脫細胞纖維環基質的製備方法

2023-06-02 02:53:56

專利名稱：脫細胞纖維環基質的製備方法
技術領域：
本發明涉及動物細胞或組織領域，具體是一種脫細胞纖維環基質的製備方法。
背景技術：
椎間盤退變是一類常見病，嚴重影響人們的生活，也是骨科治療難題之一。組織工程技術的出現為椎間盤疾病的治療提供了新的思路和方法，有望為椎間盤修復或置換提供永久替代產品，其中，纖維環的再生修復是椎間盤組織工程首先要解決的問題，只有纖維環得到修復才能讓髓核組織保持在椎間隙，進而對退變髓核實施下一步治療。近年來，用於構建組織工程纖維環的支架材料研究較多。如取向性電紡絲納米支架，雖然結構規則、孔隙均勻，但成分與天然纖維環相差很大，生物相容性差；取向性藻酸鹽 /殼聚糖複合支架，其力學性能與天然纖維環相差甚遠；聚已酸內酯蘋果酸三醇/脫鈣骨基質明膠雙相纖維環支架，雙相支架的內外層結合不牢、容易脫落，且生物相容性差；國內潘勇等用脫礦脫細胞骨基質環作為纖維環支架，細胞相容性好，但其可塑性差，結構與天然纖維環的斜交疊層複雜結構相差甚遠。綜上，纖維環細胞外基質(ECM)生化成分與結構複雜，呈斜交疊層排列，而目前國內外無論人工合成還是天然仿生材料，很難真正模仿椎間盤複雜的天然結構、組成成分及生物力學特性。近年，脫細胞基質引起了國內外學者的廣泛關注，脫細胞基質去除了細胞和可溶性蛋白等引起免疫反應的物質，保留了組織的天然成分和複雜結構，具有與體內組織相近的力學性能，因此，脫細胞基質是一種理想的支架載體，已得到廣泛應用，並且異體脫細胞真皮基質、豬脫細胞心瓣膜、豬脫細胞膀胱已被批准應用於臨床。目前尚無用脫細胞纖維環基質作為纖維環支架的報導。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中，組織工程纖維環支架在材料成分、結構、力學性能的不足，而提供一種與天然纖維環十分接近的脫細胞纖維環基質的製備方法。一種脫細胞纖維環基質的製備方法，是按以下步驟進行的
(1)取健康成年豬的脊柱纖維環，無菌生理鹽水充分漂洗；
(2)濃度為IOmM含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris緩衝液中4°C振湯 48 h ；
(3)濃度為IOmM含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris緩衝液中，加入I 5%的TritonX-1OO後，室溫振蕩12 96 h ；
(4)放入含O.05 O. 5 mg/ml脫氧核糖核酸酶、5 50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris緩衝液，37°C振蕩12 36 h ；
(5)無菌生理鹽水振蕩清洗24h，放在無菌PBS緩衝液中4°C保存。所述的健康成年豬為6 7月齡，雌雄不限。所述的脊柱纖維環是外徑為5 20 mm,厚度為2 7 mm的尾椎纖維環。
所述的振蕩頻率均為80 250 r/min。本發明的主要優點如下
①本發明所採用的纖維環材料屬於天然生物材料，具有良好的生物相容性和可降解性，且材料來源廣泛，可批量生產。②通過脫細胞系列處理去處抗原成分，避免發生免疫排斥反應、傳播疾病。③本發明的組成成分、結構、力學性能都與天然纖維環十分接近，為種子細胞提供一個與體內纖維環十分接近的生長環境。


圖1是正常纖維環HE染色 圖2是脫細胞纖維環基質HE染色 圖3是正常纖維環Hochest33258染色 圖4是脫細胞纖維環基質Hochest33258染色 圖5是正常纖維環甲苯胺藍染色 圖6是脫細胞纖維環基質甲苯胺藍染色 圖7是正常纖維環I型膠原免疫螢光 圖8是脫細胞纖維環基質I型膠原免疫螢光 圖9是正常纖維環掃描電鏡圖； 圖10是脫細胞纖維環基質掃描電鏡圖。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細描述。1、脫細胞纖維環基質的製備方法
(1)取材取6 7月齡(雌雄不限)健康成年豬的尾椎間盤，無菌生理鹽水衝洗乾淨，去除中央髓核及外周肌肉組織，選取直徑及厚度相近的尾椎纖維環，外徑9 11 _，平均10 mm ;厚度4. 5 5. 5 mm,平均5 mm,用無菌生理鹽水充分漂洗；
(2)脫細胞處理將上述處理後的纖維環組織放入IOmM含O.1% EDTAUO KIU/ml抑肽酶的Tris緩衝液中，4°C 150r/min振蕩48 h進行低滲處理，去離子水衝洗乾淨；用含3%TritonX-1OO 的 Tris 緩衝液(含 O. 1% EDTAUO KIU/ml 抑肽酶)室溫 150r/min 振蕩 72 h,每24 h換液一次,去離子水衝洗乾淨；用含O. 2 mg/ml脫氧核糖核酸酶(DNase I ) >20 ug/ml核糖核酸酶A (RNase A)的Tris緩衝液37°C 150r/min振蕩24 h,去離子水衝洗乾淨；
(3)清洗用無菌生理鹽水150r/min振蕩24h進行清洗，清洗完後將脫細胞纖維環基質放在PH 7. 30無菌PBS緩衝液中保存。經上述處理的脊柱纖維環不含纖維環外周肌肉組織及纖維環/髓核交界區。本發明採用性質比較溫和的去垢劑Triton X 一 100對天然纖維環進行脫細胞處理，去除了天然纖維環的細胞成分，但沒有改變纖維環組織的組成、結構及力學性能。2、正常纖維環及脫細胞纖維環基質的組織學及電鏡觀察
HE染色放大100倍可見大量細胞均勻的分布在正常纖維環基質中，脫細胞纖維環基質中無細胞及細胞碎屑殘留(見圖1、2)。Hochest33258染色放大100倍可見正常纖維環中細胞呈點狀螢光，脫細胞纖維環基質呈陰性(見圖3、4)。甲苯胺藍染色放大100倍正常纖維環及脫細胞纖維環基質均呈藍色(見圖5、6)。I型膠原免疫螢光放大100倍正常纖維環及脫細胞纖維環基質均為陽性，呈紅色螢光(見圖7、8)。掃面電鏡可見正常纖維環放大200倍及脫細胞纖維環基質放大80倍均排列有序，微觀結構無差別(見圖9、10)。3、正常纖維環及脫細胞纖維環基質的生化成分分析
膠原及氨基葡聚糖(GAG)是纖維環的主要組成成分，經測定脫細胞纖維環基質的膠原含量為(150. 83 ±2. 43) ug/mg,與正常纖維環的膠原含量(143. 99 ±4. 86) ug/mg相比無統計學意義；脫細胞纖維環基質的GAG含量分別為(41. 07 ±2.54)ug/mg，稍低於正常纖維環的 GAG 含量(54. 01 土 2.84)%。4、正常纖維環脫及細胞纖維環基質的生物力學測定
經測定脫細胞纖維環基質的極限載荷為(24. 52±3. 83) N,極限應力為(6. 02±0. 83)MPa,極限應變為(O. 41 ±O. 05) %，韌度為(15. 58±1. 62) N/mm,彈性模量為(28. 89±5. 50)MPa,斷裂功耗為(30. 85±5· 15) X 10_3J ;與對照組的極限載荷(22. 98±2· 10) N,極限應力(5. 86土L 13) MPa,極限應變(O. 34±0· 05)%，韌度(17·00±2· 89) N/mm,彈性模量(30. 71 ±5. 47)MPa，斷裂功耗(29. 62 ±5. 26) X 10_3J相比均無統計學差異。
權利要求
1.一種脫細胞纖維環基質的製備方法，其是按以下步驟進行的 (1)取健康成年豬的脊柱纖維環，無菌生理鹽水充分漂洗； (2)在濃度為IOmM,含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris緩衝液中4°C振蕩48 h ； (3)在濃度為10mM，含O.05 O. 5% EDTA、5 50 KIU/ml抑肽酶的Tris緩衝液中，力口入I 5%的TritonX-1OO後，室溫振蕩12 96 h ； (4)放入含O.05 O. 5 mg/ml脫氧核糖核酸酶、5 50 ug/ml核糖核酸酶A的Tris緩衝液，37°C振蕩12 36 h ； (5)無菌生理鹽水振蕩清洗24h，放在無菌PBS緩衝液中4°C保存。
2.按照權利要求1所述的脫細胞纖維環基質的製備方法，其特徵在於所述的健康成年豬為6 7月齡，雌雄不限。
3.按照權利要求1所述脫細胞纖維環基質的製備方法，其特徵在於所述的脊柱纖維環是外徑為5 20 mm，厚度為2 7 mm的尾椎纖維環。
4.按照權利要求1所述的脫細胞纖維環基質的製備方法，其特徵在於所述振蕩頻率均為 80 250 r/mirio
全文摘要
本發明公開了一種脫細胞纖維環基質的製備方法，屬於動物細胞或組織領域。本發明是取健康成年豬的脊柱纖維環，經無菌生理鹽水充分漂洗；放入濃度為10mM，含0.05～0.5%EDTA、5～50KIU/ml抑肽酶的Tris緩衝液中4℃振蕩；再放入含1～5%TritonX-100的上述Tris緩衝液，室溫振蕩；放入含0.05～0.5mg/ml脫氧核糖核酸酶、5～50ug/ml核糖核酸酶A的Tris緩衝液中，振蕩；最後，無菌生理鹽水振蕩清洗，放在無菌PBS緩衝液中4℃保存。本發明的製備過程簡單，細胞去除徹底，結構保留完整，基質含量及力學性能與天然纖維環相近，是一種良好的組織工程纖維環支架材料。
文檔編號A61L27/36GK103007352SQ20131002097
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月21日 優先權日2013年1月21日
發明者徐寶山, 楊強, 許海委, 馬信龍, 李秀蘭, 夏群, 張春秋 申請人:天津市天津醫院