一種上皮組織癌前病變轉基因動物模型的製作方法
2023-06-01 19:24:31 3
專利名稱：一種上皮組織癌前病變轉基因動物模型的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物模型，具體涉及上皮組織癌前病變轉基因動物模型。
背景技術：
鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南方最常見的頭頸惡性腫瘤。目前，NPC的5年生存率仍維持在50％～60％左右。雖然治療越早，5年生存率越高，在臨床實踐中，卻有70％左右的NPC病例在得到確診並接受治療時，已屆臨床III、IV期，而針對這樣的晚期患者缺乏有效根治手段，大大影響了療效。因此，在NPC綜合性防治策略中，依然特別強調預防及早診早治，並將早期診斷和治療作為NPC二級預防的主要內容。但是，二級預防並不能對本病的發病率產生實質性的影響，而一級預防尚缺乏有效手段。
由於NPC的發生和發展與鼻咽癌前病變地關係密切，鼻咽癌前病變的防治便成為可能降低NPC發病率的重要環節，起到一級預防的作用。然而，在人體進行鼻咽癌前病變的系統實驗研究存在很大的難度，包括許多技術性和倫理學問題。當前，由於缺乏理想的實驗研究用動物模型，因而影響了上皮組織癌前病變的系統實驗研究的進行。
目前，獲得鼻咽癌或鼻咽癌前病變動物模型的方法主要是化學誘導法，即利用二亞硝基哌嗪(DNP)和佛波二酯(TPA)皮下注射的方法直接誘導癌變。但是，該方法主要應用於大鼠，並且其法造模時間長(一般需要10個月到一年以上)，實驗造模過程中常出現動物的意外死亡，效果不穩定(由於存在個體差異，對DNP的敏感性不一致，因此往往成模時間不一)，成功率較低，難以廣泛用於防治該病的藥物篩選和發病機制的系統研究。或者將人胚鼻咽黏膜移植於裸鼠皮下後，再用二亞硝基哌嗪皮下給藥法誘發其癌變，這是一種間接研究鼻咽上皮細胞癌變的方法，與鼻咽癌變的自然發生存在較大的差異，也不能大範圍地應用於鼻咽癌變機制以及防治藥物篩選、療效評價及預後評估等方面的系統研究(湖南醫學院腫瘤研究室。亞硝胺類化合誘發大鼠鼻咽癌的實驗研究。科學通報，1978，28(10)756-759；唐發清，蔣海鷹，陳朝暉，等。鼻咽上皮癌變過程中端粒酶活性和端粒酶RNA的表達。中華病理學雜誌，2001，30(2)125-128)。
轉基因動物製備技術被認為是遺傳學中繼基因連鎖分析、體細胞遺傳和DNA重組之後的第四代現代生物技術，是當今生命科學中一個發展最快、最熱門的技術領域。轉基因動物已逐漸廣泛地應用於醫學研究，並已成為醫學研究的重要手段，對於疾病的預防和治療研究發揮著重要作用。
姚開泰等曾構建了EDL-2、PLUNC-p雙啟動子調控鼻咽癌來源的潛伏膜蛋白1(LMP1)的表達載體，採用受精卵前核顯微注射法構建轉基因小鼠。結果表明，在所獲得的58隻轉基因首建鼠中，4隻整合陽性，其中的一隻轉基因小鼠在鼻咽、前胃、舌根等部位檢測到了外源基因的表達，未觀察到鼻咽組織明顯的病理改變(張玲，藍軻，姚開泰，等.用鼻咽相對特異性調控區建立N-LMP1轉基因小鼠.生物化學與生物物理學報英文版，2003年，35(12)1072-1076)。姚開泰等還製備了轉EDL2控制的N-LMP1基因陽性小鼠6隻，其中1隻4月齡的轉基因小鼠出現了鼻咽黏膜上皮不典型增生(藍軻，喬貴林，姚開泰，等。鼻咽癌來源潛伏膜蛋白1的表達誘發轉基因小鼠鼻咽不典型增生[J]。動物醫學進展，2002，23(5)46-48，54)。雖得到了單個的轉基因小鼠，但要使動物模型真正廣泛應用於癌變機理的研究，獲得外源基因表達水平較高、癌前病變表現明顯且穩定遺傳的純系轉基因後代，則是製作轉基因動物癌變模型必須解決的問題。
發明內容
本發明的目的在於提供一種穩定遺傳、自然發生的上皮細胞癌變轉基因動物模型，以克服當前上皮細胞癌變動物模型通用製備方法中存在的上述缺點。
實現本發明目的的技術方案如下
一種上皮組織癌變轉基因動物模型的製作方法，包括構建pLMP1-p53mt重組表達質粒，重組表達質粒的體外表達，轉基因模型首建鼠的獲得，轉基因模型動物的繁殖與篩選，其特徵在於將獲得的轉基因首建鼠F0與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產，獲得仔鼠，然後設計一對引物，用PCR法篩選得到G1代轉基因陽性雜合子小鼠，再將同胞或同宗G1代陽性異性小鼠交配，獲得G2代，繼續以同樣方法繁殖篩選，以獲得純系轉基因後代；
引物上遊序列為5′-GCC ATA CCA CAT TTG TAG AG-3′
引物下遊序列為5′-TCC CAG TAA ATG GAG GGA G-3′。
下面結合附圖進一步詳述本發明
圖1為可表達突變型p53和LMP1的重組表達質粒的結構圖。
圖2為G1代部分小鼠中雙基因同時檢測的PCR篩選電泳結果。
1為DNA標記物；
2為陽性對照；
3，4，6，8，9，13，14，15，16，17為未攜帶外源基因的小鼠；
5，7，10，11，12，18為攜帶有外源基因的小鼠。
圖3為G3代部分小鼠中雙基因同時檢測的PCR篩選電泳結果。
1為DNA標記物；
2為陽性對照；
3，7，10，12，15為未攜帶外源基因的小鼠；
4，5，6，8，9，11，13，14，16，17為攜帶有外源基因的小鼠。
圖4為G6代部分小鼠中雙基因同時檢測的PCR篩選電泳結果。
1為DNA標記物；
2為陽性對照；
3，6，20為未攜帶外源基因的小鼠；
4，5，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19為攜帶有外源基因的小鼠。
圖5為突變型p53和LMP1基因在F0轉基因小鼠部分器官組織中表達活性的免疫組化法檢測。
A為對照鼠鼻咽組織(突變型p53)；B為轉基因鼠鼻咽組織(突變型p53)；
C為對照鼠鼻咽組織(LMP1)；D為轉基因鼠鼻咽組織(LMP1)；
E為PBS代替一抗檢測轉基因鼠鼻咽組織；F為對照鼠食管(突變型p53)；
G為轉基因鼠食管(突變型p53)；H為對照鼠食管(LMP1)；
I為轉基因鼠食管(LMP1)；J為轉基因鼠食管(PBS代替一抗)。
圖6為G3代轉基因鼠部分器官組織病理切片圖。
A、B為轉基因小鼠中度異型增生的鼻腔黏膜組織，C為正常鼻腔黏膜組織對照
D、E為轉基因小鼠異型增生的鼻咽黏膜組織；F、為正常鼻咽黏膜組織對照
本發明針對難以獲得符合自然發病過程的理想上皮細胞癌前病變動物模型的問題，通過基因工程技術培育出自然發生上皮細胞癌變的轉基因小鼠動物模型。具體方法如下
(1)構建pLMP1-p53mt重組表達質粒以質粒pSG5.LMP1作為模板，設計上、下遊引物，用序列高保真的DNA聚合酶進行聚合酶鏈式反應(簡稱PCR)擴增，獲得的啟動子區EDL-2，再經拼接、克隆而得到將LMP1自身啟動子及調控區域置於LMP1基因5』端上遊的融合基因，再將其插入pLXSN vector多克隆酶切位點之間，得到本發明的中間表達載體，再設計引物，以質粒pCMV-p53mt為模板，用序列高保真的DNA聚合酶進行PCR擴增，獲得的突變型p53融合基因(包括啟動子和調控區、基因編碼區和終止區及多聚腺苷酸合成信號區)，再經拼接、克隆入中間表達載體而得到本發明所需要的重組雙癌基因表達質粒pLMP1-p53mt。
(2)重組表達載體的體外表達用脂質體介導的轉染法將步驟(1)中的重組表達載體轉染人宮頸癌HeLa細胞和鼻咽癌HNE1細胞，進行體外表達驗證。
(3)轉基因模型首建鼠的獲得將步驟(1)中的重組表達質粒酶切線性化，顯微注射小鼠受精卵，再將經處理的受精卵移植到假孕母鼠中，產出小鼠，並通過PCR篩選和Southern雜交的方法驗證獲得F0轉基因小鼠。
(4)轉基因模型動物的繁殖與篩選將F0首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配獲得仔鼠，利用PCR法進行篩選，得到G1代轉基因陽性雜合子小鼠。為了提高PCR檢測的準確性和效率，重新設計引物(稱為第5對引物)，上遊位於突變型p53基因的3′端，下遊位於LMP1基因的EDL啟動子區，只需通過1對引物就可進行雙基因檢測。將同胞或同宗G1代陽性小鼠異性交配，獲得G2代，以同樣方法反覆繁殖，獲得純系轉基因後代。
用於突變型p53基因和LMP1雙基因整合檢測的第5對引物，上遊序列為5′-GCCATA CCA CAT TTG TAG AG-3′；下遊序列為5′-TCC CAG TAA ATG GAG GGA G-3′，產物為491bp。PCR反應條件94℃4min，97℃40s、54℃25s、72℃18s；94℃30s、54℃25s、72℃18s，34個循環；72℃8min。
在以往的研究中，PCR擴增出現的假陽性率高，不能作為轉基因動物篩選的標準。本研究中設計了一對特殊引物，成功地篩選出雙癌基因陽性小鼠，準確率高，且簡單方便，成本降低。
本發明的優點為
1、在PCR檢測中，用1對引物準確篩選出雙轉基因陽性後代小鼠；
2、F0首建鼠在第一次與野生鼠交配時，增加交配次數，以獲得儘可能多的G1代小鼠，從而能從G1代中篩選出足量的陽性鼠，能夠實現G1代異性同胞的交配，以便大量獲得的陽性後代；
3、本發明獲得的轉基因小鼠表現出明顯的上皮細胞癌變傾向，並且該表型可以垂直遺傳。因此，轉突變型p53和LMP1基因小鼠的成功構建，將在上皮細胞癌變機理和防治措施研究中產生重要的理論意義和實際意義。
具體實施例方式
實施例鼻咽、鼻腔癌前病變轉基因小鼠模型的製作步驟
1、構建雙癌基因真核表達質粒
設計引物(加上接頭，稱第1對引物)以pSG5.LMP1為模板擴增，得到EDL-2啟動子及其調控區。然後用EcoR I和BamH I分別雙酶切該PCR產物和pSG5.LMP1，回收啟EDL-2動子區、pSG5.LMP1的載體部分pSG5和LMP1基因，將EDL-2與pSG5連接得到質粒pSG5.EDL；用BamH I酶切pSG5.EDL，去磷酸化，與LMP1基因連接，得到pEDL.LMP1，用Bgl II酶切鑑定連接的LMP1基因的正反方向；再用EcoR I和Xba I雙酶切pLXSN和正向插入的pEDL.LMP1，將前者的4.3kb片段和後者的3.4kb片段連接得到質粒pLMP1；以質粒pCMV-p53mt為模板，設計引物(稱第2對引物)擴增，得到突變型p53融合基因(包括啟動子區、基因編碼區、終止區和多聚腺苷酸合成信號)，用Spe I和BsrG I雙酶切pLMP1和突變型p53融合基因部分(即PCR產物)，連接得到質粒pLMP1-p53mt。所述重組表達質粒結構見圖1，表達載體具有氨苄青黴素抗性基因(Ampr)、LTR啟動子區、CMV強啟動子及其周圍調控序列、突變型p53基因和EDL-2啟動子其周圍的調控序列以及潛伏膜蛋白1基因、SV40病毒晚期轉錄單元的多聚腺苷酸合成信號，雙癌基因真核表達質粒pLMP1-p53mt序列為9.1kb，經部分測序鑑定連接正確。
質粒DNA的提取、PCR產物的回收按試劑盒說明書進行。質粒DNA的酶切、連接、轉化、瓊脂糖凝膠電泳分析以及感受態細胞的培養等均按《分子克隆》第二版進行。
引物序列 由上海生物工程有限公司合成。第1對引物用於特異性啟動子區的擴增，上遊序列為5』-CGG AAT TCA TGG CGG CGG TGA TCC ACA-3』，含EcoR I位點；下遊序列為5』-GAT AGG ATC CCT CGA GAG TGA GGC ACA-3』，含BamH I位點，產物為782bp。PCR反應條件94℃30s、72℃50s，35個循環；72℃8min。
第2對引物用於p53mt融合基因的擴增，上遊序列為5』-ACT AGT AAT CAA TTA CGGGGT CA-3』，含Spe I位點；下遊序列為5』-TGT ACA CAA CTA GAA TGC AGT GA-3』，含BsrG I位點，產物為2053bp。PCR反應條件94℃30s、60℃30、72℃90s，35個循環；72℃8min。
2.重組真核表達載體的體外表達
(1)轉染HNE1和HeLa細胞
常規培養HNE1和HeLa細胞人鼻咽癌細胞株HNE1和人宮頸癌細胞株HeLa，復甦後接種於含15％胎牛血清RPMI 1640培養液中，在37℃、5％CO2條件下培養。待細胞長滿單層後，D-Hanks液洗滌2次，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化傳代，隔天換液。使用時製備細胞懸液，並按實驗要求調成所需細胞密度。
在轉染前一天，在24孔培養板的孔內預先置放無菌蓋玻片，每孔加500μL不含抗生素的RPMI 1640培養液，調整細胞密度至1.0×105。在轉染的當天，要求細胞密度最好達到90％～95％。吸棄原培養液，PBS(pH7.2)漂洗一次，加入用無雙抗(青黴素和鏈黴素)、無血清RPMI 1640培養液配製的脂質體-質粒混合物(脂質體1∶50；質粒DNA終濃度為4μg/mL)，常規條件培養6h後，換成含10％胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養液，繼續培養48h，分析外源基因的表達。
(2)外源基因mRNA表達水平的檢測
通過RT-PCR檢測外源基因RNA的表達水平。按試劑盒說明書進行。RT-PCR引物根據LMP1基因(稱為第3對引物)和突變型p53基因(稱為第4對引物)設計，由上海生物工程有限公司合成。
第3對引物用於LMP1基因整合和表達的檢測上遊序列為5′-TCT TAG GTC TCTGGA TCT AC-3′；下遊序列為5′-TTG TCA TCA GTG TTG TCA GG-3′，產物為496bp。PCR反應條件95℃預變性5min；然後94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸30s，共35個循環；72℃8min。第4對引物用於突變型p53基因的整合和表達檢測，上遊序列為5′-CAA GAT GTT TTA CCA ACT GGC C-3′；下遊序列為5′-CAG CTC GTG GTGAGG CTC C-3′，產物為504bp。PCR反應條件94℃4min，97℃40s、60℃30s、72℃30s；94℃30s、60℃30s、72℃30s，34個循環；72℃8min。
RT-PCR檢測到，經pLMP1-p53mt質粒DNA轉染的HNE1細胞和HeLa細胞中有LMP1基因的表達，經pLXSN轉染的陰性對照組和未轉染的空白對照組均無LMP1的表達；同樣方法檢測到，經pLMP1-p53mt轉染的HNE1細胞和HeLa細胞中有突變型p53基因的表達，經pLXSN轉染的陰性對照組和未轉染的空白對照組均無突變型p53基因的表達。結果說明，該重組表達質粒可以用於轉基因動物製備。
3.轉基因小鼠的製備
注射用雙癌基因真核表達質粒DNA的製備環行雙癌基因重組質粒DNA經Spe I單酶切斷線性化，用凝膠純化QIAGEN試劑盒回收目的片段。DNA溶解在顯微注射緩衝液[Tris·HCI(pH7.4)10mmol/L，乙二胺四乙酸(EDTA)0.1mmol/L]，其終濃度為1.7μg/mL。
雄鼠輸精管的結紮、供體鼠的超排卵及交配、假孕母鼠的準備、受精卵的採集、顯微注射及移植等均參考文獻(孫晗笑主編.轉基因技術理論與應用[M]。河南醫科大學出版社，2000年9月第1版)。外源基因被注射入C57BL/6J(♀)與CBA(♂)的雜交一代受精卵雄性原核，然後，移植入假孕母鼠輸卵管，產出仔小鼠。
實驗中共注射了707枚受精卵，將其移植入30隻假孕母鼠的輸卵管中，其中26隻母鼠懷孕，假孕母鼠懷孕率為86.67％；共出生子代鼠179隻。
4.轉基因首建鼠的篩選
(1)鼠尾基因組DNA的提取
剪取出生3wk的小鼠尾尖1.0～1.5cm，加入0.7mL的消化裂解液[Tris HCl 0.1moL/L(pH8.0)，EDTA 0.01moL/L，NaCl 0.2moL/L，SDS 1％]、35μL(10mg/mL)蛋白酶和10μL(10mg/mL)RNase，充分混勻，於55℃搖蕩過夜；加入0.7mL苯酚溶液，用等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提1次；乙醇沉澱DNA；室溫蒸發乙醇，加入0.2mL TE，4℃過夜，溶解DNA。
(2)PCR檢測
取0.5μL DNA為模板，PCR檢測基因的整合。方法同2，0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。
(3)小鼠基因組DNA的Southern blot檢測
取PCR陽性的小鼠基因組DNA 10μg，以同種普通小鼠基因組DNA及注射用外源基因作為陰性對照和陽性對照，以內切酶BamHI充分消化，0.8％瓊脂糖凝膠電泳後轉移至尼龍膜。DNA雜交以EDL-2及其調控區為探針，按照「DNA隨機引物標記試劑盒」所述方法以地高辛標記探針。信號檢測參照地高辛檢測試劑盒的方法進行。
利用PCR從179隻小鼠中篩選出9隻攜帶突變型p53基因的小鼠，同時用LMP1基因引物擴增也為陽性，陽性率為5.03％。將PCR陽性的首建鼠尾DNA進行Southern blot檢測，確證9隻小鼠均為陽性。
5.轉基因小鼠模型的繁殖和篩選
將F0首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產，獲得仔鼠，利用PCR法進行篩選，得到G1代轉基因陽性雜合子小鼠。為了獲得儘可能多的陽性G1代小鼠，將每隻首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配10批以上，並且儘量縮短每批交配的時間，一旦發現雌性小鼠出現陰栓，就將雄鼠隔開。將同胞或同宗G1代陽性異性小鼠交配，獲得G2代，用同樣的方法重複繁殖和篩選，獲得純系轉基因後代。根據外源基因在轉基因小鼠中的表達強弱和病理特徵表現是否明顯，最後建成2個單系的轉LMP1-p53mt基因小鼠模型。圖2～4分別為部分G1、G3、G6代轉基因小鼠PCR篩選電泳結果。可以看出，即使在G6代，PCR電泳結果雙癌基因也為陽性，並且隨著傳代次數的增加，陽性率越來越高。
6.轉基因小鼠不同器官組織中突變型p53蛋白和LMP1的表達檢測和定量分析
隨機抽取1隻F0轉基因小鼠(6月齡)，注射25％烏拉坦麻醉後，分別取鼻腔黏膜、鼻咽黏膜、肺、食管、胃、大腸、肝、腎、脾組織，於4％多聚甲醛中固定24h以上，然後脫水、透明、石蠟包埋、切片，切片厚4μm。以同齡C57BL/6J小鼠相應器官組織為對照。免疫組化檢測程序按即用型SABC免疫組化染色試劑盒操作步驟進行，以PBS代替一抗作為陰性對照。陽性細胞著色顯示棕黃色顆粒，顆粒位於胞漿或膜上(見圖5)。從圖5可以看出，轉基因小鼠各器官組織中突變型P53蛋白主要表達於胞漿中，LMP1則主要表達於細胞膜和胞漿中。
定量分析方法與結果 以細胞內有明顯的棕黃色信號顆粒或信號斑為陽性，不著色為陰性。PBS取代一抗作為陰性對照，已知陽性組織作為陽性對照。利用HPIAS-1000高清晰度病理圖像分析系統對p53mt和LMP1蛋白表達進行圖像分析。先在顯微鏡下仔細觀察每張切片的轉入基因表達狀況，選取蛋白產物表達陽性者進行相關數據測量。每次測量前，均以統一的空白片作標準，調整系統光度值，設定標準灰度，在同一灰度條件下，避開無細胞的區域；在同一光強下，選擇表達陽性的視野(20×)，用滑鼠按細胞的形態畫出細胞輪廓，啟用自動測量程序檢測陽性細胞的平均灰度值。每個組織切片共檢測5個區域。系統設定白色最大灰度為256，黑色最小灰度為0。因此，灰度值越小，代表其陽性反映程度越高。
統計分析方法採用SPSS 12.0軟體對數據進行分析。計量資料多組比較採用方差分析，並進行兩兩比較；兩組比較採用t檢驗。
表1 F0轉基因鼠不同器官組織中LMP1基因表達的平均灰度值(n＝5，x±s)
與未轉基因對照鼠比較，*P＜0.05，**P＜0.01
表2 F0轉基因小鼠不同器官組織中p53mt基因表達的平均灰度值(n＝5，x±s)
與未轉基因對照鼠比較，*P＜0.05，**P＜0.01
F0轉基因小鼠突變型p53和LMP1的免疫組化染色法檢測結果在鼻咽、鼻腔、肺、食管、胃組織的上皮細胞胞漿中檢測到了LMP1基因的表達，其中以鼻腔和鼻咽部表達水平最高(見表1)，在各器官組織中均檢測到了突變型p53基因的表達，在鼻腔和食管的表達水平最高(見表2)，其次是鼻咽、大腸和肺。LMP1在鼻咽和鼻腔表達水平最高，可能與調控該基因的啟動子區的相對嗜鱗狀上皮特性相關。
G3代轉基因小鼠鼻腔黏膜、鼻咽組織、肺、食管、胃、大腸、肝、腎、脾組織中突變型p53和LMP1的表達結果在鼻咽、鼻腔、肺、食管、胃組織的上皮細胞胞漿中檢測到了LMP1基因的表達，其中以鼻腔和鼻咽部表達水平最高(見表3)，在各組織中均檢測到了突變型p53基因的表達，在鼻腔和鼻咽組織的表達水平最高(見表4)，其次是大腸和肺。
表3 轉基因鼠不同器官組織中LMP1基因表達的平均灰度值(n＝10，x±s)
注與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
表4 轉基因小鼠不同器官組織中突變型p53基因表達的平均灰度值(n＝10，x±s)
注與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
7、轉基因小鼠相關器官組織的病理組織學檢查
陽性轉基因小鼠各相關器官組織的切片方法同6。切片厚4μm，H-E染色，光學顯微鏡下閱片，觀察病理變化。以同齡C57BL/6J小鼠器官組織為對照。
分別觀察6月齡、8月齡、10月齡、12月齡、14月齡、16月齡、18月齡轉基因小鼠模型各相關器官組織的形態學變化(主要是病理變化)，G3代8月齡小鼠模型的部分病理檢測結果見圖6鼻腔黏膜、鼻咽、食管、胃、大腸、肺出現炎症，鼻腔黏膜中性粒細胞浸潤，並且表現出上皮細胞排列無序，細胞中度不典型性變，增生；鼻咽組織也有中性粒細胞浸潤，上皮有典型增生及灶性鱗狀化生；食管出現中性粒細胞浸潤及淋巴細胞浸潤，上皮層次增多，但細胞無異型性；胃出現腸上皮化生；腸腔黏液分泌增多，固有膜纖維組織增生；其它部位未出現明顯病變。結果說明，模型已經成功建立，按隨機抽樣方法，從各代轉基因小鼠模型中抽樣進行同樣觀察，模型上皮細胞癌變相關生物學表型能穩定遺傳。
8、轉基因小鼠模型鼻腔和鼻咽黏膜組織細胞增殖及凋亡相關基因表達活性的檢測
G3代轉基因小鼠鼻腔黏膜、鼻咽組織常規石蠟切片，以同齡C57BL/6J小鼠組織為對照。免疫組化檢測bax、bcl-2、PCNA(增殖細胞核抗原)基因的表達活性。檢測和定量分析方法同6。陽性細胞顯棕黃色著色顆粒，bax、bcl-2陽性著色顆粒位於胞漿，PCNA陽性著色顆粒位於細胞核。
與未轉基因對照鼠相比，轉基因小鼠模型鼻腔黏膜和鼻咽上皮組織中bcl-2和PCNA表達水平顯著增高，bax表達水平顯著降低(P＜0.01)(見表5)。細胞的凋亡活性是受相關基因程序化控制的，促進凋亡的基因與抗凋亡基因形成複雜的網絡，其中Bcl-2家族是較先被注意到與細胞凋亡有密切關係的基因之一，bcl-2過度表達可促使細胞提高對各種致命因素的抵抗力，延長細胞壽命。家族的另一成員bax的過度表達可促使細胞凋亡。bcl-2和bax二者的比值在一定程度上可反應細胞凋亡的趨勢。正常組織中，兩者表達水平處於平衡狀態。PCNA是一種反映細胞增殖活性的客觀指標。轉基因小鼠鼻腔和鼻咽組織中bcl-2的高表達使bax/bcl-2比值失衡，細胞正常凋亡受到抑制，生存期限延長，細胞增殖相對速度增加，導致組織上皮細胞過度增殖，PCNA表達水平顯著增高，也提示細胞增殖活性提高。因此，轉基因小鼠鼻咽組織和鼻腔黏膜發生的癌前病變可能與抗凋亡基因Bcl-2的表達增強和bax的表達降低及二者比值增高密切相關。
表5 轉基因小鼠模型bax、bcl-2和PCNA表達的平均灰度值(n＝10，x±s)
注與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。
權利要求
1、一種上皮組織癌前病變轉基因動物模型的製作方法，包括構建pLMP1-p53mt重組表達質粒，重組表達質粒的體外表達，轉基因模型首建鼠的獲得，轉基因模型動物的繁殖與篩選，其特徵在於將獲得的轉基因首建鼠F0與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產，獲得仔鼠，然後設計一對引物，用PCR法篩選得到G1代轉基因陽性雜合子小鼠，再將同胞或同宗G1代陽性異性小鼠交配，獲得G2代，繼續以同樣方法繁殖篩選，以獲得純系轉基因後代，
引物上遊序列為5′-GCC ATA CCA CAT TTG TAG AG-3′；
引物下遊序列為5′-TCC CAG TAA ATG GAG GGA G-3′。
全文摘要
本發明涉及上皮細胞癌前病變轉基因動物模型，將構建的雙癌基因轉入(C57BL/6J♀×CBA♂)受精卵獲得F0首建鼠，首建鼠與野生型C57BL/6J小鼠交配，自然生產得仔鼠，設計一對雙基因檢測引物，用PCR法篩選仔鼠，得G1代轉基因陽性雜合仔小鼠，經同胞或同宗G1陽性異性小鼠交配得G2代，以同樣方法繁殖獲得純系轉基因後代；對轉基因小鼠不同器官組織中雙癌基因的表達檢測和定量分析，在F0和G3代組織中均檢測到雙基因的表達，其中，以鼻腔和鼻咽部位的表達水平最高；對轉基因小鼠病理組織切片檢查，在G3代8月齡小鼠的切片中，鼻腔與鼻咽黏膜均出現明顯病變；本發明製作的上皮細胞癌變轉基因動物模型的雙癌基因可穩定遺傳，為上皮細胞癌變的機理和防治研究提供有價值的動物模型。
文檔編號C12N15/63GK1879893SQ200610031600
公開日2006年12月20日 申請日期2006年4月30日 優先權日2006年4月30日
發明者何迎春, 田道法, 唐發清, 劉書靜, 毛積芳 申請人:湖南中醫藥大學