兔出血症病毒樣顆粒、其製備方法及應用的製作方法

2023-06-01 10:44:01

兔出血症病毒樣顆粒、其製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種兔出血症病毒樣顆粒，其是根據昆蟲細胞偏愛密碼子，對兔出血症病毒VP60基因進行優化，將優化後的VP60基因與昆蟲細胞高效表達載體連接，利用杆狀病毒/昆蟲細胞表達系統來生產兔出血症病毒樣顆粒。將所述兔出血症病毒樣顆粒與防腐劑和佐劑混合，即製備得到兔出血症疫苗。本發明可大幅度提高兔出血症病毒樣顆粒的表達量，具有安全性高、免疫原性好、易發酵、成本低等優點。
【專利說明】兔出血症病毒樣顆粒、其製備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物領域、基因工程領域及獸醫生物製藥領域，具體地說，涉及一種兔出血症病毒樣顆粒、其製備方法及應用。
【背景技術】
[0002]兔病毒性出血症俗稱兔痕，是由兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic diseasevirus,RHDV)弓丨起的一種急性、烈性、高度接觸性和致死性傳染病。因曾是兔的一種毀滅性傳染病，給養兔業帶來巨大的經濟損失而備受養兔業的關注。1984年中國首次報導了該病。1989年，世界動物衛生組織(OIE)將該病正式列為B類傳染病，我國將其列為二類傳染病(王永坤等，兔瘟的診斷與防治，1992)。
[0003]在2000年國際病毒分類委員會(ICTV)的第七次報告中，將兔出血症病毒列入了杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)。RHDV病毒粒子呈球形,無囊膜,直徑32-36nm，20面體對稱(張麗紅等，廣東畜牧獸醫科技，31:9_11，2006)。其衣殼由32個高4-6nm的圓柱狀殼粒構成，由主要結構蛋白VP60多重拷貝所組成，核心直徑為17_23nm。負染電鏡表面具有嵌杯樣病毒典型的杯狀形態結構，電鏡下還可見少數沒有核心的病毒空衣殼。病毒在氯化銫中的浮密度為1.29-1.34g/cm3，沉降係數為85_162S(李海等，貴州畜牧獸醫，28:10-11，2004)。
[0004]RHDV基因組為單股正鏈RNA，全長7437bp，分子量為(2.4xl06_2.6xl06) KD，5』末端無帽狀結構，3』末端有一個短的polyA尾。RHDV基因組含2個開放閱讀框。5』末端的長開放閱讀框架(ORFl)編碼一個2344胺基酸的多聚蛋白前體，它被病毒蛋白酶進一步分解為衣殼蛋白和多個非結構蛋白，其中衣殼蛋白為病毒的主要結構蛋白，稱為VP60，與誘導抗病毒感染的免疫反應直接相關。3』末`端的短開放閱讀框架(0RF2)，位於7025-7378bp之間，編碼病毒另一個小的結構成分，稱為VP10，鹼性蛋白且含量較低，可能在病毒粒子中與病毒RNA結合。除基因組RNA外，在感染的組織和病毒顆粒中還含有2.4kb的亞基因組RNA，也編碼衣殼蛋白，並且該片段在5』端也與VPg蛋白共價結合(嚴維巍等，中國養兔雜誌，1:26-29，2001)。
[0005]VP60的N-端組成衣殼蛋白的內部區，C-端組成衣殼蛋白的外部。N-端的第31-250之間的胺基酸是主要的抗感染免疫決定區。對VP60蛋白的研究發現，體外表達該衣殼蛋白時，在沒有其他任何成分存在的條件下，可自然聚合成不包裹核酸的、與天然RHDV病毒粒子在物理形態上類似的病毒樣顆粒(Rob N, Virus-like particle asimmunogens, Trends in Microbiology, 11:438 - 444, 2003)。近年來，應用病毒樣顆粒作為疫苗的抗原載體逐漸受到科學家們的重視。病毒樣顆粒是模擬病毒的顆粒形態特點，將外源基因片段產物呈遞到病毒顆粒表面而形成的嵌合顆粒，它的外部形態與病毒顆粒相同，甚至還有某些病毒受體的天然配體；同時，還可將其他病原的特異性抗原等呈遞在顆粒表面，因而在病原體的疫苗研究中發揮著重要的作用。VLPs常可以誘導產生較滅活疫苗和可溶性多肽更為強烈的體液免疫應答，因為其表面是以非感染性的顆粒狀態模擬天然抗原呈遞過程來呈遞糖蛋白抗原的，而該方法提呈引起的免疫應答優於溶解狀態，故在保護作用中起重要作用的糖蛋白抗原引起的免疫應答可望更接近自然感染，這樣，病毒樣顆粒更有可能廣泛用於疫苗的研製。並且，由於VLPs不包裹核酸，不能複製，因此也沒有感染性，是一種安全的抗原載體(Nagesha H S, Virus-like particles of calicivirus as epitopecarriers, Arch Virol, 144:2429-2439, 1999)。
[0006]大量實驗表明，RHDV不能在雞胚上增殖，也難於在各種原代或傳代細胞中穩定增殖。目前廣泛使用的疫苗為組織滅活苗。近來，新型疫苗的研究主要集中在基因工程苗的研製上，已在大腸桿菌、釀酒酵母、痘苗病毒以及植物等多種表達系統中表達了 VP60蛋白(劉懷然等，動物醫學進展，24:7-9, 2003)。Boga等在大腸桿菌中表達了 RHDV西班牙AST/89株的主要衣殼蛋白VP60，發現當VP60以β-半乳糖苷酶融合蛋白表達時，僅與天然VP60具有部分相同抗原並不誘導產生保護性免疫；而在以T7RNA聚合酶為基礎的表達系統中則可表達與天然VP60抗原性極為相似的蛋白質並可誘導產生有效的保護性免疫，能抵抗住提純RHDV的致死性攻擊；Boga等在釀酒酵母中表達VP60並能形成病毒樣顆粒；FamoS等將Spanish isolate AST/89的VP60在酵母中進行高效表達，蛋白表達量高達1.5g/L，且約70%表達蛋白進行了糖基化修飾；嚴維巍等將RHDV VP60基因插入pPICZ B經畢赤酵母表達的重組蛋白具有血凝特性且可被抗RHDV的高免血清所抑制(嚴維巍等，中國獸醫學報，23:447-449, 2003)。Fernandez-Femandez等採用洋李痘馬鈴薯Y病毒構建的載體成功表達了 VP60，該表達產物接種兔能抵禦致死劑量RHDV的攻擊(Fernandez-Fernandez MR, Protection of rabbits against rabbit hemotthagic disease virus by immnizationwith the VP60protein expressed in plan ts with a potyvirusbased vector, Virology, 280:283-291,2001) ;Castanon等採用馬鈴薯表達含VP60的抽提物對兔進行免疫，產生特異的抗體反應並可提供對RHDV強毒攻擊的保護(Castanon S，The effect of thepromoter on expression of VP60gene from rabbit hemorrhagic disease virus inpotato plants, Plant Science, 162:87-95,2002)。
[0007]目前，RHDV基因工程疫苗研究中仍然存在一些問題:大腸桿菌表達的VP60具有不可溶性及免疫效果相對較差的缺點，應用前景並不樂觀；重組病毒疫苗存在向環境擴散經遺傳修飾的生物體安全問題；採用轉基因植物生產VP60的表達水平目前還不理想；因而研製RHD安全、高效的新型疫苗勢在必行。
[0008]兔瘟以呼吸系統出血，實質器官水腫、淤血及出血變化為特徵，感染兔常在48-72小時內死亡。根據病變特點可作出初步診斷，結合實驗室檢測方法進行確診，主要採用血凝實驗(HA)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、免疫電鏡技術及分子生物學方法。
[0009]昆蟲杆狀病毒表達載體系統(BEVS)自1983年建立以來，已有近千種外源基因在該系統中進行表達。其優點為=(I)BEVS表達效率高，表達產物的生物活性高，其抗原性、免疫原性均與天然蛋白相似；(2)杆狀病毒能容納較大的外源基因而不影響其本身的增殖；
(3)應用晚期多角體蛋白基因啟動子表達外源基因，即使重組基因產物對細胞有毒性，也不影響表達水平；(4)借多元表達載體或借幾個不同重組病毒共感染，可以同時表達2個或更多個外源蛋白，研究肽鏈超分子裝配以及蛋白寡聚體的結構與功能；(5)杆狀病毒對脊椎動物無病原性，昆蟲細胞沒有與人畜共患的疾病，被認為遺傳學上是安全的表達載體(景志忠等，中國獸醫科技，31:43-45，2001)。[0010]目前，杆狀病毒表達系統的有關技術已相對成熟，利用該系統表達外源基因，不僅經濟、高效，而且可提供一條新的技術途徑。利用生物反應器生產兔出血症病毒樣顆粒，保證其具有正常的蛋白結構和生物學免疫活性，為兔出血症疫苗的商業生產奠定基礎。

【發明內容】

[0011]本發明的目的是利用杆狀病毒-昆蟲細胞表達系統，提供一種高效製備兔出血症病毒樣顆粒的方法。
[0012]為了實現本發明目的，本發明的一種兔出血症病毒樣顆粒的製備方法，包括以下步驟:
[0013](I)根據昆蟲細胞偏愛密碼子對兔出血症病毒VP60基因進行優化，得到優化的兔出血症病毒VP60基因；(2)重組杆狀病毒Bacmid質粒的構建:將優化的VP60基因插入到昆蟲細胞高效表達載體中，轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，提取陽性質粒即為重組杆狀病毒Bacmid質粒；(3)重組杆狀病毒的拯救:用重組杆狀病毒Bacmid質粒轉染昆蟲細胞，拯救獲得重組杆狀病毒；(4)兔出血症病毒樣顆粒的製備:將獲得的重組杆狀病毒接種昆蟲細胞，培養後收穫上清，即得到兔出血症病毒樣顆粒。
[0014]本發明還提供採用上述方法製備的兔出血症病毒樣顆粒。
[0015]本發明還提供所述兔出血症病毒樣顆粒在製備兔出血症疫苗中的應用。
[0016]本發明還提供一種兔出血症疫苗，由上述方法製備的兔出血症病毒樣顆粒輔以防腐劑(例如疊氮鈉)和佐劑(氫氧化鋅與硫酸乙醯肝素複合物)製備而成。
[0017]優選地，本發明的高效製備兔出血症病毒樣顆粒的方法，包括克隆獲得高滴度兔出血症病毒株的VP60基因序列，將`其按昆蟲細胞的密碼子頻率進行密碼子優化。將優化後的序列克隆到具有多個啟動子與表達盒(例如雙啟動子與雙表達盒)的轉移表達載體中。將轉移表達載體與杆狀病毒DNA進行同源重組或轉座，轉染Sf9昆蟲細胞拯救獲得重組杆狀病毒。用IF和WB方法鑑定重組病毒，滴定重組病毒。將重組杆狀病毒按照一定的MOI感染ΒΤΙ-Τη-5Β1-4昆蟲細胞，搖瓶或發酵培養，4-6天後凍融收穫，即得。
[0018]其中，所述的兔出血症病毒衣殼蛋白基因VP60的原始序列及經密碼子優化後的序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2所示，由它們編碼的胺基酸序列如SEQ ID NO: 3所示。
[0019]步驟(2)中所述昆蟲細胞高效表達載體(即轉移表達載體)選自AcRP23_lacZ、AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac> Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcCl 29、pAcC4、DZ1、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWU pAcUW2U pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW3U pAcUW4U pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51> pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacII1、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL, pJVNheI, pJVP10, pJVrsMAG, pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEXl.UpSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI_、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030> pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A、pFastBacHT B,pFastBacHT C、pFastBacDual或其它類似的杆狀病毒同源重組或轉座載體中的至少一種。優選pFastBacDual杆狀病毒運載載體。[0020] 本發明中所構建的轉移表達載體為帶有兔出血症病毒VP60基因密碼子優化後序列的載體 pFastBacDua-VP60-VP60_Y。VP60 優化基因分別位於 polyhedrin promoter (Ph)和Pltl兩個高效啟動子下遊，形成兩個高效表達盒。
[0021 ]所述杆狀病毒選自 BmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV, HzNPV, LdMNPV, MbMNPV, OpMNPV,SIMNPV, SeMNPV, SpltNPV中的至少一種。優選苜蓿銀紋夜蛾核型多角體杆狀病毒親本株AcMNPVo
[0022]所述重組杆狀病毒為重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒rAcMNPV(AcMNPV-VP60-VP60-Y)。
[0023]所述的昆蟲細胞來源於鱗翅目昆蟲,例如，草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf21、Sf9、Mimic Sf9 細胞系、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua) Se301 細胞系、BCIRL/AMCY-SeE-CLGl 細胞系、BCIRL/AMCY_SeE_CLG4 細胞系、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)ΒΤΙ-Τη-5Β1-4 細胞系、BT1-Tn-5C1 細胞系、BT1-Tn_5F2 細胞系、斜紋貪夜蛾(Spodopteralitura)ZSU-Sl-l細胞系、IBL-SLlA細胞系和家蠶卵巢細胞系BmN。優化組合為，用Sf9細胞進行重組杆狀病毒的拯救和滴定，用H5昆蟲細胞進行病毒樣顆粒的表達。
[0024]本發明採用基因重組技術，對兔出血症病毒的VP60基因序列進行密碼子優化，將該基因的原始序列(SEQ ID NO:1)及優化序列(SEQ ID NO:2)克隆到杆狀病毒轉移表達載體中，在PH、PlO啟動子或其它病毒和真核生物的強啟動子控制之下,通過體內或體外(invivo/in vitro)重組，使VP60的原始序列及優化後序列整合到杆狀病毒的基因組上，得到重組病毒；重組病毒感染昆蟲細胞,表達生產兔出血症病毒樣顆粒。
[0025]本發明的一個最優選的技術方案為:對兔出血症病毒(RHDV)的衣殼蛋白基因序列進行密碼子優化，將該衣殼蛋白的原始序列及優化後的序列，即SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2所示的鹼基序列克隆到杆狀病毒運載載體pFastBacDual上，再通過體內重組將兔出血症病毒VP60基因的原始序列VP60及密碼子優化後的序列VP60-Y多啟動子控制下的表達盒轉移到苜蓿銀紋夜蛾杆狀病毒`親本株AcMNPV的基因組上，插入非功能區，通過空斑篩選技術和PCR檢測技術，獲得攜帶單拷貝和多拷貝兔出血症病毒VP60基因的重組苜蓿銀紋夜蛾杆狀病毒rAcMNPV-VP60、rAcMNPV-VP60-VP60-Y ;將其感染昆蟲細胞系，大量繁殖rAcMNPV-VP60、rAcMNPV-VP60-VP60-Y ;當重組杆狀病毒在昆蟲細胞內複製時，VP60基因在多啟動子(PH、P1CI)控制下高效表達，自組裝成兔出血症病毒樣顆粒；在感染4-6天後收集細胞培養液，便得到安全、高滴度的兔出血症病毒樣顆粒，該抗原可用於製備預防兔病毒性出血症的注射用疫苗。
[0026]本發明採用杆狀病毒表達系統在昆蟲細胞生物反應器中安全、高效地生產兔出血症病毒樣顆粒，生產成本和安全性顯著優於傳統的製備兔出血症病毒抗原的方法。本發明方法可大幅度提高兔出血症病毒樣顆粒表達量，具有安全性高、免疫原性好、易發酵、成本低等優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為PCR擴增VP60基因瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中，M為DNA分子量標準，
1、2泳道分別表示陰性組織對照和陽性兔肝臟。
[0028]圖2為重組轉移載體BamH I/EcoR I雙酶切鑑定瓊脂糖電泳結果；其中，M:DNA分子量標準 DL15000 ； 1:pFastBacI; 2:pFastBac 1-VP60; 3:雙酶切 pFastBacl_VP60 產物。
[0029]圖3為重組表達載體轉染昆蟲Sf9細胞病變結果(200X顯微鏡下觀察);其中，左圖為正常細胞；右圖為病變細胞。
[0030]圖4為PCR法鑑定重組病毒的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；其中，M:DNA分子量標準DL2000 ；1:對照細胞；2:重組杆狀病毒；3:陽性質粒對照。
[0031]圖5為免疫螢光染色鑑定VP60蛋白表達結果；其中，左圖為AcMNPV_VP60病毒感染的Sf9細胞；右圖為空白對照Sf9細胞。
[0032]圖6為病毒樣顆粒血凝條件的優化示意圖；其中，A=PBS, 0.02M, pH7.0;B:PBS, 0.1M, pH7.00
[0033]圖7為電鏡負染觀察病毒樣顆粒的結果。
[0034]圖8為高效表達轉移載體構建模式圖。
[0035]圖9為重組質粒pFastBacDua-VP60-VP60_Y的酶切鑑定結果；其中，M:DNA分子量標準DL5000 ；1.用Sph I/Xho I雙酶切合成質粒pUC57_VP60 ；2.用BamHI/Not I雙酶切；
3.用Sph I/Xho I雙酶切。
[0036]圖10為重組病毒的PCR鑑定結果；其中，M:DNA分子量標準DL2000 ;1.PH啟動子下遊的VP60基因；2.PlO啟動子下遊的VP60基因。
[0037]圖11為免疫螢光染色鑑定VP60表達結果；其中，A為AcMNPV-VP60-VP60_Y病毒感染的Sf9細胞；B為空白對照Sf9細胞。
[0038]圖12為Western Blot鑑定VP60蛋白的表達結果；其中，A圖為SDS-PAGE檢測結果:1為空白對照，2為AcMNPV-VP60-VP60-Y感染的Sf9細胞；B圖為WesternBlot檢測結果:1為空白對照，2為AcMNPV-VP60-VP60-Y感染的Sf9細胞。
[0039]圖13為病毒樣顆粒的血凝效果對比檢測結果；其中，A為Sf9表達產物；B為H5細胞表達產物。
[0040]圖14為電鏡負染觀察病毒樣顆粒的結果；其中，A為病毒樣顆粒透射電鏡照片；B為病毒樣顆粒免疫電鏡照片。
[0041]圖15為RHDV病毒樣顆粒不同佐劑的免疫效果。
[0042]圖16為添加不同佐劑的RHDV病毒樣顆粒疫苗保護率。
[0043]圖17為免疫兔組織切片圖；其中，A.腎；B.肺；C.肝；D.脾；E.盲腸；F.氣管；G-H.心臟；(A-F.HE X 400; G-H.HE X 200)。
【具體實施方式】
[0044]以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&RussellDff, Molecular cloning:a laboratory manual, 2001),或按照製造廠商說明書建議的條件。
[0045]以下實施例中使用的試驗材料:
[0046]大腸桿菌株E.coli DH5 α購自Promega公司；克隆載體pEASY_T3購自全式金公司；克隆載體PMD18-T購自TaKaRa公司；原核表達載體pET_28a+、受體菌E.coliTOPIO和BL21 (DE3)購自長春西諾生物科技有限公司，運載載體pFastBacDual購自Invitrogen公司；Sf9和H5昆蟲細胞、苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒親本株AcMNPV購自長春西諾生物科技有限公司。
[0047]酶與試劑:限制性內切酶和配套的緩衝液均購自Promega公司；T4DNALigase及緩衝液為Promega公司產品；LA Taq聚合酶及緩衝液購自TaKaRa公司；RnaseA、dNTPs購自Sigma公司；各種規格的DNA和蛋白質分子量標準為TransGen Biotech公司產品；DEPC、M-MLV-Rtase (逆轉錄酶)購自Promega公司。
[0048]生化試劑:bisacrylamide、acrylamide、IPTG、X-Gal購自 Promega 公司；Tris、Ampicillin, Kanamycin, IPTG、SDS、尿素、咪唑、TritonX-100、TEMED (N, N, N』，N』 -Tetramethylethylene diamine)、過硫酸銨(Ammonium Persulfate)、卡那黴素(Kanamycin)> 細胞培養基TC-1OO購自Sigma公司；瓊脂糖為Sunbiotech公司產品；酵母抽提物(YeastExtract)、胰蛋白腖均購自英國OXOID公司；溴化乙錠(EB)、考馬斯亮蘭R-250購自Fluka公司；瓊脂粉為日本進口分裝；Proteinase K、胎牛血清購自Invitrogen公司；其它均為國產或進口分析純試劑。引物由上海生工生物技術有限責任公司合成。
[0049]培養基:大腸桿菌培養基為LB培養基；昆蟲細胞培養基為Grace培養基。
[0050]兔出血症病毒VP60基因表達產物的動物實驗在隔離實驗室中進行。
[0051]實施例1單拷貝兔出 血症病毒VP60基因在重組杆狀病毒中的表達與檢測
[0052]1.實驗方法
[0053]1.1.有關溶液和培養基的配製
[0054]溶液1:50mmol/L 葡萄糖，25mmoI /T, Tris-HCl (pH8.0), 10mmol /T, EDTA。
[0055]溶液II:0.2mol/L NaOH, 1%SDS (現用現配)。
[0056]溶液II1:1OOmL 體系，5mol/L 醋酸鉀 80mL，冰乙酸 12mL，ddH208mL。
[0057]TAE (50 X):242gTris 鹼，57.1mL 冰乙酸，IOOmL0.5mol/L EDTA (ρΗ8.0)，無菌水定容至 lOOOmL。
[0058]TER 溶液:胰 RNAse(RNAse A)溶解於 IOmM Tris-HCl U 5mMNaC I 中，配成 10mg/mL的儲存液_20°C凍存，用IXTE buffer稀釋成ZOyg/mL的工作液4°C保存。
[0059]PPt 緩衝液:異丙醇 22mL ；5mol/mL KAclmL ;ddH202mL。
[0060]IXTE 緩衝液:10mmol/L Tris.Cl (ρΗ8.0)，lmmol/L EDTA (ρΗ8.0)，121 °C 高溫高壓蒸汽滅菌20min後儲存於4°C。
[0061]溴化乙錠(EB)溶液母液:將EB配成濃度為10mg/mL，用鋁箔或黑紙包裹容器儲存
於室溫即可。
[0062]6mol/L Na1:將 0.75g Na2SO3溶於 40mL ddH20 中，加入 45gNaI 並攪拌至完全溶解，4°C儲存。
[0063]玻璃奶(Glassmilk):將IOg (100mg/mL, Sigma S-5631)的 Silica 溶於 IOOmL PBS中，沉澱2h,棄上清,重複該步驟2~3次；2000g離心2min,將沉澱物溶於3mol/L的NaI中，終濃度為100mg/mL，4°C下避光保存。
[0064]New Wash 洗液:Tris-HCl (pHL 4)20mmol/L ；EDTAlmmol/L ；NaC1100mmol/L ;與等體積的無水乙醇配製而成。
[0065]蛋白表達誘導物IPTG為lmol/L,超純水配製後用0.2mm濾器過濾除菌。
[0066]蛋白上樣緩衝液(2X): 100mmol/L Tris-HCl (ρΗ6.8)、200mmol/L 二硫蘇糖酉享(DTT)、4%SDS、0.2% 溴酚藍、10% 甘油。[0067]30%丙烯醯胺溶液:29g丙烯醯胺，IgN，N'-亞甲叉丙烯醯胺，溶於IOOmL /K，過濾。
[0068]考馬斯亮藍染液:0.24g考馬斯亮藍R250溶於90mL甲醇:水(1:1, v/v)和IOmL冰乙酸中。
[0069]脫色液:90mL甲醇:水(1:1，v/v)和IOmL冰乙酸。
[0070]裂解緩衝液(pH8.0):50mmol/L Tris_Base、0.1M NaCl。
[0071]包涵體洗滌液I (ρΗ8.0):20mmol/L Tris_Base、0.2M NaCl、l%TritonX_100。
[0072]包涵體洗滌液II (pH8.0):20mmol/L Tris_Base、0.2M NaCl、2M 尿素。
[0073]包涵體蛋白溶解液(ρΗ8.0):20mmol/L Tris_Base、0.2M NaCl、8M 尿素。
[0074]脲NTA-O 緩衝液:20mM Tris-HCl ρΗ7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol，8MUrea。脲NTA-500緩衝液:20mM Tris-HCl ρΗ7.9，0.5MNaCl，10%Glycerol，8MUrea，0.5M Imidazole。
[0075]Bradford 試劑為 Bio-Rad 公司 Protein Assay Dye-Reagent Concentrate。
[0076]ELISA 所需試劑:包被液(ρΗ9.6) 1.59g Na2CO3^2.93g NaHCO3^ddH2O 定容至 1L，保存於4°C ;臨用前配製封閉液，BSA溶於PBS中至終濃度為1% ;洗滌液為含0.05%Tween-20的PBS ;底物緩衝液為1.84g Na2PO4.12H20、0.51g檸檬酸、ddH20定容至IOOmL ；0PD顯色液是4mg OPD溶於IOmL底物緩衝液，加15 μ L30%H202,臨用前配製；終止液為2mol/L H2S04。
[0077]Western Blot試劑:半乾轉電轉膜緩衝液是14.41g甘氨酸、12.1lg Tris-Base、50mL甲醇、ddH20定容至1L、4°C保存；1XPBS加Tween-20至終濃度為0.1%配成洗滌液；BSA溶於PBS中至終濃度為3%為封`閉液；純化的多克隆抗體用封閉液按1:1000稀釋；HRP標記的羊抗兔IgG抗體用封閉液按1:1000稀釋；臨用前配製DAB顯色液，4mg DAB溶於IOmLIOOmmoI/L ρΗ7.5 的 Tris-Cl 中，加 15μ L30%H202。
[0078]LB培養基:胰蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，氯化鈉10g/L，調整pH值7.0(固體培養基含1.5%瓊脂)。液體培養基中加入1.5%瓊脂粉，121°C高溫高壓蒸汽滅菌15min，在溫度低於45°C且還未凝固時，加入相應抗生素溶液，混勻後倒入平板，為LB固體培養基，4°C保存備用。
[0079]1.2.兔出血熱病毒VP60基因原始序列的獲得
[0080]1.2.1.兔瘟種毒的分離鑑定
[0081]從某養兔場患有兔出血症的病死兔採集的樣本，研磨後1:3添加雙抗，注射健康兔lmL，發病後獲得的肝臟。
[0082]1.2.2.TRIzol 法提取基因組 RNA
[0083](I)將兔肝放入盛有Trizol (50_100mg組織/ImL)的玻璃勻漿器中勻漿，組織體積不要超過Trizol體積的10% ；
[0084](2)將勻漿液在室溫下放置5min以使核蛋白質複合體完全裂解；
[0085](3)加入氯仿(0.2mL/lml Trizol)，蓋緊管蓋並漩渦劇烈震蕩15sec ;室溫放置2_15min ；
[0086](4)4°C，12000g離心15min。離心後，混合液被分為三相:處於下層的淺紅色酚-氯仿有機相、中間相和上層無色水相。RNA存留在水相中，而DNA和蛋白質則存留於間相和有機相中，水相體積約為用於勻漿的Trizol體積的60%;
[0087](5)將水相移入新管,加異丙醇(0.5mL/lmLTrizol);室溫放置5-lOmin ;[0088](6)4-25°C,12000g離心8min，RNA沉澱在管壁或管底形成膠狀的或白色的小球；
[0089](7)棄上清，用lmL75%乙醇清洗RNA沉澱；然後4_25°C，7500g離心5min ；
[0090](8)棄上清，乾燥；沉澱重溶於20 μ L DEPC處理的雙蒸水(ddH20)或去離子甲醯胺中，_70°C保存備用。若沉澱難溶，可用吸管吹打數次並55-60°C溫育10-15min。
[0091]1.2.3.目的基因的獲得
[0092]根據GenBank公布的序列⑶339228，設計特異反轉錄引物RHDV-RT:5，-GGATTAAAACCTAACCTACC-3，。
[0093]VP60 基因原始序列的擴增引物為:VP60 上遊:5』 -AGGATCCAACATGGAGGGCAAAGCCCGCACAG-3』 (BamHI) ；VP60 下遊:5』 -GAGAATTCTCAGACATAAGAAAAGCCATTG-3』 (EcoR I)。
[0094]1.2.4.RT-PCR 反應
[0095]1.2.4.1.cDNA 第一鏈的合成
[0096]取2 μ LRNA (≤ μ g) + 2 μ L RHDV-RT + 13.75 μ L DEPC 處理水；70C，5min,迅速置冰上 5min ;加入 5 μ L5 XM-MLV 緩衝液 + 1.25 μ LlOmM dNTPs +1 μ LM-MLV-RT (200U)，使終體積為25 μ L ;混勻後室溫放置IOmin ;42°C反應Ih ；70°C 2min滅活RTase，_20°C保存備用。
[0097]1.2.4.2.PCR擴增目的基因
[0098]反應體系及反應程序見表1:
[0099]表1反應體系及反應程序
[0100]
【權利要求】
1.兔出血症病毒樣顆粒的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)根據昆蟲細胞偏愛密碼子對兔出血症病毒VP60基因進行優化，得到優化的兔出血症病毒VP60基因； (2)重組杆狀病毒Bacmid質粒的構建:將優化的VP60基因插入到昆蟲細胞高效表達載體中，轉化大腸桿菌DHlOBac感受態細胞，提取陽性質粒即為重組杆狀病毒Bacmid質粒； (3)重組杆狀病毒的拯救:用重組杆狀病毒Bacmid質粒轉染昆蟲細胞，拯救獲得重組杆狀病毒； (4)兔出血症病毒樣顆粒的製備:將獲得的重組杆狀病毒接種昆蟲細胞，培養後收穫上清，即得到兔出血症病毒樣顆粒。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(1)中優化的兔出血症病毒VP60基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述昆蟲細胞高效表達載體選自 AcRP23_lacZ、AcRP6_SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII (pETL)、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZ1、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A,pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAc JcC5、pBac 1、pBac2、pBlueBac II1、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL, pJVNheI, pJVP10, pJVrsMAG, pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEXl.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV V1-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBacl、pFastBacHT A> pFastB acHT B> pFastBacHT C、pFastBacDual 中的至少一種。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，步驟(2)中所述的昆蟲細胞高效表達載體為 pFastBacDualο
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，將優化的VP60基因分別構建到pFastBacDual中Pltl兩個啟動子的下遊,形成兩個高效表達盒。
6.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)和(4)中使用的昆蟲細胞選自草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda) Sf21、Sf9> Mimic Sf9 細胞系、甜菜夜蛾(Spodopteraexigua) Se301 細胞系、BCIRL/AMCY_SeE_CLGl 細胞系、BCIRL/AMCY_SeE_CLG4 細胞系、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)BT1-Tn-5Bl_4 細胞系、BT1-Tn_5Cl 細胞系、BT1-Tn_5F2 細胞系，斜紋貪夜蛾(Spodoptera litura) ZSU-Sl-1細胞系、IBL-SLlA細胞系和家蠶卵巢細胞系BmN中的至少一種。
7.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟(3)和(4)中使用的昆蟲細胞分別為Sf9 細胞、ΒΤΙ-Τη-5Β1-4 細胞。
8.根據權利要求1-7任一項所述的方法製備的兔出血症病毒樣顆粒。
9.權利要求8所述的兔出血症病毒樣顆粒在製備兔出血症疫苗中的應用。
10.一種兔出血症疫苗，其特徵在於，將權利要求8所述的兔出血症病毒樣顆粒輔以防腐劑和佐劑製備而成。
【文檔編號】C12R1/93GK103555766SQ201310515769
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月28日 優先權日:2013年10月28日
【發明者】夏振強, 鄭文文, 金宏麗, 張渭蛟 申請人:長春西諾生物科技有限公司