一種新型的耐高溫α-澱粉酶及其製備方法和應用的製作方法
2023-06-01 07:33:16 1
一種新型的耐高溫α-澱粉酶及其製備方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種新型的耐高溫α-澱粉酶及其基因和製備方法，通過PCR定點突變野生型耐高溫α-澱粉酶基因，並使其在枯草芽孢桿菌中高效表達。本發明的新型的耐高溫α-澱粉酶在高溫和酸性環境下穩定性高，能夠更好的適應工業生產，以達到節能減耗，提高效率的作用。其技術方案是從地衣芽孢桿菌中分離野生型耐高溫α-澱粉酶基因，對其His316的胺基酸殘基進行突變，經在枯草芽孢桿菌中高效表達，在90℃和pH4.5的條件下，該新型的耐高溫α-澱粉酶(His316→Arg)比野生型的耐高溫α-澱粉酶穩定性均有提高。
【專利說明】一種新型的耐高溫α-澱粉酶及其製備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於基因工程【技術領域】，涉及基因的定點突變和重組技術，尤其是一種新 型的耐高溫α-澱粉酶及其製備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 目前國內外生產耐高溫α-澱粉酶所用菌株大多數是嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)和地衣芽抱桿菌（Bacillus licheninformis)，與其它細 菌所產α -澱粉酶相比具有更好的耐熱性，而且地衣芽孢桿菌具有較高的生長溫度、良好 的產物合成效率、優秀的蛋白質合成與分泌能力，因此被廣泛的應用於工業生產。
[0003] Β. licheninformis所產的耐高溫α -澱粉酶（BLA)由於良好的耐熱性廣泛地應 用於澱粉水解工藝中，但隨著國內外澱粉原料深加工工業的高速發展，造成耐高溫α -澱 粉酶的應用領域不斷擴大，例如應用於澱粉加工、紡織物退漿、食品加工、啤酒和酒精生產、 醫藥行業、發酵行業以及石油開採工業等方面。其中開發穩定性高的α-澱粉酶成為目前 α-澱粉酶酶製劑研宄領域的一個重要方向。
[0004] 現階段應用於澱粉液化過程中的耐高溫α -澱粉酶的最適溫度和pH -般在95°C 和6. 5左右，為了保持活力一般需要加入一定濃度的Ca2+，為了保證耐高溫α -澱粉酶在澱 粉液化過程中發揮較高的活力，需將天然粉漿的原始PH由（3. 2-4. 5)調至（5. 8-6. 2)，在下 一步糖化過程中又要將糖化液的pH調至4. 2-4. 5,這兩步pH調整過程中既增加了工藝的繁 瑣度也降低了經濟效益，所以在理想的工藝步驟中需要開發研製一種在高溫和酸性環境下 活力穩定的耐高溫α-澱粉酶。
【發明內容】
[0005] 本發明目的在於克服現有技術的不足之處，提供一種通過定向進化構建的在高溫 和酸性環境下酶活力更穩定的高溫α-澱粉酶突變體及其製備方法。
[0006] 本發明實現目的技術方案如下：
[0007] 一種新型的耐高溫α -澱粉酶突變體，是通過對野生型耐高溫α -澱粉酶進行定 向進化，通過重疊 PCR和定點突變，獲得胺基酸序列如SEQ ID NO :7所示的耐高溫α-澱粉 酶突變體，經宿主細胞枯草芽孢桿菌高效表達後獲得新型的耐高溫α-澱粉酶。
[0008] 所述耐高溫α -澱粉酶突變體為：鹼基C946 - Α、Α947 - G、Τ948 - G，胺基酸 His316 - Arg。（上述表示方法為：原始胺基酸/鹼基位置一替換的胺基酸/鹼基。）
[0009] 所述耐高溫α -澱粉酶突變體的基因序列如SEQ ID NO :6所示。
[0010] 所述野生型耐高溫α -澱粉酶的基因序列如SEQ ID NO :5所示。
[0011] 所述野生型耐高溫α -澱粉酶來源是地衣芽孢桿菌Bacillus licheniformis。
[0012] 優選的，所述的宿主細胞為枯草芽孢桿菌B. subtilis WB600,該菌為6種胞外蛋 白酶缺失菌。
[0013] 所述耐高溫α -澱粉酶突變體用於澱粉的水解，酶活力為3270U/mL。所述耐高溫 α-澱粉酶突變體在90°C、pH6.0的半衰期比野生型提高了 93. 5%;在pH 4. 5、70°C的半衰 期比野生型提高了 41. 2%。
[0014] 所述新型的耐高溫α -澱粉酶突變體的製備方法，包括如下步驟：
[0015] (1)定點突變野生型耐高溫α -澱粉酶的成熟肽基因，第946位鹼基C - A，第947 位鹼基A - G，第948位鹼基T - G，得到新型的耐高溫α-澱粉酶基因；
[0016] (2)將上述新型的耐高溫α -澱粉酶基因，與大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質粒PBAPR 載體相連，PBAPR帶有一個嗜鹼芽孢桿菌鹼性蛋白酶強啟動子Papk、一個果聚糖蔗糖酶基因 信號肽序列sacB，得到攜帶新型的耐高溫α -澱粉酶基因的重組表達質粒；
[0017] (3)將重組質粒轉化入宿主菌株枯草芽孢桿菌Β. subtilis WB600中，得到重組菌 株；
[0018] (4)將重組菌株進行發酵，分泌表達製備新型的耐高溫α -澱粉酶；
[0019] (5)分離提取新型的耐高溫α -澱粉酶。
[0020] 本發明的優點和積極效果如下：
[0021] 本發明使用重疊 PCR技術，對野生型耐高溫α-澱粉酶進行定點突變。利用大腸 桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭分泌表達型載體，轉化枯草芽孢桿菌，得到一種在高溫和酸性環 境下活力更穩定的高溫α -澱粉酶（His316)，在90°C和pH 4. 5的條件下，該新型的耐高 溫α -澱粉酶（His316 - Arg)比野生型的耐高溫α -澱粉酶的半衰期分別高93. 5%和 41. 2%，穩定性明顯提高。在高溫和酸性條件下具有較高的酶活穩定性，可以降低能耗，符 合低碳環保理念，在食品、洗滌劑、化妝品、飼料等應用工業上有著普通α -澱粉酶無法取 代的優越性，具有明顯的經濟效益及社會效益。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發明定點突變流程圖；
[0023] 圖2為本發明重組質粒pBAPR-amyM的構建示意圖；
[0024] 圖3為本發明定點突變基因電泳圖（a :M為Ikb DNA ladder，1為片段IamyMl基 因，2為片段2amyM2基因；b:M為Ikb DNA ladder，l為片段1和片段2重疊後amyM基因）；
[0025] 圖4為本發明重組子驗證圖（M為Ikb DNA ladder，1為重組質粒pBAPR-amyM的 BamHI和HindIII雙酶切，2為原始質粒pBAPR的BamHI和HindIII雙酶切）；
[0026] 圖5為本發明SDS-PAGE分析新型的耐高溫α -澱粉酶的表達（M為蛋白分子量標 準，1 為 pBAPR-amyM/WB600, 2 為 pBAPR/WB600);
[0027] 圖6為本發明工程菌表達產物純化的聚丙烯醯胺凝膠電泳分析（M為蛋白分子量 標準，1為野生型耐高溫α -澱粉酶，2為新型的耐高溫α -澱粉酶）。
【具體實施方式】
[0028] 下面結合實施例對本發明的技術內容做進一步說明；下述實施例是說明性的，不 是限定性的，不能以下述實施例來限定本發明的保護範圍。
[0029] 實施例1 :野生型耐高溫α -澱粉酶基因的獲得
[0030] (1)地衣芽孢桿菌基因組DNA的提取：
[0031] ①將菌體在37°C，200r/min培養18-24h，收集菌體。
[0032] ②加入500 μ L ddH20,重懸菌體，洗絛菌體，5000r/min離心5min，棄上清。
[0033] ③加入500 μ L ddH20,重懸菌體，並加入溶菌酶（15 μ g/mL)，37°C水浴消化lh。
[0034] ④加入10% SDS 50 μ L，蛋白酶K 30 μ L，60°C水浴消化2h。
[0035] ⑤加入10 %體積的5mol/L NaCl,上清轉管加入等體積的酷：氯仿：異戊醇 (25 : 24 : 1)，反覆顛倒離心管數次，12000r/min離心lOmin。
[0036] ⑥取上清，加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 : 24 : 1)，反覆顛倒離心管數次， 1200r/min 離心 lOmin。
[0037] ⑦取上清，加入等體積的氯仿，反覆顛倒離心管數次，12000r/min離心lOmin。
[0038] ⑧重複上一步一次。
[0039] ⑨取上清，加入0· 6倍體積的異丙醇，-20°C放置20min後12000r/mim離心IOmin 棄上清，用〇. 5mL 70%的乙醇洗沉澱2次，晾乾並加入80 μ L ddH20,溶解沉澱，-20°C保存。
[0040] (2)目的基因的獲得
[0041] 參照地衣芽孢桿菌耐高溫α -澱粉酶基因的序列，並結合所用的PUC19質粒上的 酶切位點，設計引物：
[0042] 上遊引物 AMY-F(SEQ ID NO :1) :5，-CGcGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCT-Sr (下 劃線部分為加入的BamHI酶切位點）；
[0043] 下遊引物 AMY-R(SEQ ID NO :2):
[0044] 5' -CcCAAGCTTTCTTTGAACATAAATTGAAACC-Sr (下劃線部分為加入的 HindIII 酶 切位點）。
[0045] 以地衣芽孢桿菌基因組DNA為模板，進行PCR，反應體系為：CldH2O 37 μ L， IOXbuffer 5 yL，dNTPs(5mmol/L)2 yL，引物 AMY-F (20 μ mol/L) 2 μ L，引物 AMY-R (20 μ mol/L) 2 μ L，DNA 模板 I μ L，Pyrobest 高保真 DNA 聚合酶 I μ L。擴增條件為： 95°C預變性5min ;95°C變性25s，56°C退火30s，72°C延伸I. 5min反應30個循環；72°C延伸 10min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測在約I. 5kb處出現特異性條帶。
[0046] 實施例2 :野生型耐高溫α -澱粉酶基因的定點突變
[0047] (1)野生型耐高溫α -澱粉酶基因連接入載體pUC19.
[0048] 將PCR擴增得到的目的基因進行純化，用BamHI和HindIII雙酶切，酶切產物再經 純化後，瓊脂糖凝膠電泳檢測。同時也將質粒PUC19用BamHI和HindIII進行雙酶切，純化， 最後採用T 4DNA連接酶12°C連接8h，構建重組質粒pUC19-amy。利用電轉化法將該重組質 粒轉入大腸桿菌JM109中，雙酶切和PCR驗證結果表明amy基因已成功克隆到載體pUC19 上。
[0049] 將其測序可知擴增到野生型耐高溫α -澱粉酶基因序列如SEQ ID NO :5。
[0050] (2)定點突變
[0051] 基於重疊 PCR技術進行定點突變，構建新型的耐高溫α -澱粉酶。設計引物如下：
[0052] 上遊引物 AMY-F(SEQ ID NO :1) :5，-CGcGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCT-Sr (下 劃線部分為加入的BamHI酶切位點）；
[0053] 下遊引物 AMY-R(SEQ ID NO :2):
[0054] 5' -CcCAAGCTTTCTTTGAACATAAATTGAAACC-Sr (下劃線部分為加入的 HindIII 酶 切位點）。
[0055] 重疊引物 H316R-F(SEQ ID NO :3) :5，-GTTTCCAAGAGGCCGTTGAAAT-3'
[0056] 重疊引物 H316R-R(SEQ ID NO :4) :5，-ATTTCAACGGCCTCTTGGAAAC-3'
[0057] 在上遊引物和下遊引物5'端分別引入BamHI和HindIII酶切位點。重疊引物 H316R-F與重疊引物H316R-R互補。重疊引物H316R-F與重疊引物H316R-R中包含了對316 位胺基酸殘基的突變His316 - Arg。
[0058] 用引物AMY-F、H316R-R擴增上遊片段amyMl，AMY-R、H316R-F擴增下遊片段amyM2。
[0059] PCR反應體系包括：10XPCR反應緩衝液5yL，dNTP 4yL，上遊引物AMY-F、 H316R-F/下遊引物 H316R-R、AMY-R各 I yL，重組質粒 pUC19-amy 10ng，Pfu DNA 聚合酶 5U， 無菌去離子水補充至50 μ L。
[0060] PCR擴增條件為：94 °C預變性5min ;94 °C變性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸 I. 5min，共 30 個循環；72°C延伸 lOmin。
[0061] PCR產物切膠回收，適當稀釋。以amyMl、amyM2為引物，進行PCR。PCR反應體系 為：10 X PCR 反應緩衝液 5 μ L，dNTP 4 μ L，amyMl、amyM2 各 1 μ L，Pfu DNA 聚合酶 5U，無菌 去離子水補充至48yL。PCR擴增條件為：94°C預變性5min ;94°C變性45s，55°C退火30s， 72°C延伸I. 5min，3個循環；然後加入引物AMY-F、AMY-R各I yL，進行PCR，PCR擴增條件同 刖。
[0062] 對PCR反應液進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收目的DNA片段amyM。得到 His316 - Arg的耐高溫澱粉酶的突變基因（新型的耐高溫α -澱粉酶基因）。
[0063] 將其測序可知擴增到新型耐高溫α -澱粉酶基因序列如SEQ ID NO :6。
[0064] 實施例3 :新型的耐高溫α -澱粉酶表達載體的構建
[0065] pBAPR為以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭克隆載體ρΒΕ2為骨架，克隆入一個嗜鹼 芽孢桿菌鹼性蛋白酶強啟動子Papk及能夠使重組蛋白直接分泌到培養基中的果聚糖蔗糖酶 信號序列sacB而獲得。它同時含有枯草桿菌質粒pUBllO的複製子和大腸桿菌質粒pGEM3 的複製子，既能在大腸桿菌又能在枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌細胞中進行自主複製。它帶 有AmplP Kmlr基因，可以在大腸桿菌中利用氨苄青黴素抗性作為篩選標記，同時又可以在枯 草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌中利用卡那黴素抗性作為篩選標記。
[0066] 將經重疊 PCR構建獲得的新型的耐高溫α -澱粉酶基因 amyM與pBAPR分別用 BamHI、HindIII雙酶切，經純化後在16°C連接12h，構建重組質粒pBAPR-amyM。將IOyL 的pBAPR-amyM電轉化40 μ L大腸桿菌JM109感受態細胞，塗布在含氨苄青黴素（100 μ g/ mL)的LA平板上，挑選陽性轉化子，提取質粒進行酶切驗證，確定構建獲得重組菌株JM109/ pBAPR-amyM〇
[0067] 實施例4 :含有新型的耐高溫α -澱粉酶基因工程菌的構建和篩選。
[0068] 按下述方法製備枯草芽孢桿菌WB600 (實驗室保存）的感受態細胞。挑取一環孢 子接種於少量生長培養基（LB+0. 5mol/L山梨醇）中，過夜培養。將種子以1/16的接種量 接種於生長培養基（LB+0. 5mol/L山梨醇）中，37°C搖床震蕩培養至006。。在0· 85-0. 95左 右。冰水浴冷卻培養物10min，於4°C，5000r/min，離心5min收集菌體。反覆用冰冷的電擊 緩衝液（〇· 5mol/L山梨醇，0· 5mol/L甘露醇，10% (V/V)甘油）洗滌細胞收集物4次。用原 培養液1/40體積的電擊緩衝液重新懸浮細胞收集物，細胞濃度應該在1-1. 3 X 101(lCfu/mL。 感受態細胞分裝為60 μ L/EP管保存在-80°C (不需要液氮預凍），在轉化效率有所下降之 前都可以正常使用。轉化條件：60 μ L感受態細胞加入1 μ L (50ng/μ L) pBAPR-amyM混勻並 轉移到冰冷的電轉化杯（Imm)中，冰浴1-1. 5min後，電擊一次（25 μ F，200 Ω，4. 5-5. 0ms)。 電擊完畢之後，立即加入ImL復甦培養基（LB+0. 5mol/L山梨醇+0· 38mol/L甘露醇）。37°C 搖床震蕩培養3h之後，將復甦物塗布在LB平板上，37 °C培養24-36h，挑取陽性轉化子，獲得 枯草芽抱桿菌重組菌株WB600/pBAPR_amyM。
[0069] 實施例5 :枯草芽孢桿菌重組菌株中新型的耐高溫α -澱粉酶的表達及分離純化
[0070] 將枯草芽孢桿菌重組菌株WB600/pBAPR-amyM接種於LB液體培養基（含卡那黴 素，30 μ g/mL)中，37 °C，200r/min培養過夜，按1 %接種量轉接於50mL新鮮培養基中，200r/ min培養24h，由於表達載體pBAPR為枯草芽孢桿菌組成型表達載體，不需額外加誘導劑誘 導，培養24h後，即可製備獲得新型的耐高溫α-澱粉酶（H316R)粗酶液。直接取樣進行 SDS-PAGE及活性檢測。
[0071] 純化新型的耐高溫α-澱粉酶的步驟如下：採用分級鹽析法，先以30%飽和度 的硫酸銨鹽析除去雜蛋白，再把飽和度加大到70 %，沉澱α-澱粉酶，收集30 % -70% 範圍內蛋白質沉澱部分，溶解後，透析除鹽。然後使用弱陰離子交換劑DEAE-Sephar〇 s e Fast Flow對硫酸銨鹽析得到的活性組分進行分離（2mL上樣量，上樣後用0.02mol/L Tris-HCl (pH 7. 0)洗脫未吸附的蛋白，3mL/管分部收集，第51管開始梯度洗脫，緩衝液為 0-1. Omol/L NaCl 的 0· 02mol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)，流速 I. 5mL/min，3mL/ 管分步收集），經 DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換後獲得的活性組分再用Sephadex G-75凝膠過濾（2mL 上樣量，上樣後用含 〇· 15mol/L NaCl 的 0· 02mol/LTris-HCl (pH 7. 0)洗脫，流速 0· 5mL/ min，2mL/管分部收集），製備獲得電泳純的新型的耐高溫α -澱粉酶（H316R)。
[0072] 實施例6 :新型的耐高溫α -澱粉酶的純化分析。
[0073] 收集經過純化的α -澱粉酶液，濃縮後，經過SDS-PAGE檢測，分離得到的組分呈單 一條帶，其分子量為53KDa。
[0074] 產品性能測定：
[0075] 1、α -澱粉酶活力的測定
[0076] 採用QB/T2306-97方法進行檢測，將枯草芽孢桿菌重組菌株WB600/pBAPR-amyM發 酵液，12000r/min離心IOmin去除細胞，測定上清液中的酶活（記為細胞外酶活）。酶活力 單位定義：在7〇°C、pH6. 0條件下，Imin液化Img可溶性澱粉成為糊精所需要的酶量，即為1 個酶活力單位，以U/mL(U/g)表示。測定方法如下：1.酶液製備：用緩衝液配製成酶溶液， 使其最終酶濃度控制在65U/mL-70U/mL範圍之內。2.測定：（1)吸取可溶性澱粉溶液（20g/ L)20mL和磷酸緩衝液（相應pH)5mL於試管中。在70°C恆溫水浴中預熱3min-5min。（2) 加入稀釋好的待測酶液I. 〇〇mL，立即計時，搖勻，準確反應5min。（3)立即吸取I. OOmL反應 液移入預先裝有〇.lmol/L HCl 0.5mL和5mL稀碘液的試管中搖勻。（4)以0.1mol/L HCl 0. 5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，於660nm波長下，用IOmm比色皿迅速測定吸光度（A)。 根據吸光度查表，求得測試酶液的濃度（C)。3.計算：X = CXNX 16. 67式中：X-樣品的酶 活力"1^卬/^);(：-測試的酶液濃度"1^#-樣品的稀釋倍數；16.67-換算常數。所得結 果表示至整數。
[0077] 在此條件下進行α -澱粉酶活力檢測，枯草芽孢桿菌重組菌株WB600/pBAPR_amyM 發酵液中製備獲得的新型的耐高溫α -澱粉酶的活力為3270U/mL。
[0078] 2、新型的耐高溫α -澱粉酶性質的研宄
[0079] 經硫酸按鹽析、DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析、Sephadex G-75凝膠層 析分離純化後，得到電泳純的新型的耐高溫α-澱粉酶（H316R)，以野生型耐高溫α-澱粉 酶（AMY)為對照，對其進行酶學性質研宄。
[0080] ⑴溫度對酶活力的影響
[0081] 最適反應溫度的測定：在不同溫度（60°C、70°C、80°C、90°C、100°C)，ρΗ6.0的條件 下測定重組酶純化酶液的酶活，AMY和H316R最適作用溫度為90°C。
[0082] 熱穩定性的測定：在90°C、pH 6. 0條件下測定重組酶的半衰期，AMY在90°C、pH6. 0 的半衰期為3. lmin，H316R的半衰期為6. Omin，比AMY的半衰期提高了 93. 5%。
[0083] ⑵pH對酶活力的影響酶
[0084] 最適反應 pH 的測定：在不同 pH 值（3·0、3·5、4·0、4·5、5·0、5·5、6·0、6·5、7·0)， 70°C下測定重組酶純化酶液的酶活，AMY的最適作用pH為6. 5，H316R的最適作用pH為6.0。
[0085] pH穩定性的測定：在pH4. 5、70°C測定重組酶的半衰期，AMY在pH4. 5、70°C下的半 衰期為I. 7min，H316R在pH4. 5、70°C下的半衰期為2. 4min，比AMY的半衰期提高了 41. 2%。
[0086] 重組酶性質的分析：
[0087] 通過研宄可知，新型的耐高溫α -澱粉酶和耐高溫α -澱粉酶最適作用溫度均為 90°C ;於90°C、pH6. 0下，新型的耐高溫α -澱粉酶比耐高溫α -澱粉酶的半衰期提高了 93. 5%，說明突變位點提高了突變酶的耐高溫性能。新型的耐高溫α-澱粉酶最適作用pH 為6. 0,耐高溫α -澱粉酶最適作用pH為6. 5 ;於70°C、pH4. 5下，新型的耐高溫α -澱粉酶 比耐高溫α -澱粉酶的半衰期提高了 41. 2%，說明突變位點提高了突變酶的耐酸性能。
[0088] 由此說明，耐高溫α -澱粉酶由原316位的L-組氨酸變為L-精氨酸（CAT - AGG) 後，可提高耐高溫α -澱粉酶在高溫和酸性環境中的穩定性，說明耐高溫α -澱粉酶基因經 定點突變後，構建獲得新型的耐高溫α -澱粉酶基因，經克隆到大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭表 達分泌表達型載體pBAPR，轉化6種胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢桿菌WB600,實現新型的耐 高溫α-澱粉酶分泌表達，成功製備獲得一種新型的耐高溫α-澱粉酶。
【權利要求】
1. 一種耐高溫a-澱粉酶突變體，其特徵在於，其胺基酸序列如SEQ ID NO :7所示。
2. 如權利要求1所述的一種耐高溫a -澱粉酶突變體，其特徵在於，其基因序列如SEQ ID NO :6 所示。
3. 權利要求1所述耐高溫a-澱粉酶突變體的用途，其特徵在於，所述耐高溫a-澱粉 酶突變體在90°C、pH6. 0的半衰期比野生型提高了 93. 5% ;或者所述耐高溫a -澱粉酶突 變體在pH 4. 5、70°C的半衰期比野生型提高了 41.2%。
4. 一種包含權利要求1所述的耐高溫a -澱粉酶突變體的克隆載體、表達載體或宿主 細胞。
5. 如權利要求4所述的克隆載體、表達載體或宿主細胞，其特徵在於，所述的克隆載體 為PUC19,所述的表達載體為pBAPR，所述的宿主細胞為枯草芽孢桿菌WB600。
6. 權利要求1所述的耐高溫a -澱粉酶突變體的製備方法，其特徵在於，包括以下步 驟： (1) 定點突變野生型耐高溫a -澱粉酶的成熟肽基因，第946位鹼基C突變為A，第947 位鹼基A突變為G，第948位鹼基T突變為G，得到新型的耐高溫a -澱粉酶基因； (2) 將上述新型的耐高溫a -澱粉酶基因，與大腸桿菌-芽孢桿菌穿梭質粒pBAPR載體 相連，pBAPR帶有一個嗜鹼芽孢桿菌鹼性蛋白酶強啟動子PAPR、一個果聚糖蔗糖酶基因信 號肽序列sacB，得到攜帶新型的耐高溫a -澱粉酶基因的重組表達質粒； (3) 將重組質粒轉化入宿主菌株枯草芽孢桿菌WB600中，得到重組菌株； (4) 將重組菌株進行發酵，分泌表達製備新型的耐高溫a -澱粉酶； (5) 分離提取新型的耐高溫a-澱粉酶。
【文檔編號】C12N15/75GK104480087SQ201510004498
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2015年1月6日 優先權日:2015年1月6日
【發明者】劉逸寒, 王正祥, 路福平, 王春霞, 王建玲 申請人:天津科技大學