原載體上攜帶的、位於載體334-489位、長度為156bp的核苷酸序列被刪除，保留了載體的抗生素標記、多克隆位點和複製子，破壞了載體上β-半乳糖苷酶的N-端序列，不能再與宿主菌E.coliJM09或E.coli DH5α形成α互補，從而可以實現對外源β-半乳糖苷酶基因進行鑑定和克隆。
(2)DNA文庫構建以改良的CTAB提取法提取目的菌株的基因組DNA，根據(1)構建的載體pUC18(lac-)或pUC19(lac-)上含有的常用限制性內切酶酶切位點BamHI，HindIII，PstI，KpnI，EcoRI，XbaI，分別對提取得基因組DNA進行酶切，酶切時間控制在2-4h，DNA用量及內切酶用量按照說明書(TaKaRa公司產品)添加；選取能將DNA完全切成彌散條帶的內切酶，按照上述條件再次酶切提取得基因組DNA，利用Gel Extraction Kit(OMEGA公司產品)回收2-6Kb之間的DNA片段，並使回收後DNA濃度不小於10ng/μL；同時使用相同內切酶單酶切pUC18(lac-)或pUC19(lac-)質粒DNA，並去磷酸化處理，再利用Gel ExtractionKit(OMEGA公司產品)回收目的DNA片段，並使回收後DNA濃度不小於10ng/μL；將載體DNA與外源DNA片段按體積比1∶3-10的比例混合，加入T4DNA連接酶連接，連接液42℃熱擊轉化E.coliJM109或E.coli DH5α感受態細胞，加入LB液體培養基培養2h後，得到重組DNA文庫；其中上述改良的CTAB提取菌株基因組DNA的方法是①取3mL過夜培養的菌液，離心收集菌體；②重懸於567μL含2mg/mL溶菌酶的TE緩衝液，37℃處理1h；③加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，37℃繼續作用1h；④加入100μL 5M NaCl和80μLCTAB/NaCl溶液65℃作用10min；⑤等體積的氯仿異戊醇抽提後加入終濃度100μg/mL的RNaseA溶液，37℃處理30min；⑥用等體積的酚氯仿異戊醇和氯仿異戊醇各抽提一次，加入等體積異丙醇-20℃沉澱20min；⑦12000rpm離心10min，收集DNA，用70％乙醇洗滌2次，乾燥後，溶於40μL重蒸無菌水中；步驟(1)和步驟(2)中所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliJM109或E.coliDH5α單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞；上述感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
(3)β-半乳糖苷酶基因重組子的篩選將上述(2)構建的DNA文庫稀釋，取稀釋液均勻塗布於含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和氨苄青黴素的LB培養基平板上，37℃培養24h-28h，挑取藍色菌落，並進一步在相同的培養基平板上反覆劃線驗證，菌落仍然顯藍色，則推斷為該重組子含有β-半乳糖苷酶基因片段；其中上述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基配方及製備方法是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4；121℃高壓蒸汽滅菌20min；待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG、20μg/mL X-gal和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內，備用；(4)β-半乳糖苷酶基因啟動子類型的鑑定挑取上述(3)純化的藍色菌落，接種在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，菌落仍能顯示藍色，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為組成型；如在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上為白色，在含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上則顯示藍色的菌落，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為誘導型。
上述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
上述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法中步驟(2)所述載體DNA與外源DNA片段的混合比例優選為1∶5。
上述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法中步驟(2)所述重組DNA文庫在加入100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基中擴增；貯存時加入終濃度為20％甘油，放於-20℃保存，備用。
上述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法中步驟(3)所述DNA文庫稀釋比例以1∶1-5為佳。
本發明所述克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法的優點是快速、簡便。根據在IPTG和X-gal的LB培養基上形成的藍色/白色菌落，可直接判定含有的β-半乳糖苷酶基因的重組子，並能對β-半乳糖苷酶基因基因的啟動子類型進行鑑定。
具體實施例方式下列實施例是對本發明的進一步的闡述，但本發明不限於此。
實施例1利用本專利公開的方法克隆巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC14581 β-半乳糖苷酶基因。
(1)pUC18(lac-)載體的構建選擇現有商品化的、能與宿主菌E.coli JM109形成α互補的載體pUC18，以其質粒DNA為模板，通過反向聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行擴增，擴增後的PCR產物經過切膠回收，再使用Xho I內切酶37℃處理4h，利用DNA回收試劑盒(OMEGA公司產品)對酶切片段純化，然後加入T4DNA連接酶16℃連接10小時。取10μL連接液與100μL E.coli JM109感受態細胞混合，冰浴30min，42℃熱衝擊90s，冰上放置2min後，加入500μL LB培養基，37℃培養2h，塗布含有100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板，37℃培養過夜。挑取轉化子，提取質粒DNA，即得到遺傳改造後的載體pUC18(lac-)。
其中，所述反向PCR使用的引物序列為引物pUCF5』GTTCTCGAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3』(含Xho I酶切位點)；引物pUCR5』ACGCTCGAGCACACCGCATATGGTGCACTC 3』(含Xho I酶切位點)。PCR條件94℃4min；94℃40s，58℃40s，72℃2min，共30個循環；72℃延伸10min。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliJM109單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(2)DNA文庫構建以改良的CTAB提取法提取目的菌株Bacillus megaterium ATCC14581的基因組DNA，根據上述(1)發明的載體pUC18(lac-)上含有的常用限制性內切酶酶切位點BamHI，HindIII，PstI，KpnI，EcoRI，XbaI，分別對基因組DNA進行酶切，酶切時間控制在2-4h，DNA用量及內切酶用量按照說明書(TaKaRa公司產品)添加。選取能將DNA完全切成彌散條帶的內切酶，按照上述條件再次酶切基因組DNA，利用Gel Extraction Kit(OMEGA公司產品)回收2-6Kb之間的DNA片段。回收後DNA濃度大於10ng/μL為宜。同時使用相同內切酶單酶切pUC18(lac-)質粒DNA，並去磷酸化處理，再利用Gel Extraction Kit回收目的DNA片段，回收後DNA濃度應不小於10ng/μL。
將載體DNA與外源DNA片段按1∶6的比例混合，加入1μL T4DNA連接酶，16℃連接12h，連接液42℃熱擊轉化E.coli JM109感受態細胞，加入1mL LB液體培養基，培養2h後，得到重組DNA文庫。該文庫可以在加入100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基中擴增，然後加入終濃度為20％甘油放於-20℃保存，備用。
其中，所述改良的CTAB提取細菌基因組DNA的方法是①取3mL過夜培養的菌液，離心收集菌體。②重懸於567μL含2mg/mL溶菌酶的TE緩衝液，37℃處理1h。③加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，37℃繼續作用1h。④加入100μL 5M NaCl和80μLCTAB/NaCl溶液65℃作用10min。⑤等體積的氯仿異戊醇抽提後加入終濃度100μg/mL的RNaseA溶液，37℃處理30min。⑥用等體積的酚氯仿異戊醇和氯仿異戊醇各抽提一次，加入等體積異丙醇-20℃沉澱20min。⑦12000rpm離心10min，收集DNA，用70％乙醇洗滌2次，乾燥後，溶於40μL重蒸無菌水中。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliJM109單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃ 5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(3)β-半乳糖苷酶基因重組子的篩選取上述(2)構建的DNA文庫，以無菌水進行1∶1稀釋，取20uL稀釋液均勻塗布於含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和氨苄青黴素的LB培養基平板上，37℃培養24h，挑取藍色菌落，並進一步在相同的培養基平板上反覆劃線驗證，菌落仍然顯藍色，則可推斷所得重組子含有β-半乳糖苷酶基因片段。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG、20μg/mL X-gal和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
(4)β-半乳糖苷酶基因啟動子類型的鑑定挑取上述(3)純化的藍色菌落，接種在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，菌落仍能顯示藍色，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為組成型；如在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上為白色，在含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上則顯示藍色的菌落，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為誘導型。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG、20μg/mL X-gal和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
實施例2利用本專利公開的方法克隆巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)ATCC14581 β-半乳糖苷酶基因。
(1)pUC19(lac-)載體的構建選擇現有商品化的、能與宿主菌E.coli JM109形成α互補的載體pUC19，以其質粒DNA為模板，通過反向聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行擴增，擴增後的PCR產物經過切膠回收，再使用Xho I內切酶37℃處理4小時，利用DNA回收試劑盒(OMEGA公司產品)對酶切片段純化，然後加入T4DNA連接酶16℃連接10小時。取10μL連接液與100μL E.coli JM109感受態細胞混合，冰浴30min，42℃熱衝擊90s，冰上放置2min後，加入500μL LB培養基，37℃培養2h，塗布含有100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板，37℃培養過夜。挑取轉化子，提取質粒DNA，即得到遺傳改造後的載體pUC19(lac-)。
其中，所述反向PCR使用的引物序列為引物pUCF5』GTTCTCGAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3』(含Xho I酶切位點)；引物pUCR5』ACGCTCGAGCACACCGCATATGGTGCACTC 3』(含Xho I酶切位點)。PCR條件94℃ 4min；94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 2min，共30個循環；72℃延伸10min。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliJM109單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃ 5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃ 5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(2)DNA文庫構建按照改良的CTAB提取法提取目的菌株Bacillus megaterium ATCC14581的基因組DNA，根據上述(1)發明的載體pUC19(lac-)上含有的常用限制性內切酶酶切位點BamHI，HindIII，PstI，KpnI，EcoRI，XbaI，分別對基因組DNA進行酶切，酶切時間控制在2-4h，DNA用量及內切酶用量按照說明書(TaKaRa公司產品)添加。選取能將DNA完全切成彌散條帶的內切酶，按照上述條件再次酶切基因組DNA，利用Gel Extraction Kit(OMEGA公司產品)回收2-6Kb之間的DNA片段。回收後DNA濃度大於10ng/μL為宜。同時使用相同內切酶單酶切pUC19(lac-)質粒DNA，並去磷酸化處理，再利用Gel Extraction Kit回收目的DNA片段，回收後DNA濃度應大於10ng/μL。
將載體DNA與外源DNA片段按1∶3的比例混合，加入1μL T4DNA連接酶，16℃連接12h，連接液42℃熱擊轉化E.coli JM109感受態細胞，加入1mL LB液體培養基，培養2h後，得到重組DNA文庫。該文庫可以在加入100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基中擴增，然後加入終濃度為20％甘油放於-20℃保存，備用。
其中，所述改良的CTAB提取細菌基因組DNA的方法是①取3mL過夜培養的菌液，離心收集菌體。②重懸於567μL含2mg/mL溶菌酶的TE緩衝液，37℃處理1h。③加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，37℃繼續作用1h。④加入100μL 5M NaCl和80μLCTAB/NaCl溶液65℃作用10min。⑤等體積的氯仿異戊醇抽提後加入終濃度100μg/mL的RNaseA溶液，37℃處理30min。⑥用等體積的酚氯仿異戊醇和氯仿異戊醇各抽提一次，加入等體積異丙醇-20℃沉澱20min。⑦12000rpm離心10min，收集DNA，用70％乙醇洗滌2次，乾燥後，溶於40μL重蒸無菌水中。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliJM109單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃ 5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(3)β-半乳糖苷酶基因重組子的篩選取上述(2)構建的DNA文庫，進行適當稀釋，取20uL稀釋液均勻塗布於含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，37℃培養24h，挑取藍色菌落，並進一步在相同的培養基平板上反覆劃線驗證，菌落仍然顯藍色，則可推斷所得重組子含有β-半乳糖苷酶基因片段。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、20μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
(4)β-半乳糖苷酶基因啟動子類型的鑑定挑取上述(3)純化的藍色菌落，接種在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，菌落仍能顯示藍色，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為組成型；如在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上為白色，在含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上則顯示藍色的菌落，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為誘導型。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG、20μg/mL X-gal和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
實施例3利用本專利公開的方法克隆環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)ATCC 31382 β-半乳糖苷酶基因。
(1)pUC18(lac-)載體的構建選擇現有商品化的、能與宿主菌E.coli DH5α形成α互補的載體pUC18，以其質粒DNA為模板，通過反向聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行擴增，擴增後的PCR產物經過切膠回收，再使用Xho I內切酶37℃處理4小時，利用DNA回收試劑盒(OMEGA公司產品)對酶切片段純化，然後加入T4DNA連接酶16℃連接10小時。取10μL連接液與100μL E.coli DH5α感受態細胞混合，冰浴30min，42℃熱衝擊90s，冰上放置2min後，加入500μL LB培養基，37℃培養2小時，塗布含有100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板，37℃培養過夜。挑取轉化子，提取質粒DNA，即得到遺傳改造後的載體pUC18(lac-)。
其中，
所述反向PCR使用的引物序列為引物pUCF5』GTTCTCGAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3』(含Xho I酶切位點)；引物pUCR5』ACGCTCGAGCACACCGCATATGGTGCACTC 3』(含Xho I酶切位點)。PCR條件94℃4min；94℃40s，58℃40s，72℃2min，共30個循環；72℃延伸10min。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliDH5α單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(2)DNA文庫構建按照改良的CTAB提取法提取目的菌株Bacillus circulans ATCC 31382的基因組DNA，根據上述(1)發明的載體pUC18(lac-)上含有的常用限制性內切酶酶切位點BamHI，HindIII，PstI，KpnI，EcoRI，XbaI，分別對基因組DNA進行酶切，酶切時間控制在2-4h，DNA用量及內切酶用量按照說明書(TaKaRa公司產品)添加。選取能將DNA完全切成彌散條帶的內切酶，按照上述條件再次酶切基因組DNA，利用Gel Extraction Kit(OMEGA公司產品)回收2-6Kb之間的DNA片段。回收後DNA濃度大於10ng/μL為宜。同時使用相同內切酶單酶切pUC18(lac-)質粒DNA，並去磷酸化處理，再利用Gel Extraction Kit回收目的DNA片段，回收後DNA濃度應大於10ng/μL。
將載體DNA與外源DNA片段按1∶5的比例混合，加入1μL T4DNA連接酶，16℃連接12h，連接液42℃熱擊轉化E.coli DH5α感受態細胞，加入1mL LB液體培養基，培養2h後，得到重組DNA文庫。該文庫可以在加入100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基中擴增，然後加入終濃度為20％甘油放於-20℃保存，備用。
其中，所述改良的CTAB提取細菌基因組DNA的方法是①取3mL過夜培養的菌液，離心收集菌體。②重懸於567μL含2mg/mL溶菌酶的TE緩衝液，37℃處理1h。③加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，37℃繼續作用1h。④加入100μL 5M NaCl和80μLCTAB/NaCl溶液65℃作用10min。⑤等體積的氯仿異戊醇抽提後加入終濃度100μg/mL的RNaseA溶液，37℃處理30min。⑥用等體積的酚氯仿異戊醇和氯仿異戊醇各抽提一次，加入等體積異丙醇-20℃沉澱20min。⑦12000rpm離心10min，收集DNA，用70％乙醇洗滌2次，乾燥後，溶於40μL重蒸無菌水中。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliDH5α單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(3)β-半乳糖苷酶基因重組子的篩選取上述(2)構建的DNA文庫，進行適當稀釋，取20uL稀釋液均勻塗布於含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，37℃培養24h，挑取藍色菌落，並進一步在相同的培養基平板上反覆劃線驗證，菌落仍然顯藍色，則可推斷所得重組子含有β-半乳糖苷酶基因片段。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基配方及製法是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、20μg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
(4)β-半乳糖苷酶基因啟動子類型的鑑定挑取上述(3)純化的藍色菌落，接種在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，菌落仍能顯示藍色，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為組成型；如在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上為白色，在含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上則顯示藍色的菌落，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為誘導型。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG、20μg/mL X-gal和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
實施例4利用本專利公開的方法克隆環狀芽孢桿菌(Bacillus circulans)ATCC 31382 β-半乳糖苷酶基因。
(1)pUC19(lac-)載體的構建選擇現有商品化的、能與宿主菌E.coli DH5α形成α互補的載體pUC19，以 其質粒DNA為模板，通過反向聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)進行擴增，擴增後的PCR產物經過切膠回收，再使用Xho I內切酶37℃處理4小時，利用DNA回收試劑盒(OMEGA公司產品)對酶切片段純化，然後加入T4DNA連接酶16℃連接10小時。取10μL連接液與100μL E.coli DH5α感受態細胞混合，冰浴30min，42℃熱衝擊90s，冰上放置2min後，加入500μL LB培養基，37℃培養2小時，塗布含有100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板，37℃培養過夜。挑取轉化子，提取質粒DNA，即得到遺傳改造後的載體pUC19(lac-)。
其中，所述反向PCR使用的引物序列為引物pUCF5』GTTCTCGAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3』(含Xho I酶切位點)；引物pUCR5』ACGCTCGAGCACACCGCATATGGTGCACTC 3』(含Xho I酶切位點)。PCR條件94℃4min；94℃40s，58℃40s，72℃ 2min，共30個循環；72℃延伸10min。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliDH5α單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃ 5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(2)DNA文庫構建按照改良的CTAB提取法提取目的菌株Bacillus circulans ATCC 31382的基因組DNA，根據上述(1)發明的載體pUC19(lac-)上含有的常用限制性內切酶酶切位點BamHI，HindIII，PstI，KpnI，EcoRI，XbaI，分別對基因組DNA進行酶切，酶切時間控制在2-4h，DNA用量及內切酶用量按照說明書(TaKaRa公司產品)添加。選取能將DNA完全切成彌散條帶的內切酶，按照上述條件再次酶切基因組DNA，利用Gel Extraction Kit(OMEGA公司產品)回收2-6Kb之間的DNA片段。回收後DNA濃度大於10ng/μL為宜。同時使用相同內切酶單酶切pUC19(lac-)質粒DNA，並去磷酸化處理，再利用Gel Extraction Kit回收目的DNA片段，回收後DNA濃度應大於10ng/μL。
將載體DNA與外源DNA片段按1∶10的比例混合，加入1μL T4DNA連接酶，16℃連接12h，連接液42℃熱擊轉化E.coli DH5α感受態細胞，加入1mL LB液體培養基，培養2h後，得到重組DNA文庫。該文庫可以在加入100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基中擴增，然後加入終濃度為20％甘油放於-20℃保存，備用。
其中，所述改良的CTAB提取細菌基因組DNA的方法是①取3mL過夜培養的菌液，離心收集菌體。②重懸於567μL含2mg/mL溶菌酶的TE緩衝液，37℃處理1h。③加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，37℃繼續作用1h。④加入100μL 5M NaCl和80μLCTAB/NaCl溶液65℃作用10min。⑤等體積的氯仿異戊醇抽提後加入終濃度100μg/mL的RNaseA溶液，37℃處理30min。⑥用等體積的酚氯仿異戊醇和氯仿異戊醇各抽提一次，加入等體積異丙醇-20℃沉澱20min。⑦12000rpm離心10min，收集DNA，用70％乙醇洗滌2次，乾燥後，溶於40μL重蒸無菌水中。
所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliDH5α單菌落於5mL液體LB培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃ 5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞。這種感受態細胞一般冰浴不超過48h，使用效果較好；如添加終濃度為20％甘油，-70℃下可保存半年。
所述LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。
(3)β-半乳糖苷酶基因重組子的篩選取上述(2)構建的DNA文庫，進行適當稀釋，取20uL稀釋液均勻塗布於含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，37℃培養24h，挑取藍色菌落，並進一步在相同的培養基平板上反覆劃線驗證，菌落仍然顯藍色，則可推斷所得重組子含有β-半乳糖苷酶基因片段。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、20μg/mL 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
(4)β-半乳糖苷酶基因啟動子類型的鑑定挑取上述(3)純化的藍色菌落，接種在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，菌落仍能顯示藍色，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為組成型；如在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上為白色，在含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上則顯示藍色的菌落，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為誘導型。
其中，所述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基的配方是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaGl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4，121℃高壓蒸汽滅菌20min。待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的IPTG、20μg/mL X-gal和100μg/mL氨苄青黴素(Amp)，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內。
權利要求
1.一種快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法，由以下步驟組成(1)Lac-載體的構建選擇市售能與宿主菌E.coli JM109或E.coli DH5α形成α互補的載體pUC18、pUC19之一，以其任何一種質粒DNA為模板，通過反向PCR進行擴增，擴增後的PCR產物經過切膠回收，再使用Xho I內切酶37℃處理，並對酶切片段純化，然後加入T4DNA連接酶連接；取上述連接液與E.coli JM109或E.coli DH5α感受態細胞混合，冰浴，42℃熱衝擊90s，冰上放置2min後，加入LB培養基37℃培養2h，塗布含有100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基平板，37℃培養過夜，挑取轉化子，提取質粒DNA，即得到遺傳改造後的載體pUC18(lac-)或pUC19(lac-)；其中上述反向PCR使用的引物序列為引物pUCF5』GTTCTCGAGCGCCAGGGTTTTCCCAGTCAC3』；引物pUCR5』ACGCTCGAGCACACCGCATATGGTGCACTC 3』；PCR條件94℃ 4min；94℃ 40s，58℃ 40s，72℃ 2min，共30個循環；72℃延伸10min；(2)DNA文庫構建以改良的CTAB提取法提取目的菌株的基因組DNA，根據(1)構建的載體pUC18(lac-)或pUC19(lac-)上含有的常用限制性內切酶酶切位點BamHI，HindIII，PstI，KpnI，EcoRI，XbaI，分別對提取得基因組DNA進行酶切，酶切時間控制在2-4h；選取能將DNA完全切成彌散條帶的內切酶，按照上述條件再次酶切提取的基因組DNA，回收2-6Kb之間的DNA片段，並使回收後DNA濃度不小於10ng/μL；同時使用相同內切酶單酶切pUC18(lac-)或pUC19(lac-)質粒DNA，並去磷酸化處理，再利用Gel Extraction Kit回收目的DNA片段，並使回收後DNA濃度不小於10ng/μL；將載體DNA與外源DNA片段按體積比1∶3-10的比例混合，加入T4DNA連接酶連接，連接液42℃熱擊轉化E.coli JM109或E.coliDH5α感受態細胞，加入LB液體培養基培養2h後，得到重組DNA文庫；其中上述改良的CTAB提取菌株基因組DNA的方法是①取3mL過夜培養的菌液，離心收集菌體；②重懸於567μL含2mg/mL溶菌酶的TE緩衝液，37℃處理1h；③加入30μL 10％的SDS和3μL 20mg/mL的蛋白酶K，37℃繼續作用1h；④加入100μL 5M NaCl和80μLCTAB/NaCl溶液65℃作用10min；⑤等體積的氯仿異戊醇抽提後加入終濃度100μg/mL的RNaseA溶液，37℃處理30min；⑥用等體積的酚氯仿異戊醇和氯仿異戊醇各抽提一次，加入等體積異丙醇-20℃沉澱20min；⑦12000rpm離心10min，收集DNA，用70％乙醇洗滌2次，乾燥後，溶於40μL重蒸無菌水中；步驟(1)和步驟(2)中所述E.coli感受態細胞的製備過程是①從平板上挑取E.coliJM109或E.coliDH5α單菌落於5mL LB液體培養基中，37℃培養過夜；②以2％接種量轉接5mL新鮮LB液體培養基，搖床培養2-3h至OD600＝0.4-0.6；③冰浴10min，4℃5000rpm離心5min，收集菌體；④棄去上清，用750μL預冷的0.1M CaCl2重懸菌體，冰上放置10min；⑤4℃ 5000rpm離心5min，棄去上清，菌體用100μL預冷的0.1M CaCl2懸浮，即得感受態細胞；(3)β-半乳糖苷酶基因重組子的篩選將上述(2)構建的DNA文庫稀釋，取稀釋液均勻塗布於含有異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)和氨苄青黴素的LB培養基平板上，37℃培養24h-28h，挑取藍色菌落，並進一步在相同的培養基平板上反覆劃線驗證，菌落仍然顯藍色，則推斷為該重組子含有β-半乳糖苷酶基因片段；其中上述IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基配方及製備方法是蛋白腖1g，酵母粉0.5g，NaCl 0.5g，瓊脂粉1.5g，100mL蒸餾水，pH7.2-7.4；121℃高壓蒸汽滅菌20min；待冷卻至60℃左右，加入終濃度為0.1mM的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷、20μg/mL 5-溴-4-氯-3-引哚-β-D-半乳糖苷和100μg/mL氨苄青黴素，混勻後，傾注已滅菌的培養皿內，備用；(4)β-半乳糖苷酶基因啟動子類型的鑑定挑取上述(3)純化的藍色菌落，接種在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上，菌落仍能顯示藍色，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為組成型；如在含有X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上為白色，在含有IPTG、X-gal和氨苄青黴素的LB培養基平板上則顯示藍色的菌落，則推斷β-半乳糖苷酶基因的啟動子為誘導型。
2.如權利要求1所述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法，其特徵是步驟(1)構建的載體pUC18(lac-)或pUC19(lac-)其原載體上攜帶的、位於載體334-489位、長度為156bp的核苷酸序列被刪除，載體上的β-半乳糖苷酶的N-端序列被破壞，不能再與宿主菌E.coli JM09或E.coli DH5α形成α互補。
3.如權利要求1所述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法，其特徵是步驟(2)所述載體DNA與外源DNA片段的混合比例為1∶5。
4.如權利要求1所述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法，其特徵是步驟(2)所述重組DNA文庫在加入100μg/mL氨苄青黴素的LB培養基中擴增；貯存時加入終濃度為20％甘油，放於-20℃保存，備用。
5.如權利要求1所述快速克隆和鑑定細菌β-半乳糖苷酶基因的方法，其特徵是步驟(3)所述DNA文庫稀釋比例為1∶1-5。
全文摘要
本發明公開了一種從細菌中快速克隆和鑑定β－半乳糖苷酶基因的方法。本發明在商品化載體pUC18和pUC19基礎上，通過反向PCR技術刪除了載體上攜帶的、位於載體334－489位、長度為156bp的核苷酸序列，從而獲得本發明的載體pUC18(lac
文檔編號C12N1/21GK101086012SQ20071001499
公開日2007年12月12日 申請日期2007年6月28日 優先權日2007年6月28日
發明者孔健, 孔文濤, 季明傑 申請人:山東大學