一個高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系的製作方法

2023-06-01 12:08:41

一個高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一個能高產藥用天然產物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草的轉基因毛狀根株系。該株系是通過構建一個硬紫草乙烯合成的關鍵酶基因(LeACS-1)的植物過表達載體，然後將該載體轉入髮根農桿菌ATCC15834後侵染硬紫草無菌苗而獲得。該株系所產紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無菌苗所獲得的毛狀根株系的2.73倍。另外，該株系亦易於繁殖、生長迅速。本發明不僅可有效解決我國野外硬紫草資源日益短缺、人工栽培周期長、受氣候及地理條件等因素制約等問題，並且可高效大量生產硬紫草藥用天然產物。該高產株系將為利用硬紫草毛狀根工廠化生產硬紫草藥用天然產物提供材料支撐，具有廣闊的開發應用前景。
【專利說明】一個高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系

【技術領域】
[0001]本發明屬於植物基因工程領域，涉及將攜帶目的基因的植物表達載體轉入髮根農桿菌，然後再侵染硬紫草無菌苗而誘導出轉基因的毛狀根株系。

【背景技術】
[0002]硬紫草(Lithospermumerythrorhizon sieb.et zucc)是我國一種重要的藥用植物，其根部可合成紫紅色的萘醌類藥用天然產物一紫草寧及其衍生物(以下簡稱紫草寧)，這類物質具有抗菌、消炎、活血等功效，而且還是一種珍貴的天然色素，可以廣泛用於食品、高級化妝品、日化產品與塑料製品的著色等[1_3]。近年來國內外的研究還發現紫草寧通過活化Caspase-3和抑制拓撲異構酶活性來誘導癌細胞凋亡，被認為是繼喜樹鹼、紫杉醇之後又一類極具潛力的天然抗菌消炎、抗腫瘤、抑制HIV病毒等多種藥理活性的藥物
[4-6]
O
[0003]我國紫草有新疆紫草、東北硬紫草、內蒙紫草、滇紫草、廣西紫草等。近年來，隨著環境的變化及人類的過度消耗，各種紫草資源正面臨枯竭。如野生於東北長白山脈荒山坡地及內蒙古草原地帶，因近十幾年對荒山宜林地的開發利用及大量放牧，野生紫草資源日見減少，只有零星少量分布，目前東北野生紫草已無法大貨供應市場。
[0004]隨著現代生物技術的發展，採用生物工程學手段生產人類所需的紫草寧，成為一種非常重要的替代手段。上世紀70年代，日本即已成功利用兩階段培養法，即在光照條件下B5固體培養基上繁殖紫草細胞，然後在黑暗條件下利用M9液體生產培養基中培養紫草細胞進行工業化生產紫草寧，紫草也從而成為世界上第一個採用細胞培養體系來商業化生產藥用天然產物的藥用植物[7]。但在實踐過程中發現，用細胞生產紫草寧存在誘導愈傷細胞困難、細胞易於老化褐化、紫草寧產量不高、產量不穩定、夏季不產紫草寧等諸多問題。
[0005]髮根農桿菌是在植物基因工程中廣泛應用的一種侵染性很強的根瘤菌科農桿菌屬革蘭氏陰性菌，其攜帶的Ri質粒能有效侵染絕大多數雙子葉植物，少數單子葉植物以及個別裸子植物，誘發植物產生形狀如根系的髮根即毛狀根(hairy root)。由於髮根農桿菌轉化的毛狀根具有生長速度快、分支多，能夠持續合成次生代謝產物，獲得的次生代謝產物量高且穩定、不需要添加外源植物激素等特點，因此可作為生產和研究植物次生代謝物質的生物反應器；同時，由於髮根農桿菌攜帶的Ri質粒能將外源基因整合到寄主染色體、其誘導產生的毛狀根易獲得再生植株等優點，因此，建立特定植物的轉基因毛狀根體系，在定向分子育種方面具有廣泛應用前景。近年來利用髮根農桿菌已轉化大約160多種植物，在40多種植物建立了毛狀根培養體系，特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉基因體系，極大地方便了藥用天然產物生產及遺傳育種研究。
[0006]紫草寧的合成受到多種物理和化學因素的影響，如無機鹽離子、光、乙烯和茉莉酸等[8_1(1]。乙烯是一種能調控植物生長發育、抗逆境脅迫反應等多個方面的氣態類激素，通過改變乙烯濃度，或者改變植物乙烯信號傳導途徑中關鍵基因的表達，可以改變植物天然產物的合成量，如改變菸草ERF189及ERF163表達，可直接促進菸草生物鹼的合成[11];研究表明，乙烯同樣是調控紫草寧合成的一種重要的物質[12]。
[0007]ACC合酶(ACC synthetase, ACS)能催化乙烯合成的前體1-氨基環丙燒_1_羧酸(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid, ACC),最終形成乙烯，是乙烯合成途徑的關鍵限速酶。通過轉基因技術將紫草本身的ACS基因轉入紫草中過表達，從而獲得高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系，在理論上是完全可行的。
[0008]通過轉基因技術獲得高產藥用天然產物的紫草毛狀根株系，不僅在系統研究紫草藥用天然產物生物合成途徑及其分子調控機制方面具有重要的理論意義，並在商業化生產紫草藥用天然產物方面具有非常重要的應用前景和價值。儘管目前國內外有利用紫草毛狀根合成紫草寧的研究，但並無將紫草ACS基因轉入髮根農桿菌，誘導出能高效合成紫草藥用天然產物的紫草轉基因毛狀根並提高紫草寧合成的相關報導。


【發明內容】

[0009]本發明需要解決的問題是通過轉基因技術獲得一個高產藥用天然產物的硬紫草轉基因毛狀根株系，主要是通過將所選擇的目的基因(硬紫草ACC合酶基因LeACS-1)轉入髮根農桿菌，然後侵染硬紫草無菌苗，高效誘導出含目的基因的硬紫草毛狀根，對獲得的轉基因毛狀根擴大培養並進行分子鑑定和藥用天然產物含量檢測。
[0010]本發明的技術方案包括如下步驟:
[0011](I)硬紫草無菌苗培養:選取飽滿的硬紫草種子，清洗後置於4°C環境中培養，直至種子發芽；挑取剛發芽的種子，用6%的次氯酸鈉消毒後，無菌水洗乾淨；置於MS培養基培養一定數量的紫草無菌苗。一個月後，當紫草無菌苗生長到一定高度後作為誘導毛狀根的外植體。
[0012](2)轉基因侵染菌液製備:高保真酶擴增目的基因ACC合成酶LeACS-1，將獲得的目的片段與真核表達載體PBI121連接，將連接產物用凍融法轉化髮根農桿菌ATCC15834感受態細胞；挑取陽性克隆，用YEB液體培養基擴增至0D600 = 0.5時，添加AS(乙醯丁香酮)，作為轉基因侵染菌液。
[0013](3)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根:用接種針蘸上述活化的具有侵染特性的轉基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節處2-3次；將侵染的無菌苗轉移到MS固體培養基上於26°C黑暗培養。10-15天左右即可發現侵染部位出現白色突起，2天後在侵染部位的白色突起長出絨毛狀根系，然後長出一條或多條毛狀根。
[0014](4)硬紫草轉基因毛狀根的培養:剪取長度約Icm的毛狀根，轉入MS+500mg/L頭孢黴素的固體除菌培養基，再過一星期轉入MS+250mg/L頭孢黴素除菌培養基，直至除去殘留的髮根農桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基擴大培養；將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基擴大培養。
[0015](5)轉基因毛狀根分子鑑定:分為分子鑑定和螢光鑑定2個部分。取一定數量毛狀根，PCR方法檢測農桿菌Ri質粒中RolC基因，判斷是否為毛狀根，再檢測綠色螢光蛋白，驗證是否是硬紫草轉基因毛狀根。
[0016](6)紫草寧合成及測定:將鑑定的轉基因紫草毛狀根轉入M9液體培養基，置於26°C黑暗培養，一周後紫草寧含量即可達到很高濃度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計測定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根(只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根)為對照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0017]本發明與現有技術相比，其有益效果是:
[0018]如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧的培養體系，已經成為紫草寧藥用研究及大量商業化應用的一個制約因素。至今未見通過毛狀根體系轉入LeACS-1外源目的基因來提高紫草寧合成產量的相關文獻報導。本發明首次將一個紫草乙烯合成的關鍵酶基因LeACS-1轉入植物表達載體，將該載體轉入髮根農桿菌後再轉入紫草無菌苗，高效誘導出紫草轉基因毛狀根；獲得的硬紫草轉基因毛狀根中紫草寧含量較野生型紫草毛狀根大大提高。該方法可克服紫草愈傷細胞誘導、培養困難，細胞易於老化褐化、紫草寧產量不高、產量不穩定、夏季不產紫草寧等諸多問題；解決了利用愈傷細胞進行遺傳轉化存在的周期長，轉化效率偏低等問題，轉基因毛狀根誘導和繁殖不受外界環境、季節和紫草花性等因素制約，大大提高紫草轉基因效率；轉入的LeACS-1基因有助於紫草乙烯信號傳導機制及藥用天然產物合成的分子調控機制研究，對紫草功能基因鑑定和研究及分子育種具有重要指導意義，對其他轉基因困難的木本植物提供了可靠的借鑑方法；獲得的轉基因毛狀根紫草寧高產株系具有廣闊的開發應用前景和商業價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1針刺莖節法誘導出的轉LeACS-1基因的硬紫草毛狀根
[0020]圖2轉基因毛狀根在B5固體培養基培養
[0021]圖3轉基因毛狀根在B5液體培養基擴大培養
[0022]圖4轉LeACS-1基因硬紫草毛狀根RolC基因檢測
[0023]圖5轉LeACS-1基因硬紫草毛狀根螢光檢測
[0024]圖6轉基因毛狀根在M9固體培養基培養
[0025]圖7轉基因毛狀根紫草寧及其衍生物含量測定及比較

【具體實施方式】
[0026]實施例1、轉硬紫草LeACS-1基因毛狀根的誘導
[0027](I)硬紫草無菌苗培養:選取飽滿的硬紫草種子，無菌水清洗後置於4°C環境中黑暗培養1-2個月，直至種子發芽；挑取剛發芽的種子，清水洗乾淨；用6%的次氯酸鈉浸泡5min，再用無菌水洗幾次；置於MS基本培養基，26°C _28°C光照培養，獲得一定數量的紫草無菌苗。一個月後，當紫草無菌苗生長到8-lOcm後，作為誘導毛狀根的外植體。
[0028](2)轉基因侵染菌液製備:利用將pBI121載體中的GUS基因片段用綠色螢光蛋白eGFP基因片段代替後的改造載體；根據GenBank公布的紫草LeACS-1序列(GQ246184.1)設計引物 ACS-OE-F:5 ' -CATTCTAGAATGGAACATAACAAGAAGCAACACCAACT-3 ' ;ACS-OE-R:5 ' -CATAGATCTTTGAACAAGTGGTGAAGACATTGGAGAAT-3 '，高保真酶擴增目的片段；將獲得的目的片段切膠回收，並與pBI121-eGFP載體連接，構建pBI121-LeACS-l-eGFP質粒；將PBI121-LeACS-l-eGFP質粒用凍融法轉化髮根農桿菌ATCC15834感受態細胞；挑取陽性克隆，轉入YEB液體培養基，在26-28 °C，180rpm的搖床中擴增至0D600 = 0.5時，添加200 μ L/L的AS，作為轉基因侵染菌液。
[0029](3)針刺莖節法誘導硬紫草轉基因毛狀根:用接種針蘸上述活化的具有侵染特性的轉基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節處一下，每株共穿刺2-3次；將侵染的無菌苗轉移到MS固體培養基上於26°C黑暗培養。10-15天左右即可發現侵染部位出現白色突起，2天後在侵染部位的白色突起長出絨毛狀根系，然後長出一條或多條毛狀根(圖1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法，誘導出紫草野生型毛狀根，作為對照材料。
[0030]實施例2、轉硬紫草LeACS-1基因毛狀根的培養
[0031](I)毛狀根除菌培養:誘導出來的毛狀根經過一星期的生長，剪取長度約Icm的毛狀根，轉入MS+500mg/L頭孢黴素的固體除菌培養基，再過一星期轉入MS+250mg/L頭孢黴素，直至除去殘留的髮根農桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉入B5固體培養基培養(圖2);
[0032](2)毛狀根擴大培養:將固體擴大培養的毛狀根轉入B5液體培養基，10rpm的搖床中光照擴大培養(圖3)。
[0033]實施例3、轉硬紫草LeACS-1基因毛狀根的鑑定
[0034]分為分子檢測和螢光檢測2個部分。取一定數量毛狀根，CTAB法提取毛狀根 DNA 為模板，設計引物 rolc-F:5』 -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3，；rolC-R:5』 -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3』，用PCR方法擴增，以硬紫草基因組DNA為對照，擴增產物測序比對，檢測轉基因毛狀根中農桿菌Ri質粒中RolC基因存在與否，隨機選取的3個擴大培養硬紫草毛狀根株系，均檢測到RolC基因的存在(圖4)，說明獲得的均為毛狀根；同時上述株系中長度約2-3_的毛狀根，製作成切片，用雷射共聚焦顯微鏡檢測螢光，結果顯示均檢測到螢光(圖5)，表明所擴大培養的紫草毛狀根均為轉基因毛狀根。
[0035]實施例4、轉硬紫草LeACS-1基因毛狀根紫草寧含量測定
[0036](I)將驗證為轉入目的基因的轉基因硬紫草毛狀根及野生型毛狀根轉入M9液體培養基，置於26°C、100rpm的搖床中黑暗培養，一周後紫草寧含量即可達到很高濃度(圖6)；
[0037](2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計測定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根為對照，計算轉基因毛狀根中紫草寧含量變化(圖7)。紫草寧含量總量包括紫草細胞或毛狀根和分泌到M9培養基中的紫草寧含量總和。具體方法如下:稱取在M9培養體系中的毛狀根，並取一定量的含有分泌的紫草寧的M9培養基，用石油醚浸泡，反覆提取紫草寧，直到提取液無色，合併提取液，紫外分光光度計測定0D520的吸光值，由下列方程得到紫草寧含量:紫草寧含量(mg/gFW) = 41.66X0D520X稀釋倍數。
[0038](3)紫草寧含量測定顯示，所得到的這一個轉LeACS-1基因的硬紫草毛狀根中紫草寧含量比野生型毛狀根中的含量提高2.73倍，而且該株系具有生長速度快、繁殖容易的特點，適於商業化生產所用，命名為LeACS-1-1ine-001。
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【權利要求】
1.一個高產藥用天然產物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉LeACS-1基因毛狀根株系ο
2.權利要求1中所述的硬紫草轉基因高產株系的商業化應用。
【文檔編號】A01H5/00GK104278050SQ201310286872
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2013年7月10日
【發明者】戚金亮, 楊永華, 方榮俊, 劉靜, 趙胡, 趙華, 黃守程, 王小明, 楊榮武, 陸桂華 申請人:南京大學