口腔內乙醛降低劑的製作方法

2023-06-01 11:21:46

專利名稱：口腔內乙醛降低劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種口腔內乙醛降低劑。詳細而言，涉及利用乙醛分解酶來降低口腔內的乙醛的製劑及其用途。本申請主張基於2010年6月19日申請的日本特許申請第 2010-140026號的優先權，通過參照援引該專利申請的全部內容。
背景技術：
就唾液中的乙醛而言，不僅已報告成為口臭的原因，而且近年來還報告會提高上消化道器官癌等的疾病風險。唾液中的乙醛的由來各種各樣，但是作為代表性的乙醛而言的如下乙醛近年來尤其被視為問題，即，因飲酒時的醇代謝而產生的乙醛、因吸菸而產生的乙醛、或來自口中的牙周病菌的乙醛。
其中，飲酒時，在乙醇分解過程中作為代謝產物的乙醛被蓄積在唾液中，成為食道癌和胃癌的風險因素。已報告尤其對於喝酒面紅者(乙醛脫氫酶基因為AG型和GG型的人) 而言，由於飲酒而導致唾液中的乙醒濃度上升至將近100 μ M。
還已知由於吸菸而導致增加唾液中的乙醛濃度增加。認為菸草的煙霧中所含的乙醛是其一個原因(香菸煙霧的過濾(大谷吉生著)，吸菸科學研究的發展歷程1996年 2005年，三須良實、上裡一郎、大和田英美、中尾一和、井谷舜郎編，吸菸科學研究財團，2007 年)。
據東京大學的研究組所報告，如果喝酒面紅者I天飲用I瓶以上的罐裝啤酒且吸菸，則與不是喝酒面紅者且既不飲酒也不吸菸的人相比，形成食道癌的風險最大提高 190 倍之多(Cui R、Kamatani Y, et. al. Functional variants in ADHlB and ALDH2 coupled with alcohol andsmoking synergistically enhance esophageal cancer risk. Gastroenterology 137:1768-1775 (2009))。
在流行病學的調查中已經明確在口腔的細菌中存在合成乙醛的細菌，來自該細菌的乙醛成為口臭，食道、胃等上消化道器官癌的風險因素(平成21年度在日本癌(cancer) 學會中發表)。根據愛知縣癌中心研究所(名古屋市)進行的以約3800人為對象的流行病學調查的結果，I天刷牙2次以上的人形成口腔癌、食道癌的危險性比I天刷牙I次的人低3 成。認為這是由於利用牙膏可衝洗掉口腔中產生乙醛的細菌或所產生的乙醛。
然而,作為除去唾液、食品中的乙醛的方法,有使用L-半胱氨酸(非專利文獻I)、 來自微生物的乙醛氧化酶的方法(專利文獻I)。前者是利用了 L-半胱氨酸與乙醛鍵合的性質的方法。但是，該反應是可逆反應，有乙醛再次游離的可能性。另外，因L-半胱氨酸本身具有特有的氣味，所以難以應用於口腔護理產品。另一方面，雖然來自微生物的乙醛氧化酶有不要求輔酶這樣的優點，但存在伴隨著該反應會產生有害的過氧化氫這樣的問題。另外，上述報告中的來自微生物的乙醛氧化酶在酸性條件下顯示活性(PH3. 5附近)，而在生理條件下的反應性不明。進而，該酶的反應性只不過僅對較高濃度(mM級)的底物得到確認而已。唾液中所含的乙醛濃度通常為μ M級，由於酶反應對Km以下的濃度的底物反應性降低，所以期望開發對低濃度底物具有充分活性的酶。應予說明，有報告稱來自葡糖桿菌(Gluconobacter)屬微生物的超氧化物歧化酶顯示出乙醒分解活性(專利文獻2)。
專利文獻
專利文獻I :日本特開2010-57482號公報
專利文獻2 :日本特開2010-110248號公報
非專利文獻
非專利文獻I :Salaspuro V、Hietala J> Kaihovaara P, et. al. , Int JCancer. 2002Jan 20;97 (3) :361_4。發明內容
如上所述，可判明口腔內(口中)乙醛會引起健康問題的風險，要求開發能夠分解除去該乙醛的口腔護理產品。因此，本發明的課題在於提供一種對降低口腔內乙醛有效果的新型酶劑。
本發明人等為了發現對降低口腔內的乙醛有效果的酶，使用人工唾液進行了深入研究。其結果是，確認醒脫氫酶(AldehydeDehydrogenase)和蘇氨酸醒縮酶(Threonine Aldolase)在低底物濃度下的良好活性，從而完成了如下所述的本發明。
[ I ] 一種口腔內乙醛降低劑，包含醛脫氫酶或蘇氨酸醛縮酶。
[2]如[I]記載的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，醛脫氫酶來自酵母菌屬微生物。
[3]如[2]記載的口腔內乙醛降低劑，酵母菌屬微生物為釀酒酵母。
[4]如[I]記載的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，蘇氨酸醛縮酶來自大腸桿菌。
[5]如[I] [4]中任一項記載的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，對底物濃度 I μ M ImM的乙醒顯示分解活性。
[6]如[I] [4]中任一項記載的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，對底物濃度 I μ M 100 μ M的乙醒顯示分解活性。
[7]—種口腔用組合物，包含[I] [6]中任一項記載的口腔內乙醛降低劑。
[8] 一種方法，通過使[7]所記載的口腔用組合物作用於唾液，從而降低唾液中的乙醛。
[9]如[8]記載的方法，其中，所述方法對降低口腔內的臭氣有效。
[10]如[8]記載的方法，對預防乙醛成為原因或一個原因的癌有效。


圖I是表示在人工唾液中分別添加酶時的乙醛濃度的圖。用Nash法來對各酶的活性進行評價。AD表示醛脫氫酶、TA表示蘇氨酸醛縮酶、BSA表示牛血清白蛋白。
圖2是表示在人工唾液中分別添加酶時的乙醛濃度的經時變化的圖。用GC-MS來對各酶的活性進行評價。AD表示醛脫氫酶、TA表示蘇氨酸醛縮酶、BSA表示牛血清白蛋白。
具體實施方式
在本說明書中，所謂「口腔內乙醛降低劑」是指預定在口腔內應用的、通過該使用能夠降低口腔內(更具體而言是唾液中)的乙醛濃度的酶劑。應予說明，在本說明書中，將術語「 口腔內」和術語「 口中」作為可以交換的術語進行使用。
I.乙醛降低劑
本發明的第I方面涉及口腔內乙醛降低劑(以下，為了便於說明簡稱為「降低劑」)。本發明的降低劑包含醛脫氫酶或蘇氨酸醛縮酶作為有效成分。可以並用這兩種酶。 作為醛脫氫酶，優選使用來自酵母菌屬微生物(例如釀酒酵母)的醛脫氫酶。來自釀酒酵母的醒脫氫酶可以從Sigma Aldrich公司、Roche-Diagnostics公司、Merck公司等得到。 另一方面，作為蘇氨酸醛縮酶，優選使用來自大腸桿菌的蘇氨酸醛縮酶(例如，參照Eur. J.Biochem, 255, 220-226 (1998))。
本發明的降低劑能夠發揮作用的乙醛濃度(底物濃度)沒有特別限定，優選為 ΙμΜ ImM，更優選為IyM ΙΟΟμΜ。應予說明，本發明的降低劑的活性強度(程度)沒有特別限定。
本發明的降低劑除了有效成分(醛脫氫酶或蘇氨酸醛縮酶)之外，還可以含有賦型劑、緩衝劑、懸浮劑、穩定劑、PH調節劑、保存劑、防腐劑、香料、增稠劑、油脂、上光劑、粘合劑、粘合增強劑、乳化穩定劑、生理鹽水等。作為賦型劑，可以使用澱粉、糊精、麥芽糖、海藻糖、乳糖、D-葡萄糖、山梨糖醇、D-甘露糖醇、白糖、甘油等。作為緩衝劑，可以使用磷酸鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽等。作為穩定劑，可以使用丙二醇、抗壞血酸等。作為PH調節劑，可以使用衣康酸、琥珀酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸、己二酸、葡糖酸、焦磷酸、乙酸、乳酸、α -酮戊二酸、植酸等有機酸或有機酸鹽；碳酸等無機酸或無機酸鹽；天門冬氨酸、穀氨酸等酸性胺基酸；精氨酸、賴氨酸、組氨酸等鹼性胺基酸等。作為保存劑，可以使用苯酚、苯扎氯銨、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯等。作為防腐劑，可以使用乙醇、苯扎氯銨、對羥基苯甲酸、氯丁醇等。作為香料，可以使用麝香、靈貓香、海狸香、龍涎香等動物性香料；茴香精油、當歸精油、依蘭精油、鳶尾花精油、小茴香精油、甜橙精油、卡南加精油、香芹精油、 豆蘧精油、愈創木精油、孜然精油、釣樟精油、桂皮精油、肉桂精油、老鶴草精油、古巴香脂精油、芫荽精油、紫蘇精油、雪松精油、香茅精油、茉莉精油、姜草精油、杉樹精油、留蘭香精油、 西洋薄荷精油、八角茴香精油、晚香玉精油、丁香精油、橙花精油、冬青精油、妥盧香脂精油、 廣藿香精油、玫瑰精油、玫瑰草精油、絲柏精油、羅漢柏精油、檀香精油、苦橙葉精油、月桂精油、巖蘭草精油、香檸檬精油、秘魯香脂精油、薔薇木精油、伽羅木精油、柑橘精油、桉樹精油、萊姆精油、薰衣草精油、芳樟醇精油、檸檬草精油、檸檬精油、迷迭香精油、日本薄荷精油等植物性香料；其它合成香料等。作為增稠劑，可以使用天然高分子或澱粉系或者纖維素系天然高分子衍生物等。作為天然高分子，例如，可舉出褐藻糖膠、卡拉膠等海藻提取物、瓜爾膠等種子粘出物、阿拉伯樹膠等樹脂狀膠粘物、或黃原膠等微生物產生的膠粘物質等。作為澱粉系或纖維素系天然高分子衍生物，例如，可舉出磷酸澱粉等澱粉系或甲基纖維素等纖維素系的天然高分子衍生物。作為油脂，例如，可以使用鱷梨油、亞麻子油、杏仁油、小茴香油、紫蘇油、橄欖油、甜橙油、羅非魚油、可可脂、洋甘菊油、胡蘿蔔油、黃瓜油、椰子油、芝麻油、米糠油、紅花油、乳木果脂、液態乳木果脂、大豆油、山茶油、玉米油、菜籽油、桃仁油、 蓖麻油、葵花籽油、葡萄籽油、棉籽油、花生油、鱉油、貂油、蛋黃油、棕櫚油、棕櫚仁油、日本蠟、椰油、牛油、豬油等。另外，也可以利用對這些油脂進行加氫、分級、酯交換等處理來改性而成的油脂。作為上光劑，可以使用蜂蠟、巴西棕櫚蠟、鯨蠟、羊毛脂、液態羊毛脂、還原羊毛脂、硬質羊毛脂、小燭樹蠟、褐煤蠟、紫膠蠟、米糠蠟、角鯊烯、角鯊烷、姥鮫烷等蠟類(植物性、動物性均可);液體石蠟、凡士林、石蠟、地蠟、純地蠟、微晶蠟等礦物油。作為粘合劑，可以使用大豆蛋白質、卵蛋白、乳蛋白、血蛋白、酪蛋白、澱粉、轉穀氨醯胺酶等。作為粘合增強劑，可以使用聚磷酸鹽等。作為乳化穩定劑，可以使用酪蛋白鈉等。
在一個方式中，本發明的降低劑由產生本發明的酶(醛脫氫酶或蘇氨酸醛縮酶)的微生物的菌體破碎物構成。即，該方式的降低劑包含規定的微生物的菌體破碎物。可以將菌體破碎液(通常可利用由微生物的培養、集菌及菌體破碎構成的一系列工序而得到)直接用作菌體破碎物。另一方面，也可以將菌體破碎液提供給進一步的處理(精製處理、冷凍處理、乾燥處理、添加其它成分等)後用作菌體破碎物。
2.降低劑的用途
本發明的第2方面涉及本發明的降低劑的用途。本發明的降低劑即使在低底物濃度下也能夠發揮作用。因此，適於在底物(即乙醛)以低濃度存在的口腔內使用。因此，本發明提供一種含有本發明的降低劑作為有效成分並被用於口腔護理的口腔用組合物。在本說明書中「口腔護理」是指改善口腔內的環境。如果使本發明的口腔用組合物作用於唾液，則能夠降低唾液中的乙醛。通過該「降低乙醛」的效果，可實現口腔內的環境改善，例如，實現臭氣的降低、乙醛成為原因或一個原因的上消化道器官癌(咽癌、喉癌、食道癌、胃癌、十二指腸癌等)的預防。
只要能夠實現作用於唾液這樣的使用方式，口腔用組合物的形式就沒有特別限定。如果例示口腔用組合物的形態，則為口香糖、糖果、營養補充食品(增補劑、營養飲料等)、口腔清潔劑(例如牙膏粉、保溼牙膏、牙膏、液體牙膏)。也可以以包含本發明降低劑的一般食品(穀類、蔬菜、食用肉、各種加工食品、糕點類、牛奶、清涼飲料水、酒精飲料等)、食品添加物的形態來構成本發明的口腔用組合物。另外，也可以提供本發明的口腔用組合物作為用於致癌預防的醫藥品。此時的劑型也沒有特別限定。劑型的例子是片劑、散劑、細粒劑、顆粒劑、糖漿劑。
對於本發明的口腔用組合物而言，為了得到期待的效果而含有必要量的有效成分。本發明的口腔用組合物中的有效成分量可以考慮口腔用組合物的形態·形狀、應用對象、使用頻率等進行適當設定。例如，以給予(應用)所希望的量的有效成分的方式，將有效成分量設為例如約O. I重量％ 約95重量％的範圍內。
通常，除了作為有效成分的降低劑之外，還可以根據其形態而包含各種成分。例如，使用作為代表性形態的牙膏時，可以包含粘稠劑(保溼劑)、粘結劑、表面活性劑、甜味劑、香料、防腐劑、研磨劑、PH調節劑、螯合劑、氟化物、酶等，可以根據需要而適當地選擇它們。作為粘稠劑，可舉出山梨醇、甘油、乙二醇、丙二醇、1，3-丁二醇、聚乙二醇、聚丙二醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇等。作為粘結劑，可舉出羧甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥甲基纖維素、羧甲基羥甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮等合成粘結劑，黃原膠、卡拉膠、藻酸等天然系粘結劑，娃膠、招娃膠、娃酸招鎂(Veegum)、娃酸鎂鋰 (Laponite)等無機粘結劑。作為表面活性劑，可以使用陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、非離子性表面活性劑以及兩性離子表面活性劑中的任一種。作為陰離子表面活性劑， 可舉出十二烷基硫酸鈉，N-月桂醯肌氨酸鈉，十二烷基苯磺酸鈉，α-磺基脂肪酸烷基酯鈉，十四烷基硫酸鈉，N-肉豆蘧醯肌氨酸鈉，氫化椰油脂肪酸單甘酯單硫酸鈉，月桂醇磺基乙酸酯鈉，α -烯烴磺酸鈉，N-月桂醯穀氨酸鈉、N-棕櫚醯穀氨酸鈉等N-醯基穀氨酸鹽、 N-甲基-N-醯基牛磺酸鈉等N-醯基牛磺酸鹽等。作為非離子表面活性劑，可舉出蔗糖脂肪酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油等聚氧乙烯脂肪酸酯，聚甘油脂肪酸酯，烷基糖苷類，山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐單硬脂酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，烷基二甲基氧化胺，麥芽糖醇脂肪酸酯、乳醇脂肪酸酯等糖醇脂肪酸酯，烷基醇醯胺、十二烷基酸單或二乙醇醯胺等脂肪酸乙醇醯胺，聚氧乙烯高級醇醚，聚氧乙烯聚氧丙烯共聚物，聚氧乙烯聚氧丙烯脂肪酸酯，或者普朗尼克等。另外，作為兩性離子表面活性劑，可舉出烷基二甲基氨基乙酸甜菜鹼、脂肪酸醯胺丙基二甲基氨基乙酸甜菜鹼等乙酸甜菜鹼型，N-脂肪酸醯基-N-羧甲基-N-羥乙基乙二胺鹽等咪唑啉型，2-烷基-N-羧甲基-N-羥乙基咪唑啉甜菜鹼，N-十二烷基二氨基乙基甘氨酸、N-十四烷基二氨基乙基甘氨酸等N-烷基二氨基乙基甘氨酸，或者N-烷基-I-羥乙基咪唑啉甜菜鹼鈉等。作為甜味劑，可舉出糖精鈉、甜菊苷、 新橙皮苷二氫查耳酮、甘草甜素、紫蘇葶、索馬甜、天冬氨醯苯丙氨酸甲酯、對甲氧基肉桂醛 (p-methoxylcinnamic aldehyde)、鹿糖、果糖、環己胺基磺酸鈉、甜菊提取物、沙馬汀等。作為香料，可舉出留蘭香油、薄荷油、冬綠油、黃樟油、丁香油、桉樹油、鼠尾草油、牛至油、百裡香油、檸檬油、甜橙油、迷迭香油、桂皮油、多香果油、桂葉油、紫蘇油、冬青油、I-薄荷醇、香芹酮、茴香腦、水楊酸 甲酯、丁香酚、檸檬烯、正癸醇、香茅醇、α-松油醇、香茅醇乙酸酯、桉樹腦、芳樟醇、乙基芳樟醇、香草醛或百裡酚等。作為研磨劑，可以使用結晶二氧化矽、無定形二氧化矽、其它二氧化矽系研磨劑、矽鋁酸鹽、氧化鋁、氫氧化鋁、不溶性偏磷酸鈉、不溶性偏磷酸鉀、二氧化鈦、磷酸氫鈣二水合物、重質碳酸鈣、輕質碳酸鈣等無機原材料，除此之外，還可以使用聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯等聚烯烴系樹脂，聚氯乙烯、聚偏氯乙烯等含滷素系樹脂，甲基丙烯酸樹脂等丙烯酸系樹脂，聚乙酸乙烯酯或其皂化物的縮甲醛樹脂、尼龍等聚醯胺樹脂，苯乙烯樹脂，EVA樹脂，矽酮樹脂，天然橡膠，聚異戊二烯橡膠，矽橡膠，纖維素等樹脂。作為pH調節劑，可以使用衣康酸、琥珀酸、酒石酸、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸、己二酸、 葡萄糖酸、焦磷酸、乙酸、乳酸、α-酮戊二酸、植酸等有機酸或有機酸鹽；碳酸等無機酸或無機酸鹽；天門冬氨酸、穀氨酸等酸性胺基酸；精氨酸、賴氨酸、組氨酸等鹼性胺基酸等。作為螯合劑，可以使用焦磷酸鈉、三聚磷酸鈉、EDTA等。作為殺菌劑，可以使用三氯生、十六烷基氯化吡啶偷、苯扎氯銨、苄索氯銨等。作為酶，可並用葡聚糖酶、澱粉酶、蛋白酶、變聚糖酶、溶菌酶、溶解酶、分解酶(Lytic enzyme)等來使用。作為氟化物，可舉出氟化鈉、氟化亞錫等。除此之外，還可以含有氯己定鹽類、羥基膽固醇、甘草次酸鹽類、甘草次酸、綠藻類 (Chlorophycae )、海狗提取物(caropeptide)、維生素類、甘菊環、氯化溶菌酶、防牙石劑、防牙垢劑、硝酸鉀等有效成分或藥效成分。應予說明，配合量可適當使用。
本發明的口腔用組合物被應用的對象沒有特別限定。作為此處的對象，除了人之外，還可舉出人以外的哺乳動物(包括寵物動物、家畜、實驗動物。具體而言，例如，可舉出猴、小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠、猴、牛、豬、山羊、綿羊、馬、雞、羊、鯨、海豚、狗、貓等)。
本發明的口腔用組合物的一個方式還含有本發明的降低劑中使用的酶以外的乙醛分解酶作為有效成分之一。即，在該方式中，將其加入到醛脫氫酶或蘇氨酸醛縮酶中，使用其它乙醛分解酶，使其發揮相加效果或協同效果。作為此處的「其它乙醒分解酶」，可舉出苯甲醯甲酸脫羧酶(benzoylformate decarboxylase)、鼠李樹膠糖-I-磷酸醒縮酶(rhamnulose-l-phosphate aldolase)、脫氧核糖磷酸醒縮酶 (deoxyribose-phosphate aldolase)、丁醒脫氫酶(butanaldehydrogenase)、羧酸還原 S|(carboxylate reductase),扁桃臆裂解酶(mandelonitrile lyase)、l, 5_ 脫水-D-果糖還原酶(1，5-anhydro-D-fructose reductase)、3-甲基丁醒還原酶(3-methylbutanal reductase)、卩引哚 _3_ 乙醒還原酶(indole-3-acetaldehyde reductase)、葡萄糖酸 2-脫氫酶(gluconate2_dehydrogenase)、甘油脫氣酶(glycerol dehydrogenase)、 乙醒酸還原酶(glyoxylate reductase)，擬基還原酶(carbonyl reductase)、芳基醇還原酶(aryl-alcohol reductase)、甲基乙二醒還原酶(methylglyoxalreductase)、 乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase)、醒還原酶(aldehydereductase)、乙偶姻脫氫酶(acetoin dehydrogenase)、甘油醒 _3_ 憐酸還原酶(glyceraldehyde-3-phosphate reductase)、丙二酸半醒脫氣酶(malonate-semialdehyde dehydrogenase)、氛基丁醒脫氫^ 酶(aminobutyraldehyde dehydrogenase)、乳醒脫氫酶(lactaldehydedehydrogenase)、 L-氛基己二酸半醒脫氫^ 酶(L-aminoadipate-semialdehyde dehydrogenase ) λ 4-三甲基氨基丁醒脫氫酶(4-trimethylammoniobutyraldehyde dehydrogenase)、氨基粘康酸半醒脫氣酶(aminomuconate-semialdehyde dehydrogenase)、視黃醒脫氣酶 (retinal dehydrogenase)、谷氛酸-5-半醒脫氣酶(glutaminate-5-semialdehyde dehydrogenase)、舌甘菜減醒脫氣酶(betain-aldehyde dehydrogenase)、 I-卩比略琳 _5_ 駿酸脫氣酶(1-pyrroline-5-carboxylate dehydrogenase)、氣乙醒脫氣酶 (f luoloacetaldehyde dehydrogenase)、玻拍酸半醒脫氫酶(succinate-semialdehyde dehydrogenase)、甲醒脫氫酶(formaldehydedehydrogenase)、葡糖醒脫氫酶 (glucoaldehyde dehydrogenase)、苯醒脫氣酶(phenylacetaldehyde dehydrogenase)、 甲基丙二酸半醒脫氫酶(methylmalonate-semialdehyde dehydrogenase)、黃卩票呤氧化酶(xanthine oxidase)、丙酮酸氧化酶(pyruvate oxidase)，口引哚-3-乙醒氧化酶(indole-3-acetaldehyde oxidase)、甲醒歧化酶(formaldehydedismutase)、2_ 輕基-3-氧代己二酸合酶(2-hydroxy-3_oxoadipatesynthase)、甲醒轉酮酶(formaldehyde transketolase)、氧化轉氨酶(oxiaminotransferase)、醒鐵氧還蛋白氧化還原酶 (aldehydeferredoxin oxidoreductase)、乳酸醒縮酶(lactate aldolase)、丙酮酸脫羧酶(pyruvate decarboxylase)、苯丙酮酸脫羧酶(phenylpyruvatedecarboxylase)、 苯偶姻醒縮酶(benzoin aldolase)、丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase)、酉昆蛋白甲醒脫氫I 酶(quinoproteinformaldehyde dehydrogenase)、2，5_ 二氧代戊酸脫氣酶 (2，5-dioxovalerate dehydrogenase)等。
以下，示出使用了乙醛分解酶的與降低乙醛相關的實驗的結果。
實施例
(人工唾液)
人工唾液中使用了O. 51%w/v NaHC03、0. 137%w/v Κ2ΗΡ04、0· 088%w/v NaCU O. 048%w/v KC1、0. 044%w/v CaC12 · 2H20 (參照日本特開 2007-236233 號公報)。在實驗中製成2倍濃度的人工唾液(2Xsaliva sol.)來使用。
(利用Nash法的乙醛檢測)
在包含乙醛的溶液(200 μ I)中添加等量的Nash試劑(15%w/v乙酸銨、0. 5%v/v乙酸、2%v/v乙醯丙酮)，在55°C下反應30分鐘後，測定388nm處的吸光度。初始乙醛濃度是以IOmM進行的。
(利用GC-MS的乙醛檢測)
由於乙醛是反應性非常高的物質，所以轉化成穩定的衍生物來進行檢測。在包含乙醛的溶液(800 μ I)中添加10mg/ml的五氟苄基羥胺(以下，簡稱為「PFBOA」)160 μ I和 10%三氯乙酸(TCA)160y 1，在冰上反應30分鐘後，在室溫下反應I. 5小時以上。向其中加入4-溴氟苯(lmg/ml甲醇溶液)10μ I作為內標，將樣品Iml移入GC-MS用小瓶中。柱使用 HP-INNOffax (Agilent Technologies)。應予說明，將GC-MS的烘箱溫度設定為60°C、將環溫度設定為200°C來進行測定。
I.醛降低的活性測定I (Nash法)
製備以下3個樣品，比較降低乙醒的效果。使用牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin ;BSA)作為對照，製備 O. 2mM Tris buffer (pH 8· 0)、I X saliva sol·、IOmM 乙醒、 50 μ g/ μ I BSA 的混合液。另夕卜，使用 20mM Tris buffer(pH 8. 0)、I X saliva sol·、IOmM 乙醛、50μ g/μ 1AD、2. 5mM NAD+的混合液作為醛脫氫酶(來自釀酒酵母，A6228，SigmaAldrich 公司。以下，簡稱為「AD」)的樣品，使用20mM磷酸鈉緩衝液(pH 7. 0)、I X saliva sol·、 IOmM乙醛、50 μ g/μ I TA、IOOmM甘氨酸的混合液作為蘇氨酸醛縮酶(來自大腸桿菌，Eur. J. Biochem, 255，220-226 (1998)。以下，簡稱為「TA」)的樣品。將反應溶液量設為200 μ 1， 在37°C下反應30分鐘。將結果示於圖I。蘇氨酸醛縮酶、醛脫氫酶均顯示出降低乙醛的活性。應予說明，乙醛濃度是基於所製成的標準曲線而算出的。
2.降低醛的活性測定2 (GC-MS)
與Nash法同樣地，如下所述製備3個樣品，比較降低乙醛的效果。
(I) BSA 樣品18. 8 μ g/ml BSA> I X saliva sol·、100 μ M 乙醒
(2) AD 樣品20mM Tris buffer (pH 8· 0)、18. 8 μ g/ml AD、I X saliva sol·、 100 μ M 乙醛、ImM NAD+
(3) TA 樣品2· 5mM 憐酸鈉緩衝液(pH 7· 0)、I X saliva sol.、100 μ M 乙醒、 18. 8 μ g/μ I TA、IOOmM 甘氨酸
將反應溶液量設為800 μ 1，使之在37°C下進行反應。如圖2所示，可見蘇氨酸醛縮酶和醛脫氫酶有很強的降低乙醛的效果。即使乙醛為50 μ M這樣的低濃度，也可顯示致癌性(詳細內容參照例如US2008/0166394A1)，這兩種酶能夠在5分鐘以內將人工唾液中的乙醛濃度100 μ M降低至致癌性濃度以下。應予說明，乙醛濃度是基於所製成的標準曲線而算出的。
如上所述，判明來自釀酒酵母的醛脫氫酶和來自大腸桿菌的蘇氨酸醛縮酶對以低濃度存在的唾液中的乙醛發揮良好的作用。特別是，從對低濃度乙醛的分解活性和分解速度的角度出發，前者極其優異(圖2)。
產業上的可利用性
本發明的乙醛降低劑能夠分解唾液中微量存在的乙醛。即，對降低口腔內的乙醛有效。本發明的乙醛降低劑能夠適用於口腔護理領域、醫藥領域、食品領域等。
該發明並不限定於上述發明的實施方式和實施例的說明。在未脫離權利要求的記載且在本領域技術人員能夠容易想到的範圍內的各種變形方式也包含在該發明中。
在本說明書中明示的論文、公開專利公報和專利公報等內容，通過援引引用其全部內容。
權利要求
1.一種口腔內乙醛降低劑，包含醛脫氫酶或蘇氨酸醛縮酶。
2.根據權利要求I所述的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，醛脫氫酶來自酵母菌屬微生物。
3.根據權利要求2所述的口腔內乙醛降低劑，其中，酵母菌屬微生物為釀酒酵母。
4.根據權利要求I所述的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，蘇氨酸醛縮酶來自大腸桿菌。
5.根據權利要求I 4中任一項所述的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，對底物濃度 I μ M ImM的乙醒顯示分解活性。
6.根據權利要求I 4中任一項所述的口腔內乙醛降低劑，其特徵在於，對底物濃度 I μ M 100 μ M的乙醒顯示分解活性。
7.一種口腔用組合物，包含權利要求I 6中任一項所述的口腔內乙醛降低劑。
8.一種方法，通過使權利要求7所述的口腔用組合物作用於唾液，從而降低唾液中的乙醛。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，所述方法對降低口腔內的臭氣有效。
10.根據權利要求8所述的方法，其中，對預防乙醛成為原因或一個原因的癌有效。
全文摘要
本發明的課題在於提供一種對降低口腔內的乙醛有效果的新型酶劑。發現了酵母菌屬微生物的醛脫氫酶和來自大腸桿菌的蘇氨酸醛縮酶對降低低濃度的乙醛有效。本發明中提供一種將這些酶作為有效成分的口腔內乙醛降低劑。
文檔編號A61P43/00GK102946898SQ201180029798
公開日2013年2月27日 申請日期2011年6月7日 優先權日2010年6月19日
發明者山城寬, 小山貴史 申請人:天野酶株式會社