一種阿黴素-二肽複合物的製備方法和應用的製作方法

2023-06-01 13:36:36 4

專利名稱：一種阿黴素-二肽複合物的製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物與醫藥技術領域，具體涉及一種具有抗癌活性的 阿黴素-二肽複合物的製備方法和應用。
背景技術：
由於其廣泛的抗腫瘤作用，阿黴素作為治療癌症的一線藥物常用 於肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和多種血癌等的臨床治療中。 然而，阿黴素的骨髓抑制和心臟毒性等不良反應往往破壞病人的免疫 功能，嚴重影響了治療效果。因此，尋找一種降低阿黴素毒性、提高 阿黴素對腫瘤組織的選擇性的修飾方法成為目前研究的重點之一。前體藥物技術的一個核心是許多抗腫瘤小分子化學藥物的結構 中含有可發生醯化反應的游離氨基，並且這些游離氨基往往影響著藥 物的化學和生物學特性， 一旦被其他化學基團修飾或封閉，將導致藥 物的細胞毒性顯著降低，而去除修飾基團其細胞毒性則即可恢復。這些藥物包括阿黴素(doxorubicin, Dox)、道諾黴素(daunomycin， DM)等等。Bairrain等製備了多個道諾黴素的多肽衍生物，結果發現， Ala-Leu-DM與Leu-Leu-DM的細胞毒性分別下降至母體藥物DM的 1/100和1/250。而一旦水解去除多肽，DM的細胞毒性即可恢復 [Baurain R， et al. J Med Chem. 23 (11) :1171—4. 1980]。 Trouet 報導，阿黴素的四肽衍生物N-alanyl-leucyl-alanyl-leucyl-Dox對 正常小鼠及荷瘤小鼠的毒性僅為阿黴素的1/9[Trouet A， etal. Cancer Res. 61 (7) :2843-6. 2001.]分子靶向藥物依據腫瘤細胞與正常細胞之間分子生物學上的差 異，選擇性作用於靶細胞的基因、酶、信號傳導分子等，從而達到治 療的目的。雖然分子靶向藥物治療是一種理想的治療方式，但單藥使 用效果並不佳，尚存在許多問題。其中由於腫瘤細胞基因的不穩定性， 腫瘤細胞往往通過靶分子的調變或缺失逃避藥物的攻擊，致使分子靶 向藥物失去療效就是一個亟待解決的課題。近年來，研究者開始將目 光轉向基因組穩定的腫瘤間質細胞。在腫瘤間質中，成纖維細胞通過 與腫瘤細胞相互作用而活化，這種活化成纖維細胞被稱為腫瘤相關成 纖維細胞(Carcinoma-Associated Fibroblasts, CAF) [BhowmickNA， et al. Nature. 432(7015) :332-7. 2004.]。大量證據表明，CAF對 腫瘤的發生發展起著必要的支持促進作用，比如表達細胞因子、蛋白 酶及粘附分子等促進腫瘤浸潤與轉移[Tuxhorn JA， et al. Clin Cancer Res. 8(9) :2912-23. 2002.]。
鑑於CAF對於腫瘤發生發展 的重要性，選擇這群細胞為靶標，切斷其對腫瘤細胞的支持促進作 用，不失為提高腫瘤靶向治療有效性的必要措施。現已發現，腫瘤相 關成纖維細胞含有多種水解第二位由脯氨酸殘基形成的肽鍵的蛋白 酶，比如成纖維激活蛋白。這類蛋白酶通常存在於腫瘤組織，傷口愈 合組織，胚胎成纖維細胞[Niedermeyer J， et al. Int J CANCER. 71:383-389. 1997]，使腫瘤間質細胞具有與周圍正常組織不同的特 性。但現有技術中，阿黴素-二肽複合物的製備方法一般耗時較長，反應速率較低，產物的產率和純度也比較低。 發明內容本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種阿黴素-二肽復 合物的製備方法，弓i入可被腫瘤間質細胞表達的蛋白水解酶選擇性水 解的二肽來修飾阿黴素。本發明的技術方案是提供一種阿黴素-二肽複合物的製備方法，包括以下步驟(1) 稱取N-苄氧羰基甘氨醯脯氨酸(二肽)溶於N， N-二甲基甲醯胺(DMF)，加入氯甲酸乙酯，室溫下攪拌，加入三乙胺，室溫攪 拌，得到活化的二肽的溶液；(2) 鹽酸阿黴素溶於含有與之等物質的量的Et3N的DMF，加入 活化的二肽溶液，室溫攪拌，乙醚萃取反應產物，萃取液經旋轉蒸發 製得阿黴素-二肽複合物；(3) 採用柱層析法對阿黴素-二肽複合物進行純化。步驟(1)所述氯甲酸乙酯與N-苄氧羰基甘氨醯脯氨酸摩爾比為 1:1.2。步驟(l)所述所述加入氯甲酸乙酯後室溫下攪拌時間為10分鐘； 所述加入三乙胺後室溫攪拌時間為40分鐘。步驟(2)所述活化的二肽溶液的加入量為與鹽酸阿黴素的DMF 溶液等摩爾比。步驟(2)所述室溫攪拌時間為5 6小時。步驟(3)所述柱層析法的色譜條件為常規柱2.5X30 cm;固定 相為柱層析矽膠；流動相為7.5:1和5:1的乙酸乙酯-甲醇。產品通過薄層層析鑑定後，用高效液相色譜法(HPLC)檢測純度。本發明通過肽修飾技術，將含有脯氨酸殘基的二肽或多肽通過醯 化反應連接到阿黴素的氨基上，可以使阿黴素的毒性降低，同時這種 前體藥物在腫瘤間質細胞的作用下能釋放阿黴素，使阿黴素能富集到 腫瘤組織周圍，提高阿黴素對腫瘤組織的選擇性。本發明的有益效果是(1) 本發明提供的製備方法製備出的阿黴素-二肽複合物具有兩 方面的特點 一方面由於阿黴素氨基的封閉，阿黴素-二肽複合物比 其母藥阿黴素的毒性降低；另一方面，阿黴素-二肽複合物在腫瘤間質細胞的蛋白水解酶的作用下釋放出阿黴素，從而達到阿黴素被選擇 性釋放的富集功能，賦予了阿黴素-二肽複合物對正常組織低毒，對 腫瘤組織具有殺傷性作用的治療效果。(2) 本發明的方法簡單易行，反應速率高，耗時短，產物的純 度和產率比較高。


圖1血槳穩定性實驗結果 圖2腫瘤生長曲線圖3藥物毒性實驗中實驗動物體重變化曲線具體實施方式
下面結合附圖和具體實施例來進一步說明本發明。實施例1苄氧羰基甘氨醯脯氨醯阿黴素的合成(1) N-苄氧羰基甘氨醯脯氨酸的活化稱取26. 4 mg (86. 2 u inol)的N-苄氧羰基甘氨醯脯氨酸溶於1. 5 ml的N， N-二甲基甲醯胺(DMF)，加入9. 8 ul (86.2X1.2 = 103.4 umol)氯甲酸乙酯，室溫下攪拌10分鐘，加入14.5 ul (103.4 umol) 三乙胺，室溫攪拌40分鐘。(2) N-苄氧羰基甘氨醯脯氨醯阿黴素的製備稱取40mg (86.2 u mol)鹽酸阿黴素溶於1. 5 mL DMF中，向其 中加入12.5 ul (86.2 ymol)三乙胺並混勻。將溶解好的鹽酸阿 黴素溶液加入經上述活化的Z-GP溶液，室溫攪拌5 6小時；產物用 30 ml的乙醚(5倍於反應液體積)進行萃取，減壓抽濾棄去沉澱， 乙醚萃取液經旋轉蒸發即得粗品。(3) N-苄氧羰基甘氨醯脯氨醯阿黴素的純化 採用柱層析法對粗產品進行純化。色譜條件常規柱(2.5X30cm)。固定相柱層析矽膠；流動相乙酸乙酯-甲醇(7. 5: 1， 5:1)。 產品通過薄層層析鑑定，質譜確證(ES-MS : [M+K]+= 870)，用高效液 相色譜法(HPLC)檢測純度，純度達98%。實施例2苄氧羰基甘氨醯脯氨醯阿黴素(Z-GP-Dox)體外細胞毒性 實驗將K562， MOLT-4細胞接種在96孔板中，密度為10， 000/孔，將 含有0nM - 2nM的游離阿黴素或等摩爾濃度的Z-GP-Dox (溶劑是 DMS0)加到細胞中，或者將K562， MOLT-4細胞培養基替換成與上述游離阿黴素等摩爾濃度的Z-GP-Dox孵育過24小時和48小時的mEF 細胞培養基，分別於24小時和48小時後，通過MTT法檢測K562， M0LT-4的細胞存活率。從結果可得，Z-GP-Dox細胞毒性比Dox的IC50 分別減少4 7倍(K562細胞)和9 24倍(M0LT-4細胞)。而Z-GP-Dox 經與mEF細胞孵育後可恢復到與母體藥物相似的細胞毒性IC50，見 表l。表1 mEF細胞孵育前後Z-GP-Dox和Dox的細胞毒性比較(IC50)細胞株Dox (IC50)Z-GP-Dox (mEF細胞孵育前IC50)Z"GP-Dox (mEF細胞孵育後IC50)K56224小時0.22394 pM0.960753 pM0.355691 mM48小時0.04469 pM0.305835 mM0.09653 mMMOLT424小時0.04665 nM0.460327 nM0.05098 mM48小時0.01795 |iM0.440791 mM0.03879 nM實施例3苄氧羰基甘氨醯脯氨醯阿黴素(Z-GP-Dox)血漿穩定性實 驗含有0. 675 u M Z-GP-Dox分別在含有20%肝癌細胞，乳腺癌患者 血清和正常人血漿中6小時，12小時，24小時後，取上清作用於K562 細胞，MTT法檢測細胞存活率。結果顯示，在24小時後，細胞存活 率仍達70%以上，表明Z-GP-Dox在血清中裂解成細胞毒性母藥阿黴 素較少，在肝癌患者，乳腺癌患者和正常人的血清中是穩定的。見附 圖1所示。實施例4苄氧羰基甘氨醯脯氨醯阿黴素(Z-GP-Dox)體內抗腫瘤活 性實驗Balb/C小鼠每隻皮下接種106個4T1細胞，腫瘤移植荷瘤小鼠 隨機分為生理鹽水組，Dox組和Z-GP-Dox組，小鼠分別給與Dox (5mg/kg)和等摩爾的Z-GP-Dox (7. 164 mg/kg)，連續12天觀察腫瘤 大小，結果證明二肽修飾後的阿黴素與母藥阿黴素相比抗腫瘤活性變 化不大，仍與母藥有相似的療效，見附圖2所示腫瘤生長曲線。實施例5苄氧羰基甘氨醯脯氨醯阿黴素(Z-GP-Dox)體內毒性實驗按實施例4方法，分別在l， 2， 3， 4， 8， 12， 17， 20天測量小 鼠體重。結果發現二肽修飾後的阿黴素的體重變化不大，而阿黴素在 第八天體重開始下降，說明修飾後的阿黴素比母藥阿黴素毒性降低。 見附圖3所示藥物毒性實驗中實驗動物體中變化曲線。綜上所述，本發明所述的製備方法製備出的阿黴素-二肽複合物 母藥阿黴素相比，毒性降低；阿黴素-二肽複合物能被與腫瘤間質細 胞具有相似特性的小鼠胚胎成纖維細胞(Mouse Embryo Fibroblast, mEF)所表達的酶催化裂解出具有細胞毒性的阿黴素；阿 黴素-二肽複合物在肝癌患者，乳腺癌患者和正常人血清是穩定的； 通過4T1乳腺癌移植小鼠模型證實用本發明製備方法製備出的阿黴 素-二肽複合物與母藥阿黴素相比，毒性降低，抗腫瘤療效不變。
權利要求
1、一種阿黴素-二肽複合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟(1)稱取N-苄氧羰基甘氨醯脯氨酸溶於N，N-二甲基甲醯胺，加入氯甲酸乙酯，室溫下攪拌，加入三乙胺，室溫攪拌，得到活化的二肽的溶液；(2)鹽酸阿黴素溶於含有與之等物質的量的Et3N的DMF，加入活化的二肽溶液，室溫攪拌，乙醚萃取反應產物，萃取液經旋轉蒸發製得阿黴素-二肽複合物；(3)採用柱層析法對阿黴素-二肽複合物進行純化。
2、 根據權利要求1所述阿黴素-二肽複合物的製備方法，其特徵 在於步驟(1)所述氯甲酸乙酯與N-苄氧羰基甘氨醯脯氨酸摩爾比為 1:1.2。
3、 根據權利要求1所述阿黴素-二肽複合物的製備方法，其特徵 在於步驟(l)所述所述加入氯甲酸乙酯後室溫下攪拌時間為10分鐘； 所述加入三乙胺後室溫攪拌時間為40分鐘。
4、 根據權利要求1所述阿黴素-二肽複合物的製備方法，其特徵 在於步驟(2)所述活化的二肽溶液的加入量為與鹽酸阿黴素的DMF 溶液等摩爾比。
5、 根據權利要求1所述阿黴素-二肽複合物的製備方法，其特徵 在於步驟(2)所述室溫攪拌時間為5 6小時。
6、 根據權利要求1所述阿黴素-二肽複合物的製備方法，其特徵在於步驟(2)所述乙醚用量為5倍於反應液體積。
7、 根據權利要求1所述阿黴素-二肽複合物的製備方法，其特徵 在於步驟(3)所述柱層析法的色譜條件為常規柱2.5X30 cm;固定 相為柱層析矽膠；流動相為7.5:1和5:l的乙酸乙酯-甲醇。
8、 一種權利要求1所述製備方法製備得到的阿黴素-二肽複合物 在製備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種阿黴素-二肽複合物的製備方法，通過肽修飾技術，將含有脯氨酸殘基的二肽或多肽通過醯化反應連接到阿黴素的氨基上，可以使阿黴素的毒性降低，同時這種前體藥物在腫瘤間質細胞的作用下能釋放阿黴素，使阿黴素能富集到腫瘤組織周圍，提高阿黴素對腫瘤組織的選擇性。本發明反應速率快，耗時短，產物產率和純度較高。
文檔編號A61K31/704GK101274100SQ20081002638
公開日2008年10月1日 申請日期2008年2月20日 優先權日2008年2月20日
發明者鵬 劉, 卜憲章, 軍 杜, 謝白露 申請人:中山大學