雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三聯滅活疫苗的製備方法與流程

2023-06-12 09:41:41

本發明屬於獸用生物製品技術領域，具體涉及一種雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒三聯滅活疫苗的製備方法。

背景技術：

雞新城疫(ND)俗稱雞瘟，是由雞新城疫病毒引起的雞的一種高度接觸性、急性、烈性傳染病，具有很高的發病率和病死率，世界各地多有發生，且一旦爆發將給禽養殖業帶來毀滅性打擊。

H9N2亞型禽流感屬於低致病性禽流感，發病率高，但死亡率低。主要表現僅為輕度呼吸道症狀，採食量減少，產蛋率可從90％降至20％以下，甚至絕產，對商品肉雞可導致30％左右死亡，極易與大腸桿菌混合感染，嚴重影響家禽的生產性能，給養禽業帶來嚴重的經濟損失。更重要的是，H9N2亞型AIV可以穿越宿主障礙感染哺乳動物包括人，也有機會在人類大流行，給人類健康帶來了嚴重的威脅。

禽I群腺病毒是家禽常見的感染病原體，呈世界性分布，目前發現所有年齡的家禽均易感，只是鑑於家禽的品種、年齡所形成的致病力不同。目前發現禽I群腺病毒對雞具有強致病性，主要病變表現為包涵體肝炎及心包積液-肝炎症候群，該病可直接引發養雞場20～40天齡雞隻出現30％以上的死亡率，此外其臨床上也常常與傳染性支氣管炎病毒，呼腸孤病毒，H9亞型禽流感病毒等並發感染，導致種蛋雞出現明顯呼吸道病，關節炎，及嚴重的產蛋下降及畸形蛋等問題。因此目前該病已經成為嚴重影響養雞場生產性能的重大疫病之一。其中，禽I群腺病毒中的禽腺病毒4型(FAV-4)目前是世界上的研究熱點，其具備高致病性，可直接引發的心包積液-肝炎症候群(或安卡拉病)，該病於1987年首發於巴基斯坦，在不到一年的時間內殃及整個巴基斯坦肉雞養殖企業，之後在科威特、伊朗、前蘇聯，日本，中南美洲及墨西哥等地具有發生，甚至該病在鴿子也曾大面積爆發。

目前針對雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三聯疫苗不斷推出，可避免需要多次應用相應的單項滅活疫苗引起的手續繁瑣、使用不便、防疫成本較高等問題。如公開號為CN 105664150 A的中國專利申請「一種雞新城疫病毒、禽流感病毒和禽腺病毒三聯滅活疫苗」中所述三聯疫苗的製備方法為分別將雞新城疫、禽流感病毒接種雞胚收穫抗原，將禽腺病毒接種雞肝細胞收穫抗原，然後將各自抗原混合，再進行抗原的濃縮滅活、成品乳化。但所述的禽腺病毒以原代雞肝細胞進行培養，製備繁瑣、易汙染、難以到達高效轉染，不利於實驗操作。因此，有必要提供一種優化病毒培養工藝，降低生產成本，提高抗原效價，提高成品疫苗免疫效果的雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三聯疫苗的製備方法。

技術實現要素：

為解決現有技術中存在的技術問題，本發明的目的在於提供一種優化病毒培養工藝，降低生產成本，提高抗原效價，提高成品疫苗免疫效果的雞新城疫、禽流感病毒和禽腺病毒的三聯疫苗的製備方法。

本發明提供的技術方案為如下：

本發明提供一種雞新城疫病毒、禽流感H9亞型病毒和禽腺病毒4型病毒三聯滅活疫苗的製備方法，其包括以下步驟：

(1)將禽腺病毒4型病毒接種於LMH細胞，於37℃、5％CO2培養，直至細胞出現明顯病變時終止培養，將病變細胞凍融，離心後收集上清液得到病毒原液，然後進行超濾濃縮即為禽腺病毒4型制苗病毒液；

(2)將雞新城疫病毒La Sota株和禽流感H9亞型分別接種於雞胚尿囊腔，分別收穫雞新城疫和禽流感H9亞型的雞胚病毒尿囊液，於4℃、5000rpm離心10min，取離心後上清液，然後分別進行超濾濃縮即為雞新城疫制苗病毒液和禽流感H9亞型制苗病毒液；

(3)將上述三種病毒的制苗病毒液進行滅活後，等體積混合，乳化製成乳劑型滅活疫苗。

進一步地，上述步驟(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的製備具體為：

①細胞的製備：將LMH細胞用胰酶-EDTA消化液進行消化分散傳代，加入DMEM培養液，在37℃、5％CO2培養至細胞單層後，再用無血清DMEM培養液清洗細胞3次，用於禽腺病毒4型病毒接種；

②禽腺病毒4型的接種和培養：將禽腺病毒4型毒種按終體積1:200接種到步驟①製備的細胞，並在37℃吸附30～60分鐘後吸棄病毒液，加入細胞維持液，於37℃、5％CO2培養58±2小時，直至細胞病變CPE達到80％以上時，收集細胞毒液；

③制苗病毒液的製備：將收集的細胞毒液於-20℃反覆凍融兩次後，於4℃、5000rpm離心10min，取離心後上清液用50K中空纖維柱將其進行濃縮後，即得禽腺病毒4型制苗病毒液；

其中，所述步驟①中胰酶-EDTA消化液為含有0.025％(m/v)的胰酶，0.02％(m/v)EDTA的Hank’s溶液。

所述的DMEM培養液中含5～10％(v/v)新生牛血清、1.0～1.2％(v/v)雙抗和0.5～2.5％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸，所述的雙抗為含100IU/mL的青黴素和10mg/mL的鏈黴素溶液。

所述步驟②中的細胞維持液為包含有0.5～1.5％(v/v)新生牛血清、0.2～0.5％(m/v)穀氨醯胺、1.0～1.2％(v/v)雙抗、1～3％(v/v)脂質體複合物和1～2％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養液，所述的雙抗為含100IU/mL的青黴素和10mg/mL的鏈黴素溶液。

進一步地，所述步驟②中的細胞維持液還包含有0.05～0.2％(m/v)硫辛酸。

進一步地，所述的脂質體複合物為內部包含過氧化氫酶的複合物，所述的脂質體複合物的製備包括以下步驟：

(1)稱取0.2g磷脂醯膽鹼、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂醯磷脂醯乙醇胺，混合，溶於50mL乙醇，超聲處理5min；

(2)然後在28℃，0.1MPa的條件下旋轉蒸發，除去乙醇，靜置30min，加入100mL pH為7.4的磷酸鹽緩衝溶液，在35℃水浴中振蕩水化反應約1h，得脂質體懸浮液；

(3)使用注射器式濾器調整脂質體懸浮液的粒徑至150～200nm，得到內部包含有過氧化氫酶的脂質體。

其中，上述pH為7.4的磷酸鹽緩衝溶液中含0.2～0.6％(m/v)過氧化氫酶。

進一步地，上述三種病毒的制苗病毒液在進行滅活前需進行病毒含量測定，其中，禽腺病毒4型病毒含量測定為：取濃縮後的病毒液用DMEM細胞培養液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5個稀釋度接種48孔鋪滿單層LMH細胞培養板，每個稀釋度重複5孔，同時設立陰性對照細胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min後，補加細胞維持液0.3mL於37℃、5％CO2培養120小時，觀察細胞病變，計算TCID50。

雞新城疫病毒和禽流感H9亞型病毒含量測定為：取濃縮後的病毒液用PBS按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經尿囊腔接種SPF雞胚，0.1mL/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，於37℃培養箱中培養觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結束後利用Reed-Muench方法計算離心收穫的上清液的EID50。

進一步地，將三種病毒的制苗病毒液按等體積混合後，使0.1ml水相中雞新城疫病毒含量不低於108.3EID50，禽流感H9亞型病毒含量不低於107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。

進一步地，上述三種病毒的制苗病毒液的滅活採用0.1％福馬林滅活，滅活時間為12～24小時。

其中，禽腺病毒4型病毒滅活檢驗為：取滅活檢驗的樣品，用DMEM營養液以10-1、10-2、10-3三個比例稀釋待檢樣品，同時設立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用於陽性對照，分別接種於48孔LMH細胞單層細胞，每組重複接種5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培養96小時。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現細胞病變，陽性對照組各稀釋度孔中細胞病變均明顯，達80％以上，判定為滅活檢驗合格。

雞新城疫、禽流感H9亞型滅活檢驗為：將滅活的病毒液接種10～11日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，接種後密封針孔，置於36～37℃繼續孵育，不必翻胚。每天照胚兩次，棄去24小時之內的死亡雞胚，孵育至4天，收穫尿囊液測定其血凝價(HA)，HA＜1:4即為滅活合格。

進一步地，所述的乳化製成乳劑型滅活疫苗包括以下步驟：

(1)油相製備：取優質注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-80 4份，先將白油緩慢加溫，然後加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪拌邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌，製成油相；

(2)水相製備：取滅活後的雞新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亞型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份，混合，加入滅菌後的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，製成水相；

(3)乳化：將水相加入到油相中，利用IKA乳化機進行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即得乳劑型滅活疫苗；

(4)分裝：將製備的乳劑型滅活疫苗按照每瓶250mL進行分裝。

與現有技術相比，本發明的優勢在於：

(1)採用本發明提供的三聯滅活疫苗免疫動物後抗體產生快，效價高，降低了疫病的發生及蔓延，對雞新城疫病毒、禽流感病毒H9亞型和禽腺病毒4型病毒具有完全的免疫保護作用。且安全性良好，未出現由疫苗引起的任何局部和全身不良反應，穩定有效，成品在2～8℃長時保存不會出現分層現象，保護期長。

(2)與傳統使用雞胚法或原代雞肝腎細胞培養禽腺病毒4型病毒比較，本發明採用LMH傳代細胞培養禽腺病毒4型增殖，利用Reed-Muench方法測定其TCID50可以穩定達到107.0-107.5/0.1mL，所得的禽腺病毒4型增殖的病毒滴度提高達10倍以上，並且得到的抗原高度澄清，容易進行濃縮處理，適合進行高抗原滴度的優質滅活疫苗生產。

(3)本發明通過優化細胞培養液的配方，創造性地添加過氧化氫酶脂質體複合物和硫辛酸，使接毒後的LMH細胞在低含量新生牛血清的DMEM培養液中仍能保持良好的生長狀態，避免細胞過早出現死亡，從而提高製毒疫苗的效價，並在較短的培養時間58±2小時，即可收穫滴度較高的病毒液，大大節約了生產成本，提高生產效率。

具體實施方式

以下通過具體實施方式進一步描述本發明，但本發明不僅僅限於以下實施例。

實施例1 脂質體複合物的製備：

(1)稱取0.2g磷脂醯膽鹼、0.08g膽固醇、0.04g二硬脂醯磷脂醯乙醇胺，混合，溶於50mL乙醇，超聲處理5min；

(2)然後在28℃，0.1MPa的條件下旋轉蒸發，除去乙醇，靜置30min，加入100mL pH為7.4含0.5％(m/v)過氧化氫酶的磷酸鹽緩衝溶液，在35℃水浴中振蕩水化反應約1h，得脂質體懸浮液；

(3)使用注射器式濾器調整脂質體懸浮液的粒徑至150nm，得到內部包含有過氧化氫酶的脂質體。

實施例2 禽腺病毒4型制苗病毒液的製備和病毒含量測定

(1)禽腺病毒4型制苗病毒液的製備：

①細胞的製備：將LMH細胞用質量體積比為0.025％的胰酶-0.02％EDTA消化分散，加入含10％(v/v)新生牛血清、1.0％(v/v)雙抗和2.0％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養液，在37℃、5％CO2培養至細胞單層後，再用無血清DMEM培養液清洗細胞3次，用於禽腺病毒4型病毒接種；

②禽腺病毒4型的接種和培養：將禽腺病毒4型毒種按終體積1:200接種到步驟①製備的細胞，並在37℃吸附40分鐘後吸棄病毒液，加入含有1.0％(v/v)新生牛血清、0.4％(m/v)穀氨醯胺、1.0％(v/v)雙抗、2.5％(v/v)脂質體複合物、0.15％(m/v)硫辛酸和2％(m/v)羥乙基哌嗪乙磺酸的DMEM培養液，於37℃、5％CO2培養60小時，直至細胞病變CPE達到80％以上時，收集細胞毒液；

③制苗病毒液的製備：將收集細胞毒液於-20℃反覆凍融兩次後，於4℃、5000rpm離心10min，取離心後上清液用50K中空纖維柱將其進行濃縮後，即得禽腺病毒4型制苗病毒液。

(2)禽腺病毒4型病毒含量測定：

取濃縮後的病毒液用DMEM細胞培養液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8 5個稀釋度接種48孔鋪滿單層LMH細胞培養板，每個稀釋度重複5孔，同時設立陰性對照細胞，每孔0.1mL，37℃吸附30min後，補加細胞維持液0.3mL於37℃、5％CO2培養120小時，觀察細胞病變，計算TCID50。

對比例1、2、3禽腺病毒4型制苗病毒液的製備和病毒含量測定

對比例1禽腺病毒4型制苗病毒液的製備步驟與實施例2基本相同，區別在於，所述的步驟②種毒繁殖中，LMH細胞接入毒種後，加入的細胞維持液含有過氧化氫酶，而不是過氧化氫酶脂質體複合物，即將過氧化氫酶直接加入到細胞維持液中。

對比例2禽腺病毒4型制苗病毒液的製備步驟與實施例2基本相同，區別在於，所述的步驟②種毒繁殖中，LMH細胞接入毒種後，加入的細胞維持液不含過氧化氫酶脂質體複合物。

對比例3禽腺病毒4型制苗病毒液的製備步驟與實施例2基本相同，區別在於，所述的步驟②種毒繁殖中，LMH細胞接入毒種後，加入的細胞維持液不含硫辛酸。

並觀察按對比例1-3所述的方法製備禽腺病毒4型制苗病毒液，不同時間收穫的病毒液TCID50，並與實施例2的方法製備禽腺病毒4型制苗病毒液比較，見下表1。

表1 不同時間收穫的病毒液TCID50

由對比例1可知，將過氧化氫酶直接加入到細胞維持液中，LMH細胞在較短時間內出現病變，培養36h後，CPE比例達到65％，48h後達到95％，收穫病毒液中病毒的含量遠低於實施例2製得病毒液中病毒的含量。由對比例2可知，細胞維持液中不含過氧化氫酶脂質體複合物，LMH細胞在最短時間內出現病變，培養36h後，CPE比例達到85％，收穫病毒液的病毒的含量最低。由對比例3可知，細胞維持液中不含硫辛酸，LMH細胞出現病變的時間與對比例1相當，培養36h後，CPE比例達到60％，48h後達到85％。以上結果表明在細胞培養液中加入過氧化氫酶脂質體複合物和硫辛酸可顯著改善LMH細胞接毒後的生長狀態，延緩其出現細胞病變，提高病毒疫苗的效價。

實施例3 雞新城疫制苗病毒液、禽流感H9亞型制苗病毒液的製備和病毒含量測定

(1)雞新城疫制苗病毒液的製備：

將雞新城疫毒種用滅菌PBS稀釋至10-4或10-5，接種10～11日齡雞胚，每胚尿囊腔內接種0.2ml，置36～37℃繼續孵育，不必翻胚，每日照胚1次，孵育至96小時，全部取出，照胚，棄去死胚，將活胚氣室向上直立，置2～8℃冷卻12～24小時，將冷卻的雞胚取出，收穫雞胚尿囊液，吸取雞胚尿囊液置於滅菌容器內，抽樣測定紅細胞凝集價，凝集價低於1:256者應棄去，將收穫的雞胚尿囊液置於4℃、5000rpm離心10min，取離心後上清液，然後進行超濾濃縮即為雞新城疫制苗病毒液，亦可將雞胚尿囊液置於在2～8℃保存備用，但保存應不超過72小時。

(2)雞新城疫病毒含量測定：

取濃縮後的病毒液用PBS按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經尿囊腔接種SPF雞胚，0.1mL/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，於37℃培養箱中培養觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結束後利用Reed-Muench方法計算離心收穫的上清液的EID50。

(3)禽流感H9亞型制苗病毒液的製備：

將禽流感H9亞型毒種用滅菌PBS稀釋至10-4或10-5，接種10～11日齡雞胚，每胚尿囊腔內接種0.2ml，置36～37℃繼續孵育，不必翻胚，每日照胚1次，孵育至72小時，全部取出，照胚，棄去死胚，將活胚氣室向上直立，置2～8℃冷卻12～24小時，將冷卻的雞胚取出，收穫雞胚尿囊液，吸取雞胚尿囊液置於滅菌容器內，抽樣測定紅細胞凝集價，凝集價低於1:256者應棄去，將收穫的雞胚尿囊液置於4℃、5000rpm離心10min，取離心後上清液，然後進行超濾濃縮即為禽流感H9亞型制苗病毒液，亦可將雞胚尿囊液置於在2～8℃保存備用，但保存應不超過72小時。

(4)禽流感H9亞型病毒含量測定：

取濃縮後的病毒液用PBS按照10倍系列稀釋，取10-6、10-7、10-8、10-9、10-10共5個稀釋度經尿囊腔接種SPF雞胚，0.1mL/胚，每個稀釋度接種5枚雞胚，於37℃培養箱中培養觀察7天，每天記錄雞胚死亡情況，如果有死亡雞胚放入4℃冰箱保存，觀察時間結束後利用Reed-Muench方法計算離心收穫的上清液的EID50。

實施例4 雞新城疫病毒、禽流感H9亞型病毒和禽腺病毒4型病毒的滅活及滅活檢驗

(1)禽腺病毒4型的滅活：將病毒液導入滅活罐內，加入福馬林溶液，充分混合，福馬林溶液的最終濃度為0.1％，37℃滅活16小時(以罐內溫度達到37℃開始計時)後取出，置2～8℃保存，應不超過1個月。

禽腺病毒4型病毒滅活檢驗：取滅活檢驗的樣品，用DMEM營養液以10-1、10-2、10-3三個比例稀釋待檢樣品，同時設立同樣稀釋比例的滅活前病毒樣品用於陽性對照，分別接種於48孔LMH細胞單層細胞，每組重複接種5孔，每孔0.4mL 37℃、5％CO2培養96小時。滅活樣品各組稀釋度孔中均沒有出現細胞病變，陽性對照組各稀釋度孔中細胞病變均明顯，達80％以上，判定為滅活檢驗合格。

(2)雞新城疫病毒和禽流感H9亞型病毒滅活參考上述禽腺病毒4型病毒滅活方法。

雞新城疫/禽流感H9亞型滅活檢驗為：將滅活的病毒液接種10～11日齡SPF雞胚，每胚0.1ml，接種後密封針孔，置於36～37℃繼續孵育，不必翻胚。每天照胚兩次，棄去24小時之內的死亡雞胚，孵育至4天，收穫尿囊液測定其血凝價(HA)，HA＜1:4即為滅活合格。

實施例5 雞新城疫病毒、禽流感H9亞型病毒和禽腺病毒4型病毒三聯滅活疫苗的製備

本發明可用於配製三聯滅活疫苗的條件為：每0.1mL新城疫病毒含量不低於108.5EID50方可用於制苗；每0.1mL禽流感H9亞型病毒含量不低於107.8EID50方可用於制苗可用於制苗；每0.1mL禽腺病毒4型病毒含量≥108.5TCID50即可用於制苗，所述三聯滅活疫苗的製備具體為：

(1)油相製備：取優質注射用白油94份，硬脂酸鋁2份，司盤-80 4份，先將白油緩慢加溫，然後加入司盤-80和硬脂酸鋁，邊攪拌邊加溫，直到硬脂酸鋁充分溶解至透明為止，高壓滅菌，製成油相；

(2)水相製備：取滅活後的雞新城疫制苗病毒液、禽流感病毒H9亞型制苗病毒液和禽腺病毒4型制苗病毒液各32份，混合，加入滅菌後的吐溫-80 4份，開始攪拌，使吐溫-80完全溶解為止，製成水相；

(3)乳化：將水相加入到油相中，利用IKA乳化機進行乳化，16000rpm，乳化5分鐘即得乳劑型滅活疫苗；

(4)分裝：將製備的乳劑型滅活疫苗按照每瓶250mL進行分裝。

製得的0.1ml水相三聯滅活疫苗中雞新城疫病毒含量不低於108.3EID50，禽流感H9亞型病毒含量不低於107.5EID50，禽腺病毒4型TCID50≥108.0/mL。

實施例6 三聯滅活疫苗成品檢驗

(1)性狀

①外觀：為乳白色乳劑。

②劑型：油包水型。取一清潔吸管，吸取少量疫苗滴入冷水中，除第一滴外，均不擴散。

③穩定性：吸取疫苗10毫升加入離心管中，以3000rpm離心15分鐘，管底析出的水相應≤0.5mL。

④粘度：用出口內徑為1.2mm的1.0mL吸管，吸取25℃左右1.0mL，令其垂直自然流出，記錄流出0.4mL所需的時間，應不超過8秒。

(2)無菌檢驗：取成品接種硫乙醇酸鹽培養基小管和酪腖瓊脂各兩支，每支0.2mL，一支置37℃培養，一支置25℃培養，觀察3～5日，應純粹，無菌生長。

(3)安全檢驗：用7日齡SPF雞10隻，每隻肌肉或頸部皮下注射疫苗1mL，觀察14日，結果試驗雞均健活，無任何局部和全身不良反應。

(4)甲醛含量測定：

①對照品溶液的製備：取已標定的甲醛溶液適量，配成每1.0mL含甲醛1.0mg的溶液，精密量取5.0mL置50mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

②被測樣本的製備：用5.0mL刻度吸管量取被檢品5.0mL，置50mL量瓶中，用20％吐溫-80乙醇溶液10mL，分次洗滌吸管，洗液併入50mL量瓶中，搖勻，加水稀釋至刻度，強烈振搖，靜止分層，下層液如果不澄清，濾過，棄去初濾液，取澄清續濾液，即得。

③測定法：精密吸取對照品溶液和被檢品溶液各0.5mL，分別加醋酸-醋酸銨緩衝液10mL，乙醯丙酮試液10mL，置60℃恆溫水浴15分鐘，冷水冷卻5分鐘，放置20分鐘後，按紫外-可見分光光度計法，在410nm的波長處測定吸收度，計算即得。甲醛含量符合國家標準，即檢驗合格。

(5)裝量檢查：取供試品3個，使之恢復至室溫，開啟時注意避免損失。參照裝量檢查使用量取參考表，用經標化的吸管、注射器或量筒進行裝量檢查。

實施例7 三聯滅活疫苗效力試驗：

取21日齡SPF雞70隻，將四批雞新城疫、禽流感H9亞型和禽腺病毒4型三聯滅活疫苗分別以0.3mL/只胸肌注射，每批滅活疫苗15隻SPF雞，剩餘10隻作為對照組只注射生理鹽水。免疫後7、14、21、28、35、42、49天，連同對照組分別採血，測定其雞新城疫和禽流感病毒H9亞型HI抗體效價和21天、35天和49天禽腺病毒4型血清中和抗體效價，結果見下表2-4。

表2 免疫後不同時間雞新城疫抗體水平

表3 免疫後不同時間禽流感病毒H9亞型抗體水平

表4 免疫後不同時間禽腺病毒4型抗體水平

結果表明，採用本發明的LMH細胞載體能培養出高病毒滴度的禽腺病毒4型；從SPF雞的免疫效力試驗可知，採用本發明生產的雞新城疫、禽流感H9亞型和禽腺病毒4型三聯滅活疫苗免疫SPF雞不僅能產生高水平的抗雞新城疫和禽流感病毒H9亞型的HI抗體而且還能產生高水平的禽腺病毒4型中和抗體，本發明提供的三聯滅活疫苗效力較佳。

以上僅是本發明的優選實施方式，應當指出的是，上述優選實施方式不應視為對本發明的限制，本發明的保護範圍應當以權利要求所限定的範圍為準。對於本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明的精神和範圍內，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護範圍。