一種高純度的人第Ⅸ凝血因子的製備方法

2023-06-01 08:37:26 2

專利名稱：：一種高純度的人第Ⅸ凝血因子的製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種高純度的人第IX凝血因子的製備方法，特別涉及一種通過對包含第IX凝血因子的物質(取自人血漿或者重組的細胞培養基)進行離子交換層析和親合層析來使病毒鈍化或去除病毒的階段，可製得幾乎無摻雜蛋白質、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高純度第K凝血因子。
背景技術：
：人第K凝血因子為凝血過程中不可缺少的的糖蛋白，在由於遺傳因素或病理因素而血液中無第IX凝血因子或第IX凝血因子不足的情況下，會使血液中的凝血過程不完整，從而引發B型血友病。B型血友病主要通過遺傳發生，在30,00050,000名男嬰中1名男嬰具有B型血友病，屬於罕見的遺傳性疾病。為治療這些B型血友病患者而採用了將純化及濃縮後的人體血液中第K因子提供給患者體的方法。在肝臟合成第K因子時所需的維他命K，具有多種與其他維他命K-依賴性糖蛋白共同的特徵。參與凝血過程的維他命K-依賴性糖蛋白有第II因子、第VD因子、第X因子等。第IX因子為含有約17.5%的糖(4.7%己糖、6.8%N-乙醯基氨基己糖、6%唾液酸)的單體結構(monomer)的糖蛋白，屬於絲氨酸蛋白酶(serineprotease)的一種。分子量由第K因子中的碳水化合物量所決定，其大小約為55,00075,000Da。根據胺基酸序列所計算的單獨的蛋白質分子量約為47,054Da。在分子結構內的N末端附近存在具有12個Y羧基穀氨酸(carboxyglutamicacid)的區域，在活化時需要磷脂(phospholipid)和鈣離子。由於以每1分子第K因子含有10分子左右含有屬於酸性低聚糖(acidicoligosaccharide)的唾液酸(sialicacid)，因此具有很低的等電點(isoelectricpoint,pl)。根據第IX因子中存在的碳氫化合物的種類和量而表現出pi為4.04.6的多樣性(JournalofchromatographyA,844，1999，119-128)。通過活化的第XIa因子(FactorXIa)水解第K因子的胺基酸Arg(145)Ala(146)之間和Arg(180)Val(181)之間，由35個胺基酸構成的活性縮氨酸(activationpeptide)脫離而活化，為與天然的第IX因子區別而將脫離活性縮氨酸的第K因子稱為第IX因子的活性型(activeform)。並且也可通過包括活化的第VEa因子(FactorVEa)、組織因子(FactorIII)及鈣離子(Ca2+)的磷脂複合物所活化(如圖l所示)。存於人血漿內的第K因子的濃度為O.l(imol(5滯/W)，從而具有較低的濃度。由此，為治療B型血友病患者的治療需要提供大量的全血或血漿，同時會過量提供存於血漿內的纖維蛋白原(fibrinogen)等的其他蛋白質。為減少這些副作用，1950年代末首次開發出濃縮的第IX因子。該方法是通過將血漿中的第K因子吸附於硫酸鋇(bariumsulfate)而沉澱後通過洗漆去除其他蛋白質，此後分離出吸附於硫酸鋇的第IX因子。到後來，以無毒性鹽類的三鈣磷酸鹽(tricalciumphosphate)代替了硫酸鋇。這種通過吸附和沉澱的第K因子的濃縮工序中再濃縮第IX因子的同時，會同時濃縮其他維他命K-依賴性糖蛋白中的第n因子、第VD因子、第X因子。這種濃縮物稱為第僅因子複合物(FactorKcomplex)。從1960年代開始，通過上述方式濃縮的第K因子複合物普遍用於B型血友病的治療。一般通過現有的述低溫乙醇分餾工序中分離出血漿中的白蛋白或球蛋白，但是通過該低溫乙醇分離工序不能分離第K因子複合物，從而不適用於第K因子的製備。為解決上述缺點，開發出利用陰離子交換層析的柱層析工序。即，通過冷沉(Cryoprecipitation)去除具有豐富的第VID因子的冷凝蛋白質(cryoprecipitate)後，將去除冷凝蛋白質的、血漿中的第K因子吸附於陰離子交換樹脂純化濃縮的方法。但是在該方法中也同樣導致第II因子、第VE因子、第X因子的濃縮。這種利用陰離子交換樹脂所生產的第IX因子複合物到現在也常用於B型血友病的治療。但是根據報告，在提供第IX因子複合物後存在靜脈血栓症(venousthrombosis)禾口彌散性血管內凝血(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)等症狀(Thrombosis&Haemostasis,vol73，no.4,584-591，vol79,no.4,778-783)。據推測，這種副作用是由於與第K因子同時提供的過多的其他凝固蛋白質或者濃縮物中多餘的凝血酶原成分(thrombogeniccomponents)所造成的(hypercoagulablestate)所產生的。在過多或長時間提供第IX因子複合物的情況下會使正常的第n因子量增加，使其在血漿中消失的時間變長。為降低第k因子複合物的副作用，從1990年開始生產高純度第k因子，該高純度第k因子去除了第n因子、第vn因子、第x因子。高純度第僅因子，是通過進行陰離子交換層析，對濃縮的第k因子複合物進行肝素凝膠法(Heparingel)或單體隆抗體凝膠柱層析(monoclonalantibodygelcolumnchromatography)而去除了第II因子、第vn因子、第x因子，從而代替了以往來的第僅因子複合物。並且，1997年GeneticInstitute開發出利用CHOcell的遺傳重組第IX因子，並以Benefix"名稱銷售。來源於血液的凝血因子的最大缺點是存在病毒感染的危險，該病毒是指有可能在血液中的HIV、HBV、HCV等。為確保來源於血液的凝血因子的病毒安全性，在純化及濃縮中必須包括去除病毒的工序。一般通過S/D處理使病毒鈍化，為進一步有效去除病毒公開有在鈍化的同時進行親和層析的工序。並且，也有利用納米過濾(nanofilter,20nm)的更為有效的納米過濾方法，但是在利用該納米過濾時，需在事前對凝血因子進行高純度濃縮的工序，以防止發生在利用未進行高純度製備的凝血因子進行納米過濾時過濾器堵塞而不能使用。雖然可通過單體隆抗體(monoclonalantibody)選擇性分離第IX因子，但是由於生產抗體需使用動物細胞，但是不能排除來源於動物細胞的病毒感染。並且，也不能排除在進行層析工序中隨同抗體洗提的免疫球蛋白(IgG)所引起的副作用。並且，也不能完全克服在從重組細胞培養基中分離第IX因子時的病毒問題。從而需要開發出一種可完全去除病毒，且純度大於99%的安全的人第僅凝血因子的製備方法。
發明內容為解決上述問題的不足，本發明以提供一種可消除由血友病B患者的治療中所提供的多餘凝血蛋白質或濃縮物中多餘血栓形成成分而引起的高凝狀態(hypercoagulablestate)所致的靜脈血栓症(venousthrombosis)或瀰漫性血管內凝血(disseminatedintravascularcoagulation,DIC)等的副作用的高純度的人第IX凝血因子的製備方法為目的。以下對本發明的高純度的人第K凝血因子的製備方法進行說明。圖2是本發明的人第K凝血因子製備方法的流程圖。用於本發明的人血漿、凝血因子等溶液的樣品並不限於特定形狀的物質。本發明的人第K凝血因子的製備方法的原料優選為去除冷凝蛋白質(cryo)的人血漿，也包括包含第IX因子的血漿部分、重組的第K因子的細胞培養基或包含第IX因子的物質等。在本發明的一實施例中，在進行陰離子交換層析(anionexchangechromatography)來洗提包含第K因子的溶液後進行S/D(Solvent/Detergenttreatment)處理來鈍化病毒後進行陰離子交換層析來再洗提後進行濃縮及過濾來製備人第K凝血因子的方法中，進一步包括，對通過陰離子交換層析洗提的溶液，進行肝素親合層析進行洗提，而後通過進行陽離子交換層析收集非吸附液，進行納米過濾(nanofiltration)去除病毒的工序。具體為，在本發明中為去除以上述陰離子交換層析製備的血漿蛋白溶液中殘留的其他摻雜蛋白質，進行以對凝血因子具有親合性的肝素(heparin)為配合基的肝素親合層析，來收集未吸附於陽離子交換柱的非吸附液來去除其他雜質。上述肝素親和性層析中的由於配合基用了肝素(heparin),其載體(樹脂)可利用瓊脂糖凝膠、瓊脂糖、聚丙烯醯胺等多種樹脂，但並不限於此。最優先使用廣泛使用的肝素瓊脂糖凝膠6FF柱(heparinsepharose6FF)。在本發明的肝素親和性層析中，在適用包含第IX因子的溶液前所使用的平衡緩衝液的離子強度(ionicstrength)和包含第K因子的溶液的離子強度為20mS/cm以下，pH為5.09.0，洗滌吸附於樹脂的其他蛋白質時的洗滌緩衝液的離子強度為1020mS/cm，而後洗提包含第IX因子的溶液時的洗提緩衝液的離子強度為2050mS/cm。並且，其中所述陽離子交換層析(cationexchangechromatography)的柱官能團(functionalgroup)選自弱陽離子(weakcation)中的的羧甲基(carboxymethyl-,CM-)、羧基(carboxy-,C-)、強陽離子(strongcation)中的磺基(sulfo-,S-)、磺酸甲基(sulfomethyl,SM-)、磺乙基(sulfoethyl-，SE-)、磺丙基(sulfopropyl-,SP-)、二氧磷基(phospho-,P-)等，且並不限於此。柱樹脂(resine)選自瓊脂糖凝膠(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)、瓊脂糖(agarose)、葡聚糖纖維素(Sephacel)、聚苯乙烯(Polystyrene)、聚乙烯(Polyacrylate)、纖維素(Cdlulose)、Toyoperl等，且並不限於此。本發明中的上述陽離子交換層析優選在pH3.06.0條件下進行，且通過收集未吸附於柱而漏出的非吸附液來製備。陽離子交換層析中的平衡緩衝液可根據條件以多種方式使用，在適用包含第K因子的溶液之前所使用的平衡緩衝液的離子濃度(ionicstrength)和使用包含第K因子的溶液的離子濃度優選為1050mS/cm。本發明涉及一種高純度的人第K凝血因子的製備方法，特別涉及一種通過對包含第IX凝血因子的物質(取自人血漿或者重組的細胞培養基)進行離子交換層析和肝素親合層析來使病毒鈍化或去除病毒的階段，可製得幾乎無摻雜蛋白質、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高純度第IX凝血因子製劑。圖1是表示內源性凝血途徑和外源性凝血途徑的示意圖。圖2是本發明的高純度的人第K凝血因子製備方法的示意圖。圖3是表示在非還原(A)狀態及、還原(B)狀態下、對通過本發明所製備的高純度第XI凝血因子製劑和市場銷售的第XI凝血因子製劑進行的SDS-PAGE結果的示意圖。M:標準標號(阻凝蛋白；198，牛乳糖；115，BSA;93，卵清蛋白；49.8，碳酸酐酶；35.8，大豆胰蛋白酶抑制劑；29.2，溶解酵素；21.3，抑肽酶；6.4);Lanel:根據表2的方法的高純度第XI凝血因子；Lane2:根據表3的方法的高純度第XI凝血因子；Lane3:根據表4的方法的高純度第XI凝血因子；Lane4:Facnyne(株式會社綠十字)；Lane5:Mononine(ZLBBehring公司)；Lane6:Octanyne(Octapharma公司)；Lane7:BerininHS600(ZLBBehring公司)；Lane8:ImmunineSTIMplus600(Baxter公司)圖4是表示根據竣甲基-瓊脂糖凝膠FF的按pH的活性(activity)安全性結果示意圖。具體實施方式實施例l:利用陰離子交換層析的純化(傳統工序)以去除冷凝蛋白質的血漿或重組第IX因子的細胞培養基為原料，將該原料與二乙氨基一乙基-葡萄糖凝膠A-50(DEAE-SephadexA-50)混合，用緩衝液預洗(prewash)後，在4"C溫度條件下攪拌2個小時。然後對吸附有第僅因子的膠進行過濾及圓心分離的方式進行分離。在預洗(washing)後，第K因子通過高鹽濃度的緩衝液洗提。將上述洗滌液的pH值適當調節到7.5左右，而後進行透析、濃縮而在-70°C條件下保存。並且，另行對濃縮液進行取樣(aliquot),通過KFDA(KoreaFoodandDrugAdministration)規定的血液製劑及重組製劑的標準及實驗方法測定了濃度。對包含第K因子的部分進行S/D處理來完成病毒純化工序。將完成純化工序後的溶液吸附於2次純化用DEAE-toyopearl650M柱後，按照工序收集洗提液。實施例2:利用肝素瓊脂糖凝膠(Heparinsepharose)6FF柱層析的純化將通過上述實施例1所純化製備的第IX凝血因子複合物溶液10ml調節到離子強度20mS/cm以下、pH7.0後，在肝素瓊脂糖凝膠6FF柱(柱條件:直徑lcm、高度18cm、流速(flowrate)1.0ml/min、常溫)流入平衡緩衝液(20mM檸檬酸鈉、pH7.0)來維持平衡，並且使樣品裝樣(loadingsample)流過而吸附，通過以與平衡緩衝液相同的溶液進行一次洗滌，一0.1M的氯化鈉進行二次洗滌後，以0.25M的氯化鈉洗提。對上述洗提液進行蛋白質濃度測定後進行了SDS-PAGE(BSAstandard(2mg/ml，PIERCE))，利用Amdung公司的CoagulationtimerKC10測定了濃度。對實施例1的2次陰離子柱洗滌液和實施例2的肝素瓊脂糖凝膠6FF柱洗提液的比活性進行比較，發現肝素瓊脂糖凝膠6FF柱工序中的比活性為80-90IU/mg,為實施例1的洗提液濃度的14倍以上。實施例3:利用陽離子交換層析(CM-s印haroseFF)的純化將通過上述實施例2所純化的第K凝血因子複合物10ml調節到離子強度20mS/cm以下、pH4.0後，適用於以平衡緩衝液(0.30-0.4M氯化鈉中檸檬酸鹽佔20mM、pH4.0)維持平衡的CM-sepharoseFF柱(柱條件直徑lcm、高度5cm、流速(flowrate)1.0ml/min)後收集了非吸附液。對上述非吸附液進行蛋白質濃度測定後進行了SDS-PAGE，發現比活性最低為150IU/mg以上。圖3是表示為確認通過本發明所製備的第XI凝血因子製劑和市場銷售的其他產品的純度的SDS-PAGE結果的示意圖。如圖3所示，根據本發明所純化製備的第K凝血因子製劑具有與其他產品相比更少的摻雜蛋白質，從而可知本發明的第IX凝血因子具有更好的純度。實施例46:第K凝血因子的大量純化為確認大量生產本發明的高純度第K凝血因子製劑的可行性，進行了多次擴大實驗，並將各階段的比活性、純化倍、產量等列於下表16中。表ltableseeoriginaldocumentpage13tableseeoriginaldocumentpage14tableseeoriginaldocumentpage15表6tableseeoriginaldocumentpage15如表16所示，重複進行了多次本發明，發現可製備包含第K凝血因子的最終濃縮液的比活性(specificactivity)最小約為150(IU/mg)以上的高純度的第K凝血因子製劑。將該最終濃縮液按需放入小瓶後凍結乾燥，從而用作長期安全性的實驗試樣和全臨床試樣。實施例7:細胞培養基中的第K凝血因子的純化將己克隆第K因子的CHO細胞，在無血清培養基中培養後，將去除CHO細胞的5L培養液，按照上述實施例13所述的方法中除S/D(solvent/detergent)處理的方法來純化製備第IX因子，該第IX因子的比活性、純化倍、產量如表7所示。表7tableseeoriginaldocumentpage16實施例8:病毒的純化(inactivation)及去除(removal)工序在病毒純化工序及納米過濾工序中進行了多方面的病毒去除實驗(HIV;HumanImmunodeficiencyVirus,BHV;BovineHerpesVirus,BVDV;BovineViralDiarrheaVirus,HAV;HepatitisAVirus,EMCV;EncephaloMycarditisVirus,PPV;PorcineParvovirus),其試驗結果如下表8、9所示。表8中的病毒去除值是指，在進行stock病毒的titer中去除titer的數據的LOG值，表9的病毒減小值是指將病毒stock刺突(spike)到目標病毒後，從進行刺突的數據中減去工序完成後的titer值的LOG值。表8來源於血漿的第K因子的病毒去除工序tableseeoriginaldocumentpage17本發明涉及一種高純度的人第僅凝血因子的製備方法，其中對包含第K凝血因子的物質(取自人血漿或者重組的細胞培養基)進行離子交換層析和肝素親合層析來使病毒鈍化或去除病毒的階段，可製得幾乎無雜質、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高純度的第K凝血因子。以上，對本發明的實施方式進行了詳細說明，但本發明的權利要求範圍不只限於上述範圍，利用本發明的權利要求範圍中所定義的基本概念的各種變形及改良形態也屬於本發明的權利要求範圍。權利要求1、一種人第IX凝血因子的製備方法，以包含第IX凝血因子的物質為原料來製備人第IX凝血因子，且包括如下步驟通過進行1次以上陰離子交換層析收集人第IX凝血因子的階段；通過進行肝素親合層析進行洗提的階段；通過進行陽離子交換層析收集非吸附液的階段；通過進行納米過濾去除病毒的階段。2、根據權利要求1所述的人第K凝血因子的製備方法，其中在所述通過進行肝素親合層析進行洗提的階段，在適用包含第K因子的溶液之前所使用的平衡緩衝液的離子強度(ionicstrength)和包含第K因子的溶液的離子強度為20mS/cm以下、pH為5.09.0，在洗漆吸附於緩衝液的其他蛋白質時的洗滌緩衝液的離子強度為1020mS/cm，在洗提包含第K因子的溶液時的洗提緩衝液的離子強度為2050mS/cm。3、根據權利要求1所述的人第K凝血因子的製備方法，其中所述陽離子交換層析的柱官能團選自羧甲基(carboxymethyl-，CM-)、羧基(carboxy-,C-)、磺基(sulfo-,S-)、磺酸甲基(sulfomethyl,SM-)、磺乙基(sulfoethyl-，SE-)、磺丙基(sulfopropyl-,SP-)、二氧磷基(phospho畫，P-)，柱樹脂(resine)選自瓊脂糖凝膠(Sepharose)、葡聚糖(Sephadex)、瓊脂糖(agarose)、葡聚糖纖維素(Sephacel)、聚苯乙烯(Polystyrene)、聚乙烯(Polyacrylate)、纖維素(Cellulose)、Toyopearl。4、根據權利要求1所述的人第K凝血因子的製備方法，其中所述通過進行陽離子交換層析收集非吸附液的階段，是在pH3.06.0的條件下進行的。5、根據權利要求1所述的人第僅凝血因子的製備方法，其中在所述通過進行陽離子交換層析收集非吸附液的階段，包含平衡緩衝液和第K因子的溶液的離子強度為1050mS/cm。6、根據權利要求1所述的人第K凝血因子的製備方法，包含第K凝血因子的物質為人血漿或重組的第IX凝血因子的細胞培養基。全文摘要本發明公開一種高純度的人第IX凝血因子的製備方法，通過對包含第IX凝血因子的物質(取自人血漿或者重組的細胞培養基)進行陰離子交換層析(anionexchangechromatography)、肝素親合層析(cationexchangechromatography)、陽離子交換層析(heparinaffinitychromatography)而製備人第IX凝血因子，並且包括進行S/D處理(Solvent/Detergenttreatment)使病毒鈍化或者通過納米過濾(nanofiltration)去除病毒的階段，通過本發明的製備方法可製得幾乎無摻雜蛋白質、比活性(specificactivity)在150IU/mg以上的安全的高純度的第IX凝血因子製劑。文檔編號C07K1/14GK101291951SQ200680039024公開日2008年10月22日申請日期2006年10月18日優先權日2005年10月18日發明者鏞姜,孫基桓,崔龍雲,成學模,李成來,許在旭,金基鎔申請人:株式會社綠十字