捕獲粒子的製作方法

2023-06-01 08:33:11 2

專利名稱：捕獲粒子的製作方法
捕獲粒子 對相關申請的交叉引用本申請要求2008年9月26日提交的題目為「用於對粒子進行聚集、引導和分類的微潤方寵(Microvortex for focusing，guiding and sorting of particles)，，的美國專利申請61/100，420的優先權，將其全部內容併入本申請作為參考。
背景技術：
微流體裝置(microfluidic device)可用於微量全分析系統(μ TAS)或實驗室晶片(LOC)系統，這是因為這些裝置能夠對小樣品體積進行分析且可被開發為低成本的高度平行的系統。具體地，這些系統可用於其中對粒子進行處理操作的生物和臨床應用，所述處理操作為例如對粒子樣品(例如細胞和膠體)進行濃縮、檢測、分類和聚集。與使用外部能量例如光能、磁力、電力、介電電泳、聲能等的有源操作(active manipulation)相比，通過諸如水力聚焦、尺寸過濾和沉降等技術對流動通過微流體裝置的粒子進行無源操作(passive manipulation)是相對簡單的。無源操作不依賴於外部能量來源而可利用裝置中微通道的幾何形狀和通過這些通道的流動條件來進行。相反地，主動操作將使用外部能量來源且可能需要將供能組件整合到微流體裝置中。

發明內容
本申請描述了涉及在具有凹槽的微流體裝置中基於親和性對粒子進行捕獲的技術。當本申請提及凹槽時，本申請包括例如長的窄通道(例如通過延伸到較大通道的壁中而形成且由較大通道的壁所限定的通道)。在一個方面，用於捕獲懸浮於流動通過微通道的流體中的粒子的方法包括使包含待捕獲的粒子的流體流動通過微通道且經過由微通道的壁表面限定的凹槽；使至少一些所述粒子與設置在微通道的一個或多個壁上的吸附物(adherent)接觸；和捕獲至少一些與吸附物接觸的粒子。在一個方面，微流體裝置包括微通道，所述微通道包括入口，位置距所述入口一定距離的出口，其中流體由入口流向出口，和限定到微通道的壁表面中的凹槽，所述凹槽包括頂部(apex)和兩個端部，每個端部與所述頂部相連，所述凹槽被定向成使流體朝向所述頂部而流動通過所述端部；和塗布於至少一個壁的用於選擇性附著所需分析物的吸附物。實施方案可單獨或以各種組合形式包括一個或多個以下特徵。在一些實施方案中，所述吸附物被設置在凹槽被限定在其中的壁的表面上。在一些實施方案中，所述凹槽被限定在所述微通道的壁中。在一些情況下，所述凹槽延伸到所述壁中。在一些實施方案中，所述凹槽和多個其它凹槽被限定在所述壁的表面中，從而由於流體流動通過所述多個其它凹槽而在流體中形成相應的微渦旋(microvortices)。在一些實施方案中，使流體流動通過凹槽包括使流體流動通過包括頂部和兩個端部的凹槽，每個端部與所述頂部相連，所述凹槽被定向成使流體朝向所述頂部而流動通過所述端部。在一些情況下，所述頂部和所述兩個端部被限定在呈V形的表面中。所述凹槽的尺寸可以是3 μ m至70 μ m。 在一些實施方案中，使流體流動包括使流體以2. 4cm/min至6. Ocm/min的平均流
速流動。在一些實施方案中，所述粒子為癌細胞且所述吸附物為用於與所述癌細胞結合的抗體。在一些情況下，方法還包括對所捕獲的癌細胞進行培養。在一些實施方案中，由於流體流動通過凹槽而在流體中形成微渦旋。在一些實施方案中，所述吸附物是抗體。在一些實施方案中，所述吸附物為適體(aptamer)。在一些實施方案中，所述入口被配置為接收包含分析物的流體。在一些實施方案中，所述頂部和所述兩個端部形成V形。在一些實施方案中，所述凹槽的跨度小於所述微通道的寬度。在一些實施方案中，所述兩個端部各自與所述頂部等距離。在一些實施方案中，使所述凹槽對稱地形成在所述壁的表面中，從而使所述頂部位於通過微通道中心的軸線上且所述兩個端部被設置成與所述頂部等距離。在一些實施方案中，所述兩個端部中的一個被設置成比所述兩個端部中的另一個距所述頂部近。在一些實施方案中，所述頂部偏離沿微通道中心延伸的軸線。在一些實施方案中，所述凹槽被設置成使所述凹槽的一個端部在另一個端部前接收流體。在一些實施方案中，所述凹槽為限定在所述微通道的壁中的多個凹槽中的一個， 所述多個凹槽中的每個具有頂部和兩個端部。在一些實施方案中，所述多個凹槽被設置成凹槽列。在一些實施方案中，所述裝置還包括形成在所述凹槽列附近的其它凹槽列。在一些實施方案中，所述凹槽列中的凹槽的頂部和兩個端部在相應的平面上與所述其它凹槽列中的凹槽的頂部和兩個端部對齊，所述相應的平面垂直於通過所述微通道的軸線。在一些實施方案中，所述其它凹槽列偏離所述凹槽列。在一些實施方案中，凹槽由微通道向外突出的尺寸為3μπι至70μπι。可具體實施本申請描述的主題以實現一個或多個以下優點。本申請描述的技術可提高無源操作的潛力和促進在微流體環境中捕獲懸浮於流體中的粒子例如懸浮於緩衝液中的細胞。形成在微流體裝置的微通道中的凹槽可引起螺旋形流動，所述螺旋形流動在流動通過通道的流體中形成微渦旋。所述微渦旋可用於增加軸向流動通過通道的粒子朝向通道壁的橫向移動，這使粒子更頻繁地與壁相互作用和與壁結合。與包含不具有凹槽的微通道的微流體裝置相比，當懸浮於緩衝液中的細胞流動通過具有凹槽的微通道時，細胞-基板相互作用可得以增加。這接下來可提高裝置的捕獲效率。另外，本申請描述的無源微流體流體操作技術可取消對外部能量來源的需要，因此可降低能量消耗和製造成本，特別是當將微流體裝置放大到高度平行的μ TAS或LOC系統或這兩者時。所述裝置可以是透明的， 這取決於對製造材料的選擇。樣品和試劑的消耗體積由於所述體積所流動通過的尺寸是微米級的而可得以減小。因此，也可降低樣品和試劑的成本。所描述的技術適用於捕獲和培養活細胞。實施本申請一個或多個技術方案的細節請參見附圖和以下描述。本申請其它特徵、方面和優點基於說明書、附圖和權利要求書而將變得顯而易見。


圖1示出了具有凹槽的微流體裝置的實施方案。圖2A-2D示出了在具有平坦的壁的微通道中和在具有形成在壁中的凹槽的另一種微通道中的粒子流動路徑。圖3A-3C示出了示例性凹槽。圖4A-4C示出了形成圖1的微流體裝置的示例性方法。圖5示出了實施例微流體裝置在不同流速時的捕獲效率。圖6示出了對摻雜在全血中的癌細胞的捕獲效率。圖7示出了高通量微流體裝置的實施方案，其具有的列為箭尾形(herringbone) 圖案。圖8示出了對所捕獲的細胞進行培養的微流體裝置的實施方案。圖9A-9C為顯微照片，其示出了所捕獲的細胞在玻璃基板上的生長。圖10示出了對用具有凹槽的微流體裝置捕獲的細胞上的EpCAM表達和對照細胞上的EpCAM表達進行的分析。圖11A-11E示出了使用微流體裝置從前列腺癌患者中捕獲的循環腫瘤細胞。圖12示出了健康供體對照。圖13示出了使用具有凹槽的微流體裝置從患者樣品中捕獲的CTC。圖14A-14D示出了對具有凹槽的微流體裝置中的CTC進行的Wright-Giemsa染色。圖15示出了對具有不同凹槽尺寸的兩種微流體裝置進行的比較。各幅附圖中相同的標號和標記表示相同的元件。
具體實施例方式本申請描述了在具有凹槽的微流體裝置中基於親和性對粒子進行捕獲的方法、裝置和系統。可對形成在微流體裝置中的微通道進行處理以捕獲懸浮於流動通過通道的流體中的粒子。可將所述微流體裝置的粒子捕獲效率定義為在通道中捕獲的粒子數目與流動通過通道的粒子總數的比例。如下所述，使凹槽形成為延伸到微通道的壁中以在流體中形成這樣的流動模式，所述流動模式促進懸浮於流體中的粒子和通道壁的內表面之間的相互作用。所增加的相互作用可增加通道中捕獲的粒子數目，因此尤其提高微流體裝置的粒子捕獲效率。所述效率可通過調整微流體裝置的結構特徵(包括例如裝置基板(substrate) 材料、通道和凹槽尺寸等)來進一步提高及基於粒子類型和粒子懸浮於其中的流體類型通過調整流體流動參數例如流速來進一步提高。圖1示出了使用軟平板印刷技術(soft lithography techniques)製造的所述微流體裝置的實施例。如下所述，粒子在微流體裝置的微通道中如下捕獲在微通道的壁中形成凹槽，在微通道壁的內表面上塗布吸附物，和使懸浮於流體中的粒子流動通過微通道。
圖1示出了具有凹槽135和140的微流體裝置100，所述凹槽135和140延伸到限定裝置100的通道115的壁之一中。在一些實施方案中，微流體裝置包括由壁向外延伸的突起物(例如V形突起物)而非延伸到通道115的壁中的凹槽。在一些實施方案中，微流體裝置100可包括與下基板110結合的上基板105，所述上基板105和下基板110各自可使用合適的材料來製造。例如，上基板105可使用彈性體例如聚二甲基矽氧烷(PDMS)來製造且下基板可使用玻璃、PDMS或其它彈性體來製造。可選擇地或另外，所述基板可使用塑料例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯、環烯烴共聚物(COC)等來製造。通常，就製造上基板和下基板所選擇的材料可易於加工(例如易於蝕刻)，可提供有助於使檢測容易的光學性質(例如可以是光學透明的)，和可以是無毒的，從而不會負面地影響細胞與基板的附著。另外，所述材料優選不顯示自發螢光或顯示有限的自發螢光。另外，所述材料可易於官能化，從而使分析物可附著於基板。另外，所述材料可具有機械強度以使微流體裝置100 具有強度。如下所述，可將上基板105牢固地固定於下基板110，其中在它們之間形成微通道。 在一些實施方案中，微通道115可具有矩形截面，其包括形成在上基板105中的兩個側壁120和125及上壁130。有關相對位置的術語例如「上」和「下」用於方便說明且表示圖中的位置而非所述特徵的必要相對位置。例如，可將所述裝置定向成使凹槽在通道的底表面上或使通道的中心軸線在垂直方向上延伸。可選擇地，微通道115的截面可以是幾種形狀之一，所述形狀包括但不限於三角形、梯形、半月形等。下基板110在與上基板105結合後可形成微通道115的下壁。在一些實施方案中，微通道115包括形成在微通道115的上壁130中的多個凹槽135。可選擇地，凹槽135可形成在任何壁中，和/或可形成在微通道115的多於一個壁中。凹槽135可跨越壁的整個長度，或僅跨越壁的一部分。圖2A-2D示出了粒子懸浮液流動通過具有平坦的壁的微通道和具有形成在壁中的凹槽的另一種微通道。圖2A示出了微流體裝置200，其包括具有矩形截面的微通道205。 微通道205的壁不包括凹槽例如就微流體裝置100所述的那些凹槽，即壁的表面是平坦的。 包含懸浮於流體中的粒子225的粒子懸浮液220流動通過微通道205。相反地，圖2B示出了類似的懸浮液流動通過微流體裝置100。當流體流動通過由於將凹槽135在微通道115中排列成列而形成的箭尾形圖案時，流體路徑中的凹槽135擾亂了流體流動。在一些實施方案中，基於流速和凹槽尺寸(尤其是例如凹槽的大小和凹槽兩臂之間的角度)，由於對流體流動的擾亂而在流體中形成微渦旋。微渦旋的成因是凹槽在橫向於流體流動主要方向(即軸向)的方向上引起流體流動。 在一些實施方案中，雖然沒有形成微渦旋，但凹槽135和140引起足夠的擾亂以改變部分流體的流動路徑，從而增加壁_粒子相互作用。如圖2C所示，當不存在凹槽時，懸浮於流體中的粒子225以基本直線的方式流動通過平坦的微通道205，其中僅在流場邊緣附近(例如與微通道205的壁直接相鄰)的那些粒子225才可能與微通道205的壁相互作用。相反地，如圖2D所示，流動通過箭尾形圖案的粒子225的流動路徑可被流體中的微渦旋所擾亂，這增加了粒子-微通道壁相互作用的次數。所述微渦旋受形成在微流體裝置100的上壁130中的每個凹槽445的結構特徵所影響。圖3示出了凹槽445的示例性尺寸。
圖3A和3B示出了形成在微通道115的上壁130上的凹槽135。如圖3A所示，對稱的凹槽135包括兩個臂，所述臂各自跨越第一端部150和頂部145之間的長度(I1)和跨越第二端部155和頂部145之間的長度(I2)。在所示實施方案中，兩個臂之間的角度α為 90°。在一些實施方案中，兩個臂之間的角度α為10°至170°。圖3Β示出了微通道115， 其包括形成在上表面115中的凹槽135。如圖3Β所示，凹槽的寬度為w，微通道115的側壁 120和125的高度為h。，和形成在上壁115上的凹槽135的高度為hg。在一些實施方案中， I1 和 I2 各自為 250ym-400ym，hg* 3μπι至 70μπι，和 h。為 100 μ m。例如，當 h。為 IOOym 時，hg 為 25 μ m0圖3C示出了不對稱的凹槽140，其包括兩個臂，所述臂各自分別跨越第一端部170 和頂部165之間的長度(I3)和跨越第二端部175和所述頂部之間的長度(I4)。在所示實施方案中，兩個臂之間的角度β為90°且可以是10°至170°。在一些實施方案中，可將凹槽140製造成使I3與I4的比例為0.5。例如，13為Hlym且I4為282μπι。凹槽140的厚度為35μπι。圖15示出了凹槽的高度即hg對粒子捕獲的影響。箭尾形圖案可如下形成形成箭尾形的列，其中將每個凹槽 設置成與另一個凹槽相鄰。另外，列中的所有凹槽可朝向相同方向。在一些實施方案中，各個凹槽之間的距離為 50 μ m。可選擇地，凹槽可按彼此之間的任何距離來設置。列可包括任何數目的凹槽，例如 10個凹槽。箭尾形圖案可進一步包括由入口到出口依次形成的多個凹槽列。在一些實施方案中，兩個相鄰的凹槽列可間隔100 μ m。換言之，可將第二列中的第一個凹槽設置成距第一列中的最後一個凹槽100 μ m。該圖案可在微通道115的入口和出口之間重複。在一些實施方案中，列中的凹槽或凹槽組可在橫向上彼此偏離。例如，如圖2B所示，微流體裝置100中的凹槽列包括頂部設置在通道中心線右邊(朝向下遊)的第一組凹槽和頂部設置在通道中心線左邊的第二組凹槽。相信上述偏離可進一步增加壁-粒子相互作用。圖3A-3C示出的尺寸是示例性的。通常，對凹槽高度的選擇可取決於多種因素，這些因素包括通道尺寸、粒子性質(包括大小、密度等)和粒子懸浮液流速。雖然較深的凹槽提供較大的擾亂，但其它因素可限制凹槽高度。例如，至多達到一定程度的限制，凹槽高度可隨通道高度成比例增加。通道高度及相應的凹槽高度可取決於粒子_微通道115表面接觸面積。通道尺寸的增加可使粒子-微通道115相互作用減少，這是因為可用於粒子進行相互作用的表面接觸面積相對於截面流動面積是降低的。另外，可設置通道高度的下限及相應的凹槽高度的下限以防止阻塞。在一些實施方案中，凹槽高度與通道高度的比例可小於1，例如為0. 1至0. 6。在一些實施方案中，所述比例可等於1(例如凹槽高度可等於通道高度)，或可大於1(例如凹槽高度(例如60 μ m)可大於通道高度(例如50 μ m))。另外， 凹槽的形狀可不同於「V」形，例如為「U」形、「L」形等。微通道115可例如使用軟平板印刷技術來形成在上基板105中。在一些實施方案中，可使負性光刻膠(SU-8，MicroChem, Newton, MA, USA)在矽晶片上以光刻方式形成圖案以得到具有兩層特徵的母版。由此形成的母版可包括SU-8特徵，所述SU-8特徵形成針對微通道115的特徵例如通道截面、通道尺寸等的基礎。母版上SU-8特徵的高度 (3 μ m-100 μ m)可用表面面形測定器(surface profilometer)[例如 Dektak ST System Profilometer(Veeco Instrumentslnc. , Plainview NY)]測量。然後，所述母版可用作模具，可將PDMS預聚物傾到在所述模具上且使PDMS預聚物在65°C的常規烘箱中固化24小時。當所傾到的PDMS預聚物固化時，形成包括微通道115的上基板105。可從模具中取出固化的上基板110，且例如通過氧等離子體處理來與下基板105結合以形成微流體裝置 100。可選擇地，可使用其它類型的結合，例如使用雙面密封劑、在壓力下進行物理夾緊和保持等。在一些實施方案中，基板可通過化學鍵而牢固地結合在一起，然後可通過在施加機械力下使所述鍵斷裂而分開。圖4A-4C示出了微流體裝置100的形成，所述微流體裝置100包括使用PDMS製造的上基板405和使用玻璃製造的下基板410。包括微通道415的上壁和側壁的上基板405 可使用先前描述的技術來形成。可選擇地或另外，上壁可包括多個凹槽440，每個所述凹槽形成為不對稱的「V」形。在一些實施方案中，對稱的凹槽440和不對稱的凹槽445可散布在箭尾形圖案中。每個凹槽進一步包括頂部445和兩個端部450和455。另外，微通道415 包括兩個側壁420和425。為了構建用於捕獲所需生物分析物的微流體裝置400，將吸附物460設置在微通道115的內表面上。具體地，對內表面進行表面修飾。在一些實施方案中，如圖4B所示，可將吸附物460混合在溶液中且流動通過微通道415。當所述溶液流動通過微通道415時，吸附物460與通道415的內表面結合且由此設置在通道415的內表面中。除使吸附物流動通過微通道115外，還可使用其它技術來設置吸附物。例如，在使用塑料基板的實施方案中，吸附物可在使上基板和下基板結合前例如如下設置在基板上 進行紫外(UV)照射處理以改變表面性質，從而使分析物與發生改變的表面結合。在下基板為玻璃的實施方案中，玻璃可在使玻璃基板與上基板結合前例如通過濺射、氣相沉積、堆積納米粒子單層等來進行官能化。

如圖4C所示，可將吸附物460設置在微通道415的全部內表面上。可選擇地，可將吸附物460設置在微通道415的一個或多個壁中，例如設置在凹槽445形成在其中的壁中。在一些實施方案中，可將吸附物460僅設置在由玻璃製造的下基板410上。在上述實施方案中，可在將吸附物設置在下基板上後使下基板410與上基板405結合。在上述實施方案中，對流體的流速進行選擇，從而使因凹槽410而形成的微渦旋朝向下基板410驅動流體中的細胞，這增加了細胞_下基板410相互作用的次數。然後，可使下基板410與上基板 405分開且可對所捕獲的細胞進行培養。在一些實施方案中，可對吸附物460進行選擇，從而使微通道415可用於通過溼化學技術(wet chemistry techniques)基於親和性對細胞進行捕獲。在上述實施方案中，吸附物460可以是抗體(例如針對EpCAM的抗體)或適體(例如針對表面蛋白的適體)，微通道415的內表面用所述抗體或適體進行官能化。吸附物460的其它實例包括用抗生物素蛋白塗布的表面以通過生物素-抗生物素蛋白連接來捕獲擴增的表達生物素的靶標細胞。與可被捕獲的細胞相應的吸附物的其它實例示於下表1中。
表 權利要求
1.用於捕獲懸浮於流動通過微通道的流體中的粒子的方法，所述方法包括 使包含待捕獲的粒子的流體流動通過微通道且經過由微通道的壁表面限定的凹槽； 使至少一些所述粒子與設置在微通道的一個或多個壁上的吸附物接觸；知捕獲至少一些與吸附物接觸的粒子。
2.權利要求1的方法，其中所述吸附物被設置在凹槽被限定在其中的壁的表面上。
3.權利要求1的方法，其中所述凹槽被限定在所述微通道的壁中。
4.權利要求3的方法，其中所述凹槽延伸到所述壁中。
5.權利要求1的方法，其中所述凹槽和多個其它凹槽被限定在所述壁的表面中，從而由於流體流動通過所述多個其它凹槽而在流體中形成相應的微渦旋。
6.權利要求1的方法，其中使流體流動通過凹槽包括使流體流動通過包括頂部和兩個端部的凹槽，每個端部與所述頂部相連，所述凹槽被定向成使流體朝向所述頂部而流動通過所述端部。
7.權利要求6的方法，其中所述頂部和所述兩個端部被限定在呈V形的表面中。
8.權利要求7的方法，其中所述凹槽的尺寸為3μπι至70μπι。
9.權利要求1的方法，其中使流體流動包括使流體以2.4cm/min至6. Ocm/min的平均流速流動。
10.權利要求1的方法，其中所述粒子為癌細胞且所述吸附物為用於與所述癌細胞結合的抗體。
11.權利要求10的方法，所述方法還包括對所捕獲的癌細胞進行培養。
12.權利要求1的方法，其中由於流體流動通過凹槽而在流體中形成微渦旋。
13.一種微流體裝置，其包括 微通道，所述微通道包括 入口，位置距所述入口一定距離的出口，其中流體由入口流向出口，和限定到微通道的壁表面中的凹槽，所述凹槽包括頂部和兩個端部，每個端部與所述頂部相連，所述凹槽被定向成使流體朝向所述頂部而流動通過所述端部；和塗布於至少一個壁的用於選擇性附著所需分析物的吸附物。
14.權利要求13的裝置，其中限定在壁表面中的凹槽由微通道向外突出。
15.權利要求13的裝置，其中所述吸附物為抗體。
16.權利要求13的裝置，其中所述吸附物為適體。
17.權利要求13的裝置，其中所述入口被配置為接收包含分析物的流體。
18.權利要求13的裝置，其中所述頂部和所述兩個端部形成V形。
19.權利要求13的裝置，其中所述凹槽的跨度小於所述微通道的寬度。
20.權利要求13的裝置，其中所述兩個端部各自與所述頂部等距離。
21.權利要求13的裝置，其中使所述凹槽對稱地形成在所述壁的表面中，從而使所述頂部位於通過微通道中心的軸線上且所述兩個端部被設置成與所述頂部等距離。
22.權利要求13的裝置，其中所述兩個端部中的一個被設置成比所述兩個端部中的另一個距所述頂部近。
23.權利要求13的裝置，其中所述頂部偏離沿微通道中心延伸的軸線。
24.權利要求13的裝置，其中所述凹槽被設置成使所述凹槽的一個端部在另一個端部前接收流體。
25.權利要求13的裝置，其中所述凹槽為限定在所述微通道的壁中的多個凹槽中的一個，所述多個凹槽中的每個具有頂部和兩個端部。
26.權利要求25的裝置，其中所述多個凹槽被設置成凹槽列。
27.權利要求26的裝置，所述裝置還包括形成在所述凹槽列附近的其它凹槽列。
28.權利要求27的裝置，其中所述凹槽列中的凹槽的頂部和兩個端部在相應的平面上與所述其它凹槽列中的凹槽的頂部和兩個端部對齊，所述相應的平面垂直於通過所述微通道的軸線。
29.權利要求27的裝置，其中所述其它凹槽列偏離所述凹槽列。
30.權利要求13的裝置，其中凹槽由微通道向外突出的尺寸為3μ m至70 μ m。
全文摘要
用於捕獲懸浮於流動通過微通道的流體中的粒子的方法和系統可包括使包含待捕獲的粒子的流體流動通過微通道且經過由微通道的壁表面限定的凹槽，從而由於流體流動通過凹槽而在流體中形成微渦旋；在流體中形成微渦旋後，使至少一些所述粒子與設置在微通道的一個或多個壁上的吸附物接觸；和捕獲至少一些與吸附物接觸的粒子。
文檔編號G01N33/53GK102227637SQ200980147313
公開日2011年10月26日 申請日期2009年9月25日 優先權日2008年9月26日
發明者梅梅特.託納, 許佳賢, 香農.斯託特 申請人:通用醫療公司