針對在細胞表面表達的蛋白質的抗體製作方法

2023-06-01 14:26:31

專利名稱：針對在細胞表面表達的蛋白質的抗體製作方法
技術領域：
本發明涉及從抗體文庫離析針對在細胞表面表達的蛋白質的抗體的方法以及利用該方法製作的抗體。
背景技術：
抗體通過識別特定的抗原，引發各種生物體內現象，作為生物體內防禦的中堅力量發揮著重要的作用。特別是利用抗體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC ；antibody dependent cell-mediated cytotoxicity)活性、補體依賴性細胞毒性(CDC ；complement dependent cytotoxicity)活性對癌細胞等的清除有效，因此用於作為抗癌劑的用途。著眼於這樣的抗體的作用而實用化的抗體製劑也很多，顯示良好的治療效果的製劑也不少。進而，除了作為醫藥製劑的用途以外，例如作為各種診斷檢查試劑、或者研究開發上有效的工具而廣泛使用。因此需要製作將在各種生物體內現象中發揮重要作用的蛋白質作為抗原來識別的抗體。作為在生物體內現象中發揮重要作用的蛋白質，可以舉出貫通細胞膜的蛋白質 (以下稱為跨膜蛋白)。跨膜蛋白可以舉出例如各種受體蛋白、離子通道蛋白等。由於其中的大多數與細胞內外的信息、物質的傳遞、移動相關，從而對細胞的生存、增殖、分化等發揮重要的作用，因此，製作能夠識別該跨膜蛋白的抗體對上述醫藥製劑、診斷檢查試劑或研究開發工具具有極大的意義。目前，作為針對任意抗原的抗體製作方法已經開發了各種方法(雜交瘤製作法、 DNA免疫法、噬菌體展示法等)。特別是近年來，作為大量且容易地生產具有高特異性的抗體的技術，被稱為ADLib體系(或ADLib法)的方法正在受到關注(參照專利文獻1、非專利文獻1)。根據該方法，可以利用簡便的方法提供具有所需的特異性和親和性的抗體。但是，利用上述各種抗體製作方法的針對跨膜蛋白的抗體製作存在如下的問題。將表達了跨膜蛋白的細胞作為抗原對免疫動物直接給藥而引起免疫反應的方法中，該跨膜蛋白在表達細胞膜上表達生理性的立體結構，但是該表達細胞在生物體內受到蛋白質分解，所以對生理條件下的跨膜蛋白難以製成抗體。DNA免疫法是將跨膜蛋白的cDNA整合到適當的用於哺乳類動物細胞的表達載體， 將該載體直接對免疫動物進行給藥的方法(參考非專利文獻幻。根據該方法，雖然具有在生物體內再現該跨膜蛋白的細胞膜上的立體結構的可能性，但是該蛋白質的作用機理的不清楚的點很多，不清楚對生理條件下的跨膜蛋白是否能夠製作抗體。噬菌體展示法是在作為大腸桿菌病毒的一種的纖維狀噬菌體的外殼蛋白質上以不失去噬菌體的感染能力的方式將抗體的可變區域基因表達為融合蛋白的體系(參考非專利文獻3、4)。在該方法中，使噬菌體粒子與跨膜蛋白反應而選擇所需的抗體時，需要使用純化的跨膜蛋白，並且不能保證作為目標的跨膜蛋白是否保持著生理功能。這些問題在通過在免疫細胞中促進體細胞同源重組而在該免疫細胞表面呈示多樣的抗體分子的ADLib法中也同樣存在，並且針對生理狀態下的純化困難的跨膜蛋白的抗體的選擇不一定容易。如上所述，針對跨膜蛋白的抗體製作在任何製作方法中都困難。專利文獻專利文獻1 國際公開公報W02004/011644非專利文獻非專利文獻1 =Seo 等，Nature Biotech. 23 :731-735, 2005非專利文獻2 =Tang 等，Nature 356 152,1992非專利文獻3 =McCafferty 等，Nature 348 :552-554,1990非專利文獻4 :Marks 等，J. Mol.Biol 222 :581-597,199
發明內容
本發明的發明人鑑於上述情況進行了深入研究，結果在利用在細胞表面上表達跨膜蛋白和標記蛋白的細胞，從抗體集團製備針對跨膜蛋白的抗體上取得了成功。因此，本發明的目的在於提供針對在細胞表面上表達的蛋白質、特別是跨膜蛋白的抗體製作方法。本發明的發明人在製作針對跨膜蛋白的抗體時，代替在採用ADLib法的抗體製作方法中以往使用的、包覆有純化抗原的磁珠，準備在細胞表面表達了跨膜蛋白和標記蛋白的細胞，通過將該細胞作為抗原使用，進行了自ADLib文庫的抗體呈示細胞的篩選。然後， 使用與該標記蛋白質特異性結合的分子離析該細胞-抗體呈示細胞的複合體。雖然不能預知僅通過這樣的方法是否能夠確實地選擇針對生理狀態下的跨膜蛋白的特異性抗體，但是解析的結果，意外地確認了可以獲得具有有效的特異性和親和性的抗體。根據該方法，可以得到利用以往的方法製作困難的針對跨膜蛋白的抗體，通過在生理狀態下呈示該跨膜蛋白，可以提高獲得對該跨膜蛋白的功能帶來影響的功能性抗體的準確度。另外，通過在細胞中表達任意的跨膜蛋白，還具有對任何跨膜蛋白均無需純化就可以進行篩選的優點。SP，本發明涉及以下(1) (6)的內容。(1)本發明的第1方式是「使抗體文庫與在細胞表面上表達了靶抗原蛋白質的細胞接觸，通過離析該細胞，分離與該靶蛋白質形成複合體的抗體文庫的構成物的方法」。(2)本發明的第2方式是「根據上述(1)所述的方法，其中，抗體文庫是在細胞表面呈示抗體的細胞集團」。(3)本發明的第3方式是「根據上述(1)所述的方法，其中，離析在細胞表面上表達了靶抗原蛋白質的細胞的方法利用標記抗原和針對標記抗原的抗體的結合，所述標記抗原是該細胞表達的靶抗原蛋白質以外的細胞表面上的抗原」。(4)本發明的第4方式是「根據上述C3)所述的方法，其中，標記抗原是外來蛋白質」。(5)本發明的第5方式是「根據上述(4)所述的方法，其中，靶抗原蛋白質是外來蛋白質」。(6)本發明的第6方式是「根據上述O) (5)中任一項所述的方法，其中，在細胞表面呈示抗體的細胞集團是DT40」。在本發明中，使用整合了在細胞膜上表達的任意的蛋白質、特別是跨膜蛋白的基
4因的表達載體，使成為抗原的該蛋白質在任意細胞(抗原分子表達細胞)的表面表達，將本細胞與以ADLib法中的抗體表達細胞為代表的各種抗體文庫混合，僅將在構成該抗體文庫的抗體表達細胞、病毒等中，與該抗原分子表達細胞結合的物質濃縮、離析，由此可以獲得抗體。與以往的抗體製作方法相比時，由於不需要純化抗原蛋白質，所以對於純化困難的多次跨膜蛋白也能夠進行抗體製作。另外，通過在生理狀態下呈示該跨膜蛋白，不僅可以識別該跨膜蛋白，還可以提高獲得對該跨膜蛋白的功能也帶來影響的所謂的功能性抗體的準確度。


圖1表示使用了在細胞表面表達的跨膜蛋白的ADLib選擇的流程。 圖2表示用FACS解析對使用人EGFR和⑶4共表達CHO-S細胞選擇的ADLib文庫構成細胞和陰性對照細胞中表達鳥IgM和抗人EGFR抗體兩者的細胞的比例進行解析的結果。圖3表示用FACS解析對從ADLib文庫篩選的抗人EGFR抗體產生細胞和非產生細胞中表達鳥IgM和抗人EGFR抗體兩者的細胞的比例進行解析的結果。圖4表示體現由抗人EGFR抗體產生細胞產生的抗體的抗原特異性的ELISA的結果。圖5表示使用了抗EGFR抗體產生細胞的培養上清的A431細胞和CHO-S細胞的 FACS染色的結果。圖6表示使用抗Claudin2抗體產生細胞的培養上清，用細胞ELISA檢查對 Claudin2表達CHO和未處理CHO細胞的反應性的結果。
具體實施例方式1.抗體文庫在本發明中使用的抗體文庫只要是呈示一組抗體的抗體文庫就可以使用任意的抗體文庫，可以是在細胞表面上呈示抗體的細胞，也可以是在外殼蛋白質上呈示抗體的病毒，本領域技術人員可以容易地進行選擇適合的文庫。優選使用產生抗體的B細胞，特別優選來自雞的B細胞的株化培養細胞DT40細胞。特別優選的抗體文庫是利用ADLib法製作的抗體文庫(ADLib法的詳細內容參照例如專利文獻1)。本發明中使用的抗體文庫的維持條件是根據在該技術領域中公知的方法進行的， 當然是在適合所選擇的抗體文庫的條件下進行。但是所選擇的抗體文庫為DT40細胞集團構成的情況下，例如使用用於維持該細胞集團的培養基IMDM培養基anvitrogen公司)，在 5%的(X)2存在下以39. 5°C進行培養。進而，上述的DT40細胞還包括增加了促進體細胞同源重組、在細胞表面呈示多種抗體分子的處理的細胞。促進體細胞同源重組的方法包括只要是本領域技術人員就能容易選擇的方法，例如可以舉出通過與曲古黴素A等組蛋白去乙醯化酶抑制劑接觸等，使該 DT40細胞的抗體基因位點中的染色質結構松解，從而促進該抗體基因位點中的體細胞同源重組的方法，例如ADLib法等。
2.抗原蛋白質和標記抗原在實施本發明時，作為目標的抗原蛋白質只要是在細胞內表達後在細胞表面呈示的蛋白質，可以使用細胞中原本存在的蛋白質、外來性的蛋白質中的任意的蛋白質，優選為貫通細胞膜的蛋白質，可以舉出例如EGFR、IGF-IR等增殖因子受體蛋白質群、CD81等4次跨膜蛋白群、包括CXCR4等趨化因子受體和鞘脂受體等的7次跨膜蛋白群等。使該細胞與上述抗體文庫結合後，用於將抗原蛋白質和抗體(或者呈示抗體的細胞)的複合體離析的標記抗原只要是用於特異性地識別表達抗原蛋白質的細胞的、發揮所謂的標籤之類功能的分子均可使用。能夠作為標記抗原使用的分子，可以舉出例如蛋白質或糖鏈等在該細胞膜上存在的分子等，可以是在該細胞膜上原本存在的分子，或者在該細胞上原本不存在的外來性的分子。在該細胞膜上原本存在的標記抗原只要是能夠為了識別表達抗原蛋白質的細胞而使用的標記抗原，不一定非要鑑定其分子。例如，如果針對表達了抗原蛋白質的細胞的細胞表面上存在的生物體分子群得到了抗體(群)等，則由於使用這些抗體可以識別或選擇抗原蛋白質，因此可以不清楚這些生物體分子群的來歷。作為標記抗原使用外來性的分子的情況下，可以使用例如在細胞表面上表達的蛋白質等。作為標記抗原使用外來性的蛋白質的情況下，只要是在細胞內表達後在細胞表面呈示的蛋白質均可使用，理所當然地可以使用在細胞表面上表達的膜蛋白質等，即使是分泌蛋白質等本來在膜上沒有出現的分子，也可以通過融合跨膜區域而作為標記抗原而使用。作為標記抗原可以使用例如⑶4、MHC- II類分子等。上述的抗原蛋白質和標記蛋白質(作為標記抗原使用蛋白質的情況)的基因的製備可以基於該技術領域中的通常的技術常識來進行。例如，可以利用RT-PCR法等由適當的細胞等擴增作為目標的抗原蛋白質和標記蛋白質的基因區域，在適當的載體等上進行克隆。另外，標記蛋白是融合蛋白的情況下，可以以同樣的方法擴增將融合的各個蛋白質進行編碼的基因，將各自分別或以融合的狀態用適當的載體等進行克隆。此時，可以從關於作為目標的抗原蛋白質和標記蛋白質(融合蛋白的情況下是融合的各蛋白質)的基因的公知的資料庫等獲得序列信息，基於該信息容易地設計用於RT-PCR法的引物。3.共表達抗原蛋白質和標記蛋白質的細胞實施本發明時，將蛋白質用作標記的情況下，共表達上述抗原蛋白質和標記蛋白質的細胞只要是這些蛋白質在細胞內表達後，在該細胞的表面呈示的細胞均可使用，本領域技術人員可以容易地進行選擇。特別是，該抗原蛋白質和標記蛋白質來自人的情況下，優選能夠期待生理翻譯後引發修飾、細胞內局部存在的來自人的細胞，而且優選操作簡便的株化培養細胞(例如CHO-S細胞等)。通過將製作的抗原蛋白質基因和標記蛋白質基因整合到適當的表達載體，可以在上述的細胞表達所需的抗原蛋白質和標記蛋白。作為標記蛋白質使用融合蛋白的情況下， 調整各基因的閱讀框來進行表達，從而表達具有作為目標的胺基酸序列的所需融合蛋白。 作為表達載體，優選具有在該細胞內能夠表達目標蛋白質的啟動子、增強子等構成要素的表達載體。向上述細胞導入製作的表達載體，可以使用DEAE葡聚糖法、電穿孔法、磷酸鈣法、 利用陽離子性脂質的方法等公知的方法來容易地進行。4.利用抗原蛋白質和標記蛋白質共表達細胞的抗體文庫內的所需庫構成物的選擇實施本實驗時，將共表達上述抗原蛋白質和標記蛋白質的細胞與抗體文庫在適當的條件下(例如生理離子強度、PH)進行懸浮、混合，以適當的時間(例如1小時至一晚)和溫度(例如4°C 37°C左右)進行孵育，從而進行與抗體文庫中的與該抗原蛋白質具有特異性的特定抗體對應的抗體文庫構成物(例如抗體表達細胞)的結合反應。進行了結合反應後，將該共表達細胞和抗體文庫構成物的結合體以介由標記的適當方法離析。此時，優選對於回收的抗體文庫構成物、例如抗體表達細胞為非侵襲性的方法，包括只要是本領域技術人員就能夠容易選擇的全部的方法。例如，如果是標記蛋白質或糖鏈等生物體分子的情況下，可以使用包覆有針對這些生物體分子的特異性的抗體的磁珠、例如MACS珠(Miltenyi Biotech公司)、或Dynabeads (Veritas公司)，將其與該結合體在適當的條件下混合後，利用使用了 MACS法或Dynabeads架(7夕> K )法的方法進行離析。另外，使用了 Dynabeads的情況下，還可以使用King Fisher磁粒子處理器(Thermo Fisher Scientific公司)進行離析。 以下，示出實施例，但是本發明不限於此。實施例1.細胞培養DT40細胞的細胞培養基本按以下的方法進行。培養機使用(X)2恆溫槽，在5%的 CO2存在下以39. 5°C進行培養。培養基使用IMDM培養基(Invitrogen公司)，並加入10% 牛血清、雞血清、青黴素100單位/mL、鏈黴素100 μ g/mL、2-巰基乙醇55 μ M而使用。另外，曲古菌素A (和光純藥)以在DMSO中溶解成ang/mL的濃度的溶液作為貯存液，用適合的培養基稀釋至最終濃度為1. 25ng/mL、2. 5ng/mL後使用。CHO-S細胞的細胞培養基本按以下的方法進行。培養機使用(X)2恆溫槽，在5%的 CO2存在下以37°C進行培養。培養基使用CHO-S SFM培養基(Invitrogen公司)。EGFR#36克隆使用EGFR-Fc重組蛋白(R&D systems公司)，根據利用ADLib體系的選擇，離析產生抗EGFR IgM的克隆。ADLib體系的文庫是將曲古黴素A (和光純藥社)以每天最終濃度為1. 25ng/mL、 2. 5ng/mL的方式添加到培養基中並維持，從使用前日開始用不含曲古黴素A的培養基進行培養。2.對CHO-S細胞的EGFR、CD4基因的轉染利用Pyrobest聚合酶(Takara BIO公司)使用PCR由以下方法製作EGFR的表達載體。將 Human EGFR cDNA 克隆(Open Biosystems 公司，Clone ID 30528231，Accession No. BC094761)作為模板，引物使用 NheI_EGFR_F、hEGFRcDNA-3' (BC094761)，擴增全長 cDNA。反應條件如下。95°C 30秒後，將95°C 30秒、58°C 30秒、72°C 3分鐘進行30循環後， 在72°C反應8分鐘。這裡得到的Human EGFR cDNA通過加入ExTaq(Takara BIO公司)並在72°C反應15分鐘，從而添加了 「A」，利用DH5 α株(Takara BIO公司)亞克隆到pGEM-T easy vector (Promega公司)(克隆1)。由於該克隆1缺少exon4，因此，利用QuickGene RNA cultured cell kit S (FUJIFILM 公司)，從 A431 細胞提取總 RNA，利用 Superscript III first strand synthesis system (Invitrogen 公司),以 50 °C 50 分鐘、85°C 5 分鐘進行逆轉錄反應。將所得first strand cDNA作為模板，用PCR進行cDNA合成，亞克隆到pGEM_Teasy vector。引物使用 NheI_EGFR_F、EGFR-R(NM_005228)。該克隆(克隆2)含有Εχοη4，但由於其它序列具有大量的突變，所以利用PCR， 將克隆2的Εχοη4插入克隆1。利用引物hEGFR_ex4_5，和hEGFR_ex4_3，，由克隆2合成 Exon4片段。將合成的EXOn4片段和克隆1混合的混合物作為模板，利用引物NheI_EGFR_F 和 hEGFR_ex4_3，(用於克隆 1. 1 的合成)、以及 hEGFR_ex4_5，和 hEGFRcDNA-3，(BC094761) (用於克隆1.2的合成)，分別進行PCR。將混合了所得PCR產物(克隆1.1和克隆1.2)的混合物作為模板，利用引物NheI_EGFR-F和hEGFRcDNA_3，(BC094761)進行PCR，亞克隆到 pGEM-T easy vector (Promega 公司)(克隆 3)。序列的確認是利用 ABI 公司 ABIprism377 序列分析儀來進行的。將克隆3用HindIII剪切後，利用Klenow fragment (Takara BIO公司)進行平滑化，進而利用NheI進行剪切，得到了插入片段。同樣將pIRESpuro3 (Takara BIO公司) 用EcoRI剪切後，進行平滑化後，利用NheI進行剪切，得到載體片段。載體、插入片段均用 Qiaquick GelExtraction Kit(Qiagen 公司)進行純化後，禾丨J用 Ligation-Convenience Kit (NIPPON GENE公司)進行連接，轉化到DH5 α株，得到pIRESpuro3EGFR表達載體。(引物序列)NheI_EGFR-F ； TTGCTAGCCCAGTATTGATCGGGAGAGC (序列號 1)hEGFRcDNA-3，(BC094761) ； CAGGCTCGGTCATGTGTTTA (序列號 2)EGFR-R (NM_005228) ；GCACCTGTAAAATGCCCTGT (序列號 3)hEGFR_ex4-5，；GCCCATGAGAAATTTACAGGAAATC (序列號 4)hEGFR_ex4-3，；CAGCTTGGATCACACTTTTGGCA (序列號 5)hEGFR_ex4-5，；GCCCATGAGAAATTTACAGGAAATC (序列號 6)hEGFR_ex4-3，； CAGCTTGGATCACACTTTTGGCA (序列號 7)CD4 的表達載體使用 Miltenyi Biotech 公司的 MACselect transfected cell selection試劑盒的pMACS4. 1質粒。轉染是利用Cell Line Nucleofector Kit V(Amaxa biosystems 公司)，基本按照附加方案進行。回收IX IO6個細胞並懸浮在IOOyL的PBS中。在懸浮的液體中分別加入 IygW pIRESpuro3EGFR、pMACS4. 1，利用程序 U-OM 進行轉染，回收細胞，用 CH0-S-SFM 培養基培養16小時。3.利用表達EGFR和CD4的CHO-S細胞的ADLib文庫中的抗EGFR抗體表達細胞的選擇3-1.表達EGFR和⑶4的CHO-S細胞與ADLib文庫中的抗EGFR抗體表達細胞的結合將表達EGFR和⑶4的CH0-S細胞與ADLib文庫中的1 X IO8細胞懸浮於含有2% 牛血清(invitrogen公司)的DMEM(invitrogen公司)中，進行混合，在4°C一邊振動1小時一邊孵育，進行ADLib文庫中的抗EGFR抗體表達細胞的結合反應。孵育的細胞以120 Xg 離心5分鐘進行回收，並懸浮於含有10%的鳥血清的MACS緩衝液(Miltenyi Biotech公司)中。3-2.利用MACS的抗EGFR表達DT40和EGFR、CD4共表達CHO細胞結合體的濃縮基本按照Miltenyi Biotech公司的方案進行。在上述懸浮於MACS緩衝液的細胞中加入抗CD4微珠200 μ L並混和，在冰上靜置15分鐘。LS colomn (Miltenyi Biotech公司)先用含有10%鳥血清的MACS緩衝液3mL進行平衡化。接著，在上述的細胞 微珠混合物中加入含有10%鳥血清的MACS緩衝液lmL，使總量為2mL，並上柱。上柱3次含有10% 鳥血清的MACS緩衝液5mL，將非特異性地結合於柱的細胞清洗而除去。然後，從磁架上卸下柱，利用不含有10%鳥血清的MACS緩衝液5mL回收與CD4微珠結合的細胞。該操作重複2 次。回收的細胞用上述的DT40培養用的培養基培養一晚。3-3.利用FACS解析確認抗EGFR表達DT40和EGFR、CD4共表達CHO細胞結合體的濃縮將5X IO5個3-2中培養一夜的細胞，在4°C下，以IlOOg離心5分鐘而進行回收， 用FACS緩衝液(含有0.3%牛血清白蛋白的磷酸緩衝生理鹽水)清洗1次後，用EGFR-Fc 蛋白(R&D systems公司用磷酸緩衝生理鹽水製成0. 2 μ g/mL而使用)使細胞懸浮，在冰上靜置20分鐘。此時，每隔10分鐘進行輕叩以促進細胞的重懸。與上述同樣地回收細胞， 用FACS緩衝液清洗2次後，用FITC結合抗人IgG抗體(eBioscience公司，稀釋200倍後使用)和PE結合抗鳥IgM抗體(Beckmarm courlter公司200倍稀釋後使用)使細胞懸浮，在冰上靜置20分鐘。此時，每隔10分鐘進行輕叩以促進細胞的重懸。與上述同樣地回收細胞，用FACS緩衝液清洗2次後，將細胞懸浮在含有1 μ g/mL碘化丙啶的FACS緩衝液 400 μ L中後提供給FACS解析，解析FITC和PE兩者為陽性的細胞(表達鳥IgM、抗EGFR抗體這兩者的細胞)的比例。FACS使用Cell Lab Quanta SP MPL (Beckmann coulter公司)， 使用Flowjo (Tree Mar公司)作為解析軟體。圖2表示該實驗結果的一個例子。圖2B是對不含有與EGFR反應的DT40克隆的細胞集團進行該操作的情況，完全沒有發現在四邊形中表示的EGFR特異性的細胞的濃縮。與此相對，將使用了 ADLib文庫細胞的實驗結果示於圖2A，在四邊形中發現了直到0. 32%的細胞的濃縮，這表示正確地進行了該實驗。4.抗鳥IgM抗體、EGFR Fc嵌合體陽性細胞的FACS分選和離析的細胞的FACS解析從文庫中回收的細胞中，對在3-3的FACS解析中對抗鳥IgM抗體和EGFR-Fc蛋白均顯示陽性信號的細胞群(圖2A中用四邊形框圍著的部分)進行FACS分選。分選儀使用 Beckmann coulter公司EPICS Elite ESP。將圖2的框內的細胞分配到裝滿了 DT40用介質的96孔板(Nunc公司)。將其培養約1周，從而形成來自1個細胞的集落。回收了 55個集落。對於這些，利用FACS解析進行關於抗EGFR抗體的表達的確認。染色、解析方法按照 3-2進行。其結果，對55個克隆中的53個克隆看到了 EGFR Fc嵌合體導致的染色，可以確認是產生針對EGFR的抗體的克隆。將其中的1個克隆(克隆#33)示於圖3A。對於2個克隆沒有看到抗EGFR的產生。將屬於其的克隆之一(克隆#11)示於圖:3B。5.用於離析的克隆的特異性研究的ELISA解析ELISA如下進行。首先，對於4中離析的55克隆，將各1 X IO6細胞分別用ImL的、不含鳥血清的DT40 用培養基培養2天，使其產生IgM，回收其培養上清。培養上清中的IgM濃度是利用Chicken IgM ELISA Quantification Kit (BETHYL公司)，按照附加方案進行。ELISA解析是對各克隆以1 μ g/mL的IgM濃度進行。將EGFR-Fc以1 μ g/mL向96孔免疫板U_96Maxi sorp (Nunc公司)分別注入各100 μ L，並孵育一晚。應予說明，作為用於研究抗體的特異性的對照，將人IgG、BSA也同樣地固定在板上。次日，棄掉板的內容物，加入封閉緩衝液(含0. 5%脫脂牛奶的PBS) 200 μ L， 在室溫下孵育2小時。用ELISA清洗緩衝液(含0. 05% Tween20的PBS) 200 μ L清洗3次。 分別加入來自該抗EGFR表達候補克隆53克隆和CL18克隆的培養上清各100 μ L，在室溫下孵育1小時。用ELISA清洗緩衝液200 μ L清洗5次後，加入將二次抗體(anti-chicken IgM-HRP =BETHYL公司)用PBS稀釋至5000倍的液體100 μ L，在室溫下孵育45分鐘。應予說明，二次抗體使用anti-chicken IgM-HRP (BETHYL公司)。用ELISA清洗緩衝液200 μ L 清洗5次後，加入TMB+(Dako公司)100 μ L，孵育10分鐘。此後，用IN的硫酸100 μ L使反應停止，測定450nm的吸光度，解析對EGFR產生特異性抗體的克隆的數量和編號。將針對克隆#33、#11和非特異性的克隆(CL18M+)的結果分別表示在圖4A、4B、4C。由此明確了克隆#33產生的抗體是EGFR特異性的抗體。在其它的52克隆的EGFR特異性克隆中也看到了同樣的結果。6.用於離析的克隆的特異性研究的FACS解析為了進一步研究離析的克隆的特異性，利用已知高水平表達EGFR的來自扁平上皮癌的細胞株A431細胞進行FACS解析。A431的細胞培養基本上按照以下的方法進行。培養機使用(X)2恆溫槽，在5%的 CO2存在下以37°C進行培養。培養基使用DMEM培養基(Invitrogen公司)，並加入10%牛血清、青黴素100單位/mL、鏈黴素100 μ g/mL來使用。FACS解析按照以下的要點來進行。每1個樣品將5 X IO6個A431細胞回收到1. 5mL 管中，用FACS緩衝液清洗1次。然後用5)中製備的55個克隆的培養上清使細胞懸浮，在冰上放置20分鐘。然後用FACS緩衝液清洗2次，用FITC結合抗鳥IgM抗體(BETHYL公司， 稀釋至1000倍而使用)懸浮，在冰上放置20分鐘。然後用FACS緩衝液清洗2次後，將細胞懸浮在含1 μ g/mL碘化丙啶的FACS緩衝液400 μ L中，然後提供給FACS解析。使用的55 個克隆的培養上清中，對Α431細胞顯示結合的克隆的例子示於圖5。FACS使用Cell Lab Quanta SC MPL (Beckmann coulter 公司)，使用 Flowjo (Tree Mar 公司)作為解析軟體。 將其結果示於圖5。將使用了克隆#33和#11的培養上清的實驗表示在圖5A和5B，另外圖 5C表示使用了市售的抗EGFR抗體的結果。由此，明確了克隆#33產生的抗體對A431細胞上的EGFR分子在生理條件下進行反應。對於其它的52個克隆的EGFR特異性克隆也可以得到相同的結果。作為陰性對照，代替A431細胞使用浮遊系CHO細胞進行同樣的解析。7. Claudin2表達載體製作和Claudin2穩定表達CHO細胞的製作將相當於作為4次跨膜型蛋白質的人ClaUdin2基因的編碼區域的序列整合到 PMClneo載體(Stratagene公司)的多克隆位點，從而作為Claudin2表達載體來構建 PMC-CL2。將其轉染到CHO細胞，接著通過實施利用Geneticinanvitrogen公司)的試劑選擇，確立CLCN2/CH0作為Claudin2穩定表達CHO細胞。8.使用了 Claudin2 —過性表達CH0-S細胞的選擇8-1.利用陰性選擇的ADLib文庫中的不需要抗體表達DT40的去除使用Cell Line Nucleofector Kit V 對 CHO-S 1 X IO7 細胞轉染作為 CD4 表達載體的pMACS4. 1質粒2. 5 μ g。重複該操作5次，回收細胞，用CHO-S-SFM培養基培養16小
10時。接著，添加絲裂黴素C (Nacalai Tesque公司)，使其終濃度為10 μ g/mL，進一步繼續培養3小時。經過絲裂黴素C處理，CHO-S細胞膜上的⑶4的表達仍然得到維持，但細胞的增殖被抑制。回收絲裂黴素C處理後的細胞，使其與將針對作為活細胞的1 X IO7細胞的⑶4表達CHO-S預先製備的生物素標記抗⑶4鼠單克隆抗體(BioLegend公司)固定化的鏈黴親和素標記Dynabeads (Veritas公司)5X IO7個反應。將這樣製備的結合有Dynabeads的CD4 表達CHO-S總量(1 X IO7細胞)懸浮於ADLib文庫1 X IO8細胞中，並混合，一邊在4°C振動 30分鐘一邊進行孵育，使⑶4表達CHO-S與ADLib文庫中所含的不需要抗體表達DT40反應。 將反應結束後的細胞懸液安置在King Fisher磁粒子處理器(Thermo Fisher Scientific 公司)中，通過用磁石吸附由作為磁珠的Dynabeads與細胞構成的複合體，去除ADLib文庫中所含的不需要抗體表達DT40 (陰性選擇)。將沒有吸附的DT40細胞集團作為用於下一步驟陽性選擇的ADLib文庫。8-2.利用陽性選擇的抗Claudin2抗體產生DT40的離析使用Cell Line Nucleofector Kit V 對 CHO-S 1 X IO7 細胞共轉染作為 CD4 表達載體的pMACS4. 1質粒2. 5 μ g和作為Claudin2表達載體的pMC_CL22. 5 μ g。回收細胞，用 CHO-S-SFM培養基培養16小時。接著，添加絲裂黴素C(nacalai tesque公司)，使其終濃度為10 μ g/mL，進一步繼續培養3小時。經過絲裂黴素C處理，CHO-S細胞膜上的⑶4和 Claudin2的表達仍然維持，而細胞的增殖被抑制。回收絲裂黴素C處理後的細胞，使其與將針對作為活細胞的1 X IO6細胞的⑶4和 Claudin2共表達CHO-S預先製備的生物素標記抗⑶4鼠單克隆抗體(BioLegend公司)固定化的鏈黴親和素標記Dynabeads (Veritas公司)5X106個反應。對這樣製備的結合有 Dynabeads的CD4和Claudin2共表達CHO-S總量(1 X IO6細胞)懸浮於實施了上述陰性選擇處理的ADLib文庫(約IX IO8細胞)中，並混合，一邊在4°C振動30分鐘一邊進行孵育， 使⑶4和Claudin2共表達CH0-S與ADLib文庫反應。將反應結束後的細胞懸液安置在King Fisher磁粒子處理器(Thermo Fisher Scientific公司)中，在清洗液中重複進行用磁石吸附並解吸由作為磁珠的Dynabeads與細胞構成的複合體的步驟，從而清洗除去非特異性地反應的DT40。將清洗後回收的細胞總量播入2塊96孔板，約10天後回收培養上清，通過細胞ELISA檢查該培養上清中所含抗 Claudin2抗體的存在。細胞ELISA按照以下的方法實施。準備將作為Cladin2穩定表達細胞的CLDN2/CH0 或未處理的CHO細胞以3 X IO4細胞/孔播種並在5%的(X)2存在下以37°C培養2天的板。 除去該板的培養上清後，加入陽性選擇後的細胞培養上清100 μ L，在室溫下反應1小時。用含 0. 05% Tween20 的 PBS 清洗孔，接著將稀釋至 10000 倍的 anti-chicken IgM-HRP (BETHYL 公司)100 μ L作為二次抗體進行反應。用含0. 05% Tween20的PBS清洗後，作為顯色液加入TMB+ (Dako公司)100 μ L，孵育30分鐘。此後，用IN的硫酸100 μ L使反應停止，通過測定450nm的吸光度，檢查陽性選擇中回收的細胞培養上清中的抗Claudin2抗體的存在。對播入了陽性選擇回收後的細胞的2塊96孔板進行檢查的結果，如圖6所示，以高比例看到了與未處理的CHO不反應、與Claudin2穩定表達細胞CLDN2/CH0特異性地反應的孔。圖中，PC是將相當於Claudin2的細胞外環(>一7° )之一的合成肽作為抗原，通過ADLib選
11擇而確立的抗體，作為陽性對照使用。另外，NC是通過ADLib選擇確立的針對鏈黴親和素的抗體，作為陰性對照使用。以上證明了本發明不僅可以適用於1次跨膜型蛋白EGFR，而且還可以適用於抗體獲得困難的4次跨膜型蛋白的抗體製作。產業上的利用可能性本發明可以製作針對以往抗體獲得困難的所需的跨膜蛋白的抗體，並且，還可以提高獲得對該跨膜蛋白的功能也帶來影響的所謂的功能性抗體的準確度，因此，在抗體製劑、抗體診斷試劑等領域，或者作為研究上的工具能夠廣泛利用。
權利要求
1.一種分離抗體文庫的構成物的方法，其特徵在於，通過使抗體文庫與在細胞表面上表達了靶抗原蛋白質的細胞接觸，離析該細胞，從而分離與該靶蛋白質形成複合體的抗體文庫的構成物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，抗體文庫是在細胞表面呈示抗體的細胞集團。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，離析在細胞表面上表達了靶抗原蛋白質的細胞的方法利用標記抗原和針對標記抗原的抗體的結合，所述標記抗原是該細胞表達的靶抗原蛋白質以外的細胞表面上的抗原。
4.根據權利要求3所述的方法，其中，標記抗原是外來蛋白質。
5.根據權利要求4所述的方法，其中，靶抗原蛋白質是外來蛋白質。
6.根據權利要求2 5中任一項所述的方法，其中，在細胞表面呈示抗體的細胞集團是 DiMO。
全文摘要
本發明的目的是提供針對細胞表面表達的蛋白質、特別是跨膜蛋白的抗體製作方法。本發明是提供將在細胞膜上表達抗原蛋白質的細胞(抗原分子表達細胞)和以抗體表達細胞、病毒為代表的各種抗體文庫混合，僅將在構成該抗體文庫的抗體表達細胞、病毒等內與該抗原分子表達細胞結合的物質濃縮、離析，從而獲得所需的抗體的方法。
文檔編號C12N15/09GK102282256SQ20098015488
公開日2011年12月14日 申請日期2009年12月7日 優先權日2008年12月5日
發明者坂西由希子, 小山智加, 李東輝, 橋本修一, 河野功, 瀨尾秀宗, 石田章子, 針谷直人 申請人:凱奧目生物科學株式會社