一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法
2023-06-02 01:51:56 2
一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種基於陣列傳感器的抗生素多殘留檢測方法，該陣列式傳感器由一個圓形的電極盤組成，中心位置有對電極和參比電極，外圍是工作電極，測試液中測定的是工作電極與對電極之間的阻抗值。該陣列式傳感器工作電極使用殼聚糖和納米金膠修飾電極後，將各類抗生素適配體固定在相應的工作電極表面，與實際的樣品接觸後，根據各個傳感器阻抗值的變化來確定是否有抗生素超標，並確定抗生素的種類。本發明的抗生素殘留檢測方法可配合抗生素快速檢測儀使用，實現抗生素多殘留在線快速檢測，具有實用性強、攜帶方便、檢測精度高、檢測快速準確、易操作等特點，非常適合對抗生素殘留進行現場快速檢測的場合。
【專利說明】一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法【技術領域】
[0001]本發明涉及一種抗生素多殘留檢測方法。屬於農產品安全檢測【技術領域】。
[0002]近年來，隨著我國畜牧養殖業的迅速發展，奶產量大幅度提高，新鮮牛奶和奶製品已經成為人民(尤其是老人和兒童)生活食品中的重要組成部分。然而，抗生素在現代畜牧業中的廣泛應用，不可避免地造成牛奶中抗生素殘留。若長期飲用含有抗生素的牛奶，無疑是等於長期服用小劑量的抗生素，對抗生素過敏體質的人服用殘留抗生素的牛奶後可引發過敏反應。正常飲用者，會導致體內的某些條件性致病菌易產生耐藥性，一旦患病再用同種抗生素治療很難奏效。抗生素殘留不僅危害人類健康，同時也影響牛奶的品質，造成經濟損失。由於奶牛乳腺炎發病率較高，用抗生素來治療乳腺炎等產科疾病仍較普遍，這容易導致在牛奶中抗生素的殘留。過量使用抗生素不可避免會使母體代謝產物等相關抗生素殘留於動物的肌肉、蛋、奶、臟器組織中，進而通過食物鏈影響人體健康。可見，加強對牛奶等農產品中抗生素殘留的檢測，尤其是保障人類健康有著十分深遠的意義。
[0003]傳統的抗生素殘留檢測方法主要有:氣相色譜(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、色譜/質譜聯用技術(GC/LC-MS)、毛細管電泳法(CE)、螢光分析、酶聯免疫法(ELISA)。這些方法雖然選擇性好、靈敏度高、準確度高、檢出限低，可同時檢測多種元素或化合物，但其需要昂貴的儀器設備，樣品前處理過程繁瑣、費時，並且對分析人員的技術水平要求很高，不適於現場快速檢測。與傳統的分析方法相比，免疫傳感器具有如下特點:(1)較高的選擇性，因此不需要對被測組分進行分離，即不用對樣品進行預處理。(2)結構簡單，體積小，使用方便，特別是可攜式的免疫傳感器，非常有利於農產品安全質量的快速測定。(3)可實現連續在線檢測，使食品加工過程的質量控制 變得簡便。(4)響應速度快，樣品用量少，與其他大型分析儀器相比，免疫傳感器製作成本低，且可反覆使用。
[0004]發明的目的在於針對現有技術的不足，設計提供一種基於陣列式傳感器的抗生素殘留檢測方法，具有檢測快速準確、操作簡單、可實現多殘留同時檢測等特點。
[0005]所述的一種基於陣列式傳感器的抗生素殘留檢測儀其檢測原理為:利用適配體與抗生素之間的特異性免疫反應，以適配體作為識別元件，採用固定化技術在工作電極表面固定不同種類的抗生素適配體，通過模擬多路開關使陣列式傳感器中的一個工作電極與共用的參比電極和對電極接通。通過傳感器在測試底液中導致的阻抗變化來確定樣品中含有何種抗生素，並根據不同抗生素產生阻抗變化的標準曲線，確定樣品中的抗生素的含量。
[0006]為達到以上目的，陣列式傳感器採取以下技術方案實現:由一個圓形的電極盤組成，中心位置有對電極和參比電極，外圍是工作電極，以確保對電極、參比電極與各工作電極的距離相等，使各個工作電極與對電極之間的有相等的阻抗值。在工作電極與參比電極之間加300毫伏的工作電壓，測試液中測定的是工作電極與對電極之間的阻抗值。使用模擬多路開關確定哪一路工作電極接通。
[0007]為了實現上述目的，本發明提供的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法，工作電極使用納米材料進行修飾以保證適配體更好的固定到工作電極表面。陣列式電極的修飾採取以下技術方案實現:取2 y L製備好的殼聚糖滴塗在預處理好的陣列式工作電極表面，常溫乾燥，用PH=7.5的PBS緩衝液衝洗電極表面。電極表面晾乾後，取2 ii L納米金膠滴塗在電極表面，常溫下靜置至乾燥，然後用超純水衝洗表面物理吸附的納米金，氮氣吹乾。
[0008]為了實現上述目的，本發明提供的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法，陣列式工作電極上適配體的固定方法採取以下技術方案實現:然後將2 y L 5mM的抗生素適配體滴在上述經納米材料修飾好的電極上，4h後用超純水衝洗表面，晾乾待用。將固定抗生素適配體的電極浸於用IM的巰基乙醇封閉lh，以封閉非特異性結合位點，陣列式適配體傳感器製作完成，保存在4° C條件下備用。
[0009]本發明的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法，具體檢測過程如下:在使用前將陣列式傳感器工作電極表面使用多壁碳納米管等納米材料進行化學修飾，提高傳感器檢測的靈敏度，之後在陣列式免疫傳感器工作電極表面分別固定不同種類的適配體。然後將陣列式適配體傳感器放入冰箱中，4° C下保存備用。使用時打開抗生素多殘留檢測儀的電源開關，將陣列式傳感器放入測試底液中測量初始阻抗值Al，並保存。將免疫傳感器放入事先處理好的樣品液中孵化10分鐘，再將傳感器連接至檢測儀進行阻抗測量，獲取第二次測量的阻抗值A2，微控制器將其送至顯示屏顯示。計算出變化率，變化率計算公式如下:
變化率=|A1-A2|/A1
如果樣品液中含有抗生素，則含相應抗生素的工作電極發生特異性免疫反應，導致反應後的相應傳感器阻抗值明顯增大。Al與A2的差值越大，表明檢測溶液中的含有某種抗生素殘留的濃度越高。對比標準曲線得到樣品中抗生素殘留的濃度，可以獲得實際樣品中含有何種抗生素殘留，及是否超標等信息。
[0010]本發明提供的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法應用到農產品中的抗生素殘留快速檢測領域，可實現抗生素殘留的定性定量檢測，可以為檢測人員帶來極大的便利，能夠充分滿足抗生素殘留現場快速檢測的要求。
【具體實施方式】
[0011]所述的陣列式傳感器由一個圓形的電極盤組成，中心位置有對電極和參比電極，外圍是工作電極，以確保對電極、參比電極與各工作電極的距離相等，使各個工作電極與對電極之間的有相等的阻抗值。在工作電極與參比電極之間加300毫伏的工作電壓，測試液中測定的是工作電極與對電極之間的阻抗值。使用模擬多路開關確定哪一路工作電極接通。
[0012]陣列式傳感器工作電極的修飾與適配體的固定方法如下:(I)殼聚糖的製備:首先配置1% (I ml/100 ml water)的醋酸溶液並用配好的醋酸溶液作為溶劑製備50 ml1% (I g/100 ml)的殼聚糖溶液。(2)納米金膠的製備採用檸檬酸三鈉熱還原氯金酸(HAuCl4)的方法。所有的玻璃器皿均用王水浸泡，洗滌乾淨備用。配置100 mL 0.01%的氯金酸溶液，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然後迅速加入2.5 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，繼續攪拌20min(此間溶液由淡黃色轉為無色，然後變灰黑色，最後成酒紅色)，除去熱源後繼續攪拌至室溫下慢慢冷卻。將冷卻後的金膠溶液置於乾淨的棕色玻璃瓶中於4° C冰箱中避光保存備用，數月有效。⑶陣列式電極的清洗:電極修飾前，首先浸入熱的「Piranha」溶液(H2SO4:30% H2O2 = 3:1)中浸泡15min，用水清洗乾淨，接下來用0.3iim、30nm的Al2O3漿在麂皮上拋光至鏡面，拋光後用去離子水洗去除表面汙物，再移入超聲水浴中清洗，每次5min，重複二次，然後依次用6mol/L的HNO3、無水乙醇和去離子水超聲清洗，氮氣環境下乾燥。(4)電極的活化:徹底清洗後，電極在0.5mol/L H2SO4溶液中用循環伏安法活化，掃描範圍1.0V?-1.0V，反覆掃描直至達到穩定的循環伏安圖為止。(5)預處理好的電極測試:在含有1X10—3 mol/L K3 [Fe (CN)6]的0.20 mo I/L KNO3溶液中跑循環伏安曲線，以測試所述玻碳電極的性能，掃描速度50mV/S，掃描範圍為-0.1V?0.6V ;當所述循環伏安曲線中的峰電位差在SOmV以下，並儘可能接近64mV，所述玻碳電極可使用，否則要重新返回步驟(3)中，處理所述電極，直到符合要求。(6)取2 UL製備好的殼聚糖滴塗在預處理好的陣列式電極表面，常溫乾燥，用PH=7.5的PBS緩衝液衝洗電極表面。(7)電極表面晾乾後，取2 u L納米金膠滴塗在電極表面，常溫下靜置至乾燥，然後用超純水衝洗表面物理吸附的納米金，氮氣吹乾。(8)然後將2 L 5mM的適配體滴在上述經納米材料修飾好的電極上，4h後用超純水衝洗表面，晾乾待用。(9)最後上述製備好的電極浸於用IM的巰基乙醇封閉lh，以封閉非特異性結合位點，適配體傳感器製作完成，保存在4° C條件下備用。
[0013]本發明的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法，具體檢測過程如下:在使用前將陣列式傳感器工作電極表面使用多壁碳納米管等納米材料進行化學修飾，提高傳感器檢測的靈敏度，之後在陣列式免疫傳感器工作電極表面分別固定不同種類的適配體。然後將陣列式適配體傳感器放入冰箱中，4° C下保存備用。使用時打開抗生素多殘留檢測儀的電源開關，將陣列式傳感器放入測試底液中測量初始阻抗值Al，並保存。將免疫傳感器放入事先處理好的樣品液中孵化10分鐘，再將傳感器連接至檢測儀進行阻抗測量，獲取第二次測量的阻抗值A2，微控制器將其送至顯示屏顯示。計算出變化率，變化率計算公式如下:
變化率=|A1-A2|/A1
如果樣品液中含有抗生素，則含相應抗生素的工作電極發生特異性免疫反應，導致反應後的相應傳感器阻抗值明顯增大。Al與A2的差值越大，表明檢測溶液中的含有某種抗生素殘留的濃度越高。對比標準曲線得到樣品中抗生素殘留的濃度，可以獲得實際樣品中含有何種抗生素殘留，及是否超標等信息。
[0014]本發明的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法適合於抗生素多殘留檢測儀中操作使用，本發明操作工藝簡單，檢測時間較短，可實現抗生素殘留的定性定量測量，具有靈敏度高，穩定性好、重現性好等優點，符合我國抗生素殘留快速檢測技術發展和國際化要求。
【權利要求】
1.一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法，其特徵在於所述的陣列式傳感器，由一個圓形的電極盤組成，中心位置有對電極和參比電極，外圍是工作電極，以確保對電極、參比電極與各工作電極的距離相等，使各個工作電極與對電極之間的有相等的阻抗值，在工作電極與參比電極之間加300毫伏的工作電壓，在用納米複合材料修飾的工作電極表面固定不同種類的抗生素適配體，通過傳感器在測試底液中導致的阻抗變化來確定樣品中含有何種抗生素，並根據不同抗生素產生阻抗變化的標準曲線，確定樣品中的抗生素的含量。
2.根據權利要求1所述的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法，陣列式傳感器工作電極表面電極的修飾方法如下:取L製備好的殼聚糖滴塗在預處理好的陣列式工作電極表面，常溫乾燥，用PH=7.5的PBS緩衝液衝洗電極表面，電極表面晾乾後，取2UL納米金膠滴塗在電極表面，常溫下靜置至乾燥，然後用超純水衝洗表面物理吸附的納米金，氮氣吹乾。
3.根據權利要求1所述的一種基於陣列式傳感器的抗生素多殘留檢測方法，其特徵在於所述的陣列式傳感器的適配體固定方法如下:將2 L 5 mM的抗生素適配體滴在修飾好的陣列式工作電極表面，4 h後用超純水衝洗表面，晾乾待用；最後將固定抗生素適配體的電極浸於用IM的巰基乙醇封閉I h，以封閉非特異性結合位點，陣列式適配體傳感器製作完成，保存在4° C條件下備用。
【文檔編號】G01N27/02GK103558256SQ201310577165
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】郭業民, 王相友, 孫霞, 劉君峰, 賈彗櫻 申請人:山東理工大學