抗旱的轉錄因子的轉錄調節和轉錄後調節的製作方法

2023-06-01 16:10:41

專利名稱：：抗旱的轉錄因子的轉錄調節和轉錄後調節的製作方法抗旱的轉錄因子的轉錄調節和轉錄後調節相關申請的交叉引用本發明要求2008年4月30日提交的美國臨時申請號61/048，996的優先權，其公開內容通過引用併入本文。關於聯邦資助的研究的聲明本發明得到來自國家衛生研究所的資金的資助，資金號RO1GM059138。政府對本發明享有一些權利。
背景技術：
：乾旱脅迫是全世界限制作物生產力的主要環境因素。為了減少乾旱脅迫的不利影響，植物已經進化出了多種策略，包括形態的、生理的和生化的適應(Bohnert等人，2006；Shinozaki等人，2003;Xiong等人，2002;Zhu，2002JngramandBartels，1996)。這些策略中的一些旨在通過增加水吸收或減少水的損失避免脫水脅迫，而其他的策略在當水被耗竭並且組織脫水變得不可避免時尋求保護植物細胞免受傷害(Verslues等人，2006)。基因表達的變化在植物乾旱脅迫應答中發揮重要的作用並且許多脅迫誘導的基因是已知的或被認為在抗旱中具有作用。對於許多的這些基因，激素脫落酸(ABA)是控制它們表達的關鍵信號中間體。這已經主要通過分析ABA缺失和ABA增強的擬南芥突變體得到了證實(Koornneef等人，1998)。許多環境因素影響植物生長和結果，其中土壤鹽度和乾旱有害影響最大。非生物應激導致主要作物大約70%的遺傳產量潛力喪失，並且絕大多數主要農作物對乾旱脅迫敏感。通過植物育種增加應激條件下的產量的努力在很大程度上是不成功的，這主要是由於適應性反應的多基因來源(Barkla等人，1999，AdvExpMedBiol464:77-89).
發明內容本公開證實了NFYA5的過表達增加乾旱抗性。本公開提供了NFYA5在乾旱抗性中的作用部分涉及其在保衛細胞中的表達和氣孔孔徑的控制。另外，NFYA5在許多組織中廣泛表達。在非保衛細胞中，NFYA5可能對於通過其在激活靶應激反應基因(諸如涉及氧化應激反應中的基因)中的作用的脫水耐受是重要的。AtNFTOl的候選靶基因與應激耐受沒有明顯的關聯，並且它們中的一些似乎與多糖代謝機制相關。NFYA5與AtNFTOl的靶基因缺少實質性重疊表明這兩個轉錄因子可能參與不同的基因調節子。轉錄誘導解釋了在乾旱脅迫下的部分的NFYA5轉錄物積累。ABA參與了轉錄調節，因為ABA導致NFYA5轉錄物積累和其激活NFYA5啟動子活性。乾旱脅迫下的NFYA5調節的特徵是miRNA的參與。本文提供的數據證實了miR169抑制NFYA5轉錄物的積累。乾旱脅迫下調miR169表達，由此減緩miR169對NFYA5的抑制。miR169由許多基因座表達。這些基因座中只有兩個，MIR169a和MIR169c基本上被乾旱脅迫下調。本公開顯示，儘管miR169a和miR169c與NFYAmRNA都有三個錯配，但是miR169a而不是miR169c在抑制NFYA5轉錄物積累中起主要作用。在乾旱脅迫對MIR169a和MIR169c的下調中，需要ABA。因此，ABA參與了NFYA5的轉錄調節和轉錄後調節。ABA和乾旱脅迫對MIR169a和MIR169c的下調可能涉及在兩個基因座的轉錄抑制。乾旱脅迫經miRNA不僅在轉錄水平上而且在轉錄後水平上調節NFYA5。這種雙水平的調節與NFYA5對乾旱抗性的重要性一致。NFYA5和miR169兩者在水稻上高度保守(Jones-Rhoades和Bartel，2004)，因此NFYA5的調節的雙模也適用於其它植物。本公開提供了包括NFY5A多核苷酸、其同系物或直向同源物的分離的多核苷酸，它們可操作地連接到異源啟動子。在一個實施方案中，NFY5A包括與由SEQIDN0:l、3、5或7構成的多核苷酸具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%的同一性。在另一個實施方案中，NFY5A多核苷酸編碼包含SEQIDNO:2的多肽。在另一個實施方案中，異源啟動子包括組成型啟動子或誘導型啟動子。在一個方面，組成型啟動子是花椰菜花葉病毒35S或19S啟動子或植物ACT2啟動子或植物泛素啟動子。在另一個方面，組成型啟動子是來自擬南芥(Arabidopsisthaliana)的肌動蛋白2啟動子。在另外的方面，誘導型啟動子包括光誘導啟動子。本公開也提供用上述的多核苷酸轉化的植物細胞。本公開也提供了轉基因植物，該轉基因植物以比野生型植物高的水平表達NFY5A多核苷酸並且具有增加的乾旱抗性。本公開還提供了缺乏NFY5A基因、其同系物或直向同源物的3『UTR的轉基因植物。本公開提供了基因組缺乏功能miR169多核苷酸的轉基因植物。例如，該轉基因植物基因組中可以缺乏功能miR169a或miR169c多核苷酸。本公開也提供了使用上述的多核苷酸來產生抗旱的植物的方法，包括步驟將多核苷酸或構建物導入植物細胞或植物組織，篩選多核苷酸分子的存在以產生轉基因植物細胞或轉基因植物組織和從轉基因植物細胞或轉基因植物組織再生植物，由此產生抗旱植物。在一個實施方案中，所述多核苷酸包括可操作連接到異源啟動子的編碼NFY5A多肽的序列。在另一個實施方案中，所述多核苷酸包括在植物細胞中減少mirl69a或mirl69c的表達或提供mirl69a或mirl69c的補體或敲除mirl69a或mirl69c的構建物。本公開也提供了鑑定用於改變植物抗旱的製劑的方法，包括接觸含有NFY5A基因的植物與製劑；測量細胞中該基因表達的變化或存在的mRNA的量的變化；其中與對照相比表達或轉錄物水平的變化指示了改變抗旱的製劑。本公開也提供了鑑定用於改變植物抗旱的製劑的方法，包括接觸植物與製劑，所述植物包含可操作連接到報告基因的TN(C/A)TTNGN(C/A)CANT(SEQIDNO60)序列；測量報告基因表達的變化；其中與對照相比報告基因表達的變化指示了改變抗旱的製劑。本公開提供了增加植物耐旱的方法，包括接觸植物與增加(1)NFY5A基因、其同系物或直向同源物和/或(表1所列基因的表達的製劑。本公開的一個或多個實施方案的細節與附圖和以下描述被描述。從該說明書、附圖以及權利要求中可清楚地知曉其它特徵、目標和優點。圖IA-B顯示了脫水和ABA對NFYA5表達的調節。(a)通過實時RT-PCR分析擬南芥幼苗響應脫水和ABA的NFYA5基因轉錄物的積累。表達水平對TubS的表達水平進行歸一化。誤差線是三次重複的SD。(b)檢測ABA缺乏突變株或信號突變株中的NFYA5mRNA。野生型(WT)和突變株用足量的水培養3周，接著控水10天。接著負載來自各樣品的20yg總RNA並與標記的全長NFYA5cDNA探針雜交。TubS用作負載對照，並且每個泳道下的數字指示相對於TubS的表達水平。圖2A-D顯示NFYA5表達圖譜和轉錄調節。(a)將MS瓊脂培養基上的兩周轉基因苗子接受池的脫水處理或8小時的ABA處理，接著染色進行GUS活性分析。(b)在不同組織中的NFYA5p:⑶S表達圖譜。在葉片維管組織(I)和保衛細胞(II)中染色是顯著的。在花序的花組織(III)和根維管組織(IV)中染色也是可見的。(c)NFYA5轉錄物積累的組織圖。總RNA分離自4周大小的生長在長日照生長條件下野生型植物的多個組織中。將實時RT-PCR定量結果對18SrRNA的表達進行歸一化。結果代表三次重複的SD。(d)NFYA5的亞細胞定位。NFYA5-YFP融合構建物在CaMV35S啟動子的控制下在轉基因擬南芥中表達，在共聚焦顯微鏡下觀察植物的根。在暗視野中對黃螢光照相(I)，在亮視野中對細胞的形態照相(II)和二者的結合(III)。圖3A-D顯示乾旱脅迫下調與NFYA5mRNA互補的2Int小RNA。(a)NFYA5和AtlgM150的順反義基因對的圖。框中為外顯子，框之間的線表示內含子。箭頭指示小RNA的靶位置。(b)乾旱脅迫和ABA處理對小RNA的調節。TORNA用於探針檢測負載對照。每個泳道下的數字指示相對表達率。(c)在各個RNA沉默突變體中小RNA的積累。每個泳道上載40微克來自各樣品的小RNA並用對應於ASRP1815序列的32P-標記的寡核苷酸探針雜交。miR172、siR255和U6作為負載對照顯示。(d)在dcll_7、henl和hyll以及它們相應的野生型中的NFYA5mRNA水平。將表達水平對Tub8的表達水平歸一化。結果代表三次重複的SD0圖4A-E顯示NFYA5主要被miR169a調節。(a)通過實時RT-PCR檢測響應乾旱脅迫的MIR169家族的前體轉錄物。將定量數據對TubS表達歸一化。結果代表三次重複的SD。(b)NFYA5表達構建物圖。以小寫字母顯示在NFYA5靶位置導入的突變(SEQIDNOs:80和81)。3，UTR中黑框顯示miRNA的靶位。(c)在菸草本塞姆氏(N.Benthamiana)中miR169和NFYA5表達構建物的各組合的共表達。作為對照，NFYA5也與不相關的YFP構建物共表達。實時RT-PCR定量數據對菸草18SrRNA的表達歸一化。結果代表三次重複的SD。(d)在轉基因擬南芥中miR169a和miR169c的過表達。Northern印跡分析野生型和兩個代表轉基因系中的miR169a和miR169c水平。miR171作為負載對照顯示。每個泳道下方的數字指示相對表達率。(e)實時RT-PCR檢測35S:MIR169轉基因植物中相應的NFYA5基因轉錄物。將定量數據對Tub8的表達歸一化。結果代表三次重複的SD。圖5A-D顯示!35S::MIR169a植物對乾旱脅迫更加敏感。(a)!35S::MIR169a過表達擬南芥對乾旱脅迫更加敏感。野生型(Col)和5S::MIR169a植物在含有充足水分的土壤中生長3周，接著控水8天。顯示了代表性的圖片。對照，沒有控水。(b)測量在野生型和35S::iOR169a植物中氣孔孔徑。數據是三個獨立實驗的寬長之比士SE(n=40-50)。(c)來自野生型和35S::MIR169a植物的分離的葉子的水損失。水損失表達為初始鮮重的百分比。值是四次獨立實驗各10個葉子的平均值。(d)經或沒經乾旱處理8天的擬南芥葉片中花青苷含量。結果代表四次重複的SD值。圖6A-E顯示nfya5突變株植株對乾旱脅迫更加敏感。(a)是NFYA5基因座中T-DNA插入位點和通過Northern印跡分析檢測NFYA5mRNA的示意圖。外顯子為框，框之間的線代表內含子。負載20微克來自各樣品的總RNA並用32P-標記的全長NFYA5探針雜交。相應的溴化乙錠染色的rRNA顯示為負載對照。(b)nfya5突變植株對乾旱脅迫更加敏感。野生型(Col)和nfya5植株生長在含有充足水分的土壤中3周，接著控水8周。顯示了代表性的圖片。(c)測定在野生型和nfya5突變植株中的氣孔孔徑。數據是三次獨立實驗的寬比長的平均比士SE(n=40-50)。(d)野生型和nfya5突變株植株的分離的葉子的水損失。水損失表示為初始鮮重的百分比。值是四次獨立實驗各10片葉子的平均值。(e)經或沒經乾旱處理8天的擬南芥葉片中花青苷含量。結果代表四次重複的SD值。圖7A-E顯示在35S::NFYA5植株中增加的抗旱性。(a)檢測35S::NFYA5轉基因擬南芥中的NFYA5mRNA。將實時RT-PCR定量值對Tub8的表達歸一化。結果代表三次重複的SD。(b)35S::NFYA5植株的抗寒性(品系2、3和5)。野生型和35S::NFYA5擬南芥植株在含有充足水分的土壤中生長3周，接著控水14天。顯示了代表性的圖片。(c)測定在野生型和35S::NFYA5-3轉基因植株中的氣孔孔徑。數據是三次獨立實驗的寬比長的平均比士SE(n=40-50)。(d)野生型和35S::NFYA5_3植株的分離的葉子的水損失。水損失表示為初始鮮重的百分比。值是四次獨立實驗各10片葉子的平均值。(e)經或沒經乾旱處理14天的擬南芥葉片中花青苷含量。結果代表四次重複的SD值。圖8顯示擬南芥NFYA家族成員的保守區域的序列比對(從上而下分別為SEQIDNO63-71)。圖9顯示對35S:MIR169b和!35S:MIR169h轉基因株系中miR169和NFYA5mRNA水平的分析。將NFYA5轉錄物水平的實時RT-PCR定量值對Tub8的表達歸一化。結果代表三次重複的SD。圖10顯示對野生型和35S::NFYA5轉基因植株中轉錄物水平的分析。實時RT-PCR用於分析指定的基因座的表達水平。誤差棒指示SD(n=3)。圖IlA-B顯示對來自擬南芥、小麥和兩個水稻品系(0s_J(SEQIDNO:72)、0s_I(SEQIDNO74)、小麥(SEQIDNO:76)、擬南芥(SEQIDNO:78))的NFYA5的DNA比對。圖12顯示本公開的序列(SEQIDNO:1、2、61和62)。具體實施例方式如此處和所付權利要求所用，單數形式「一」、「和」和「所述」包括複數形式，除非上下文明確表示其它。因此，例如，「多核苷酸」包括多個所述多核苷酸，「肽」包括一個或多個肽等。另外，「或」的使用表示「和/或」除非另外說明。類似的，「包括」、「包含」可以互換使用，並且不旨在限制。可以進一步理解，當各實施方案使用術語「包括」時，本領域技術人員會理解在一些具體的情況下，實施方案可以替代性地使用語言「基本上由…組成」或「由…組成」描述。除非另外說明，此處所用的所有科技術語具有本公開所屬
技術領域：
的技術人員通常所理解的含義。儘管與本文所述相似的方法和材料可以用於實施所公開的方法和組合物，但是本文仍然描述了示例性的方法、裝置和材料。上文和全文所述的任何出版物僅由於它們的公開內容先於本申請的申請日被提供。在本文中沒有任何內容被理解為承認發明人沒有權利利用現有技術公開而先於這些公開。乾旱脅迫下的基因調節通過多個轉錄級聯被介導(3ηι，2002；Yamaguchi-Shinozaki和Shinozaki，2006)。在這些級聯中的每一個中，轉錄因子基因被誘導，其依次來激活或抑制對抗旱重要的下遊靶基因。一些應激調節的基因編碼在調節對另外的其它下遊基因重要的調節蛋白，諸如轉錄因子(Singh等人，2002)。在擬南芥中，乾旱脅迫誘導AP2/ERF、bZIP、NAC、HD-ZIP和MYB/MYC家族中的成員以及幾類鋅指結構域蛋白(Shinozaki等人，2003；Zhang等人，2004)。在多種情況下，已經證實改變轉錄因子的表達能夠通過激活下遊靶基因改變應激抗性。這方面的例子有CBFs/DREBs、NACs和RING-H2鋅指蛋白(Jaglo-Ottosen等人，1998；Kasuga等人，1999；Hu等人，2006；Ko等人，2006)。研究已聚焦在鑑定導致應激抗性的遺傳因素和基因構建應激抗性增加的作物。已經通過不同的機制鑑定了一些表達或改變表達與乾旱脅迫相關的基因。例如表達玉米NADP-蘋果酸酶的轉化菸草顯示比野生型植株保水性增加和獲得更大的乾物質/水消耗(Laporte等人，2002，JExpBot53:699-705)。大量的研究努力集中在植物激素脫落酸(ABA)，其涉及適應不同的環境應激。過表達酶9-順-環氧類胡蘿蔔素雙加氧酶(NCED)(其對ABA生物合成是關鍵的)的轉基因菸草和轉基因擬南芥顯示抗旱性增加Oiin等人，2002，PlantPhysiol128:544-51;Iuchi等人，2001，PlantJ27:325-33)幹耐旱性常與耐鹽性相連，因為這兩者都與滲透勢和膨壓的調節有關。因此，過表達液泡H+泵(H+-焦磷酸酶)_其產生跨液泡膜的質子梯度的轉基因植株顯示增加的乾旱應激和鹽應激，這是由於增加的溶質積累和水分保持(Gaxiola等人，2001，ProcNatlAcadSciUSA98:11444-9)。海藻糖也助於滲透保護免受環境應激。錯表達海藻糖-6-磷酸合成酶(海藻糖生物合成的關鍵酶)的馬鈴薯植株顯示增加的抗旱性(Yeo等人，2000，MolCells10:263-8)。轉錄水平的基因表達的調節在植物的發展和生理狀態中發揮重要的作用。隨著小RNA的發現，對通過小RNA的轉錄後基因的調節的重要性的關注已經增加(Carrington和Ambros,2003；Bartel,2004；Tang,2005)。這些小RNA包括20-24個核苷酸(nt)微RNA、21nt反式激活siRNA、24nt重複連接的siRNA和21或24ntnat_siRNA。miRNA從髮夾前體通過核糖核酸酶III樣的酶切酶加工而來。siRNA不同於miRNAs，因為它們產生自長的雙鏈RNA。植物miRNA參與各種發育過程，包括開花、葉片和根發育，胚胎發育和生長素信號轉導(Allen等人，2005；Carrington和Ambros，2003；Bartel,2004Jones-Rhoades等人，2006)。最近，研究發現在蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，miR169調節共生根瘤發育(Combier等人，2006)。微RNA在植物對生物應激和非生物應激(諸如硫酸鹽和磷酸鹽營養缺乏)以及氧化應激的反應中也發揮重要的作用(Jones-I^hoades和Bartel，2004；Fujii等人，2005；Sunkar等人，2006；SunkarandZhu，2007)。nat_siRNA被證實調節擬南芥的耐鹽性和抗病性(Borsani等人，2005；Katiyar-Agarwal等人，2006)。然而，儘管小RNA的抗旱重要性，但是迄今為止，沒有關於小RNA調節乾旱脅迫響應的報導。擬南芥已經充當模型系統用於鑑定助於耐旱的基因。例如，研究者已經鑑定了響應於水缺乏而被誘導的許多基因(例如，iTaji等人，1999，PlantCellPhysiol40:119-23;Ascenzi等人，1997，PlantMolBiol34:629-41；Gosti等人，1995，MolGenGenet246:10-18；Koizumi等人，1993Gene129:175-82)和控制ABA或應激反應基因表達的稱為ABA反應元件(ABREs)順反DNA序列(Giraudat等人，1994，PlantMol.Biol26:1557)。已經鑑定了幾個擬南芥耐旱突變株。這些突變株包括隱形突變株abhl(Hugouvieux等人，2001，Cell106:477)、eral-2(Pei等人，1998，Science282286)和abil-IRi(Gosti等人，1999，PlantCell11:1897-1909)。這些突變株eral-2和abhl通過篩選對ABA超敏的苗子鑑定，而突變株abil-IRi作為ABA不敏感的突變株abil_l的基因內抑制物分離。顯性耐旱突變株通過過表達ABF3、ABF4(Kang等人，2002，PlantCell14:343-357)或DREBlA(Kasuga，1999NatureBiotech17:287)鑑定。ABF3禾口ABF4編碼鹼性區亮氨酸拉鏈(bZIP)DNA結合蛋白，其特異性結合ABRE。DREBlA編碼具有結合對失水響應表達重要的失水響應元件(DRE)的EREBP/AP2DNA結合結構域的蛋白(Liu等人，1998，PlantCell10:1391)。通過過表達大豆BiP基因獲得菸草顯性耐旱表型(Alvim等人，2001，PlantPhysiol126，1042)。本公開證實NFYA5是這些乾旱脅迫轉錄級聯的部分。該轉錄級聯對抗旱是重要的，因為35S::MIR169a和nfya5突變植株對乾旱脅迫是超敏的。本公開證實了NFYA5被至少兩個miRNA分子(mirl69a和c)轉錄後下調。此外，本公開證實了NFY5A多肽的過表達促進耐旱。表達或過表達可以通過用以下途徑獲得(a)野生型NFY5A的轉錄調節(例如，通過使用nfyfe多核苷酸連接到組成型或誘導型啟動子)，(b)表達缺乏與mirl69a或mirl69c相互作用的結構域的突變nfy5a；或(c)通過抑制或敲除mirl69a和mirl69c之一或兩者的表達。因此，本公開提供了產生具有增加的耐旱的轉基因植物的方法和組合物以及改變植物耐旱的方法。和因子Y(NF-Y)是通用的轉錄因子，其對存在於25%的真核基因啟動子中的CCAAT盒具有高的親和力和序列特異性。NF-Y是一個異源三聚體複合物，其由NF-YA(也稱為CBF-B或HAP2)、NF-YB(CBF-A或HAP3)和NF-YC(CBF-C或HAP5)組成。在哺乳動物中，NF-YB和NF-YC通過組蛋白摺疊基序緊密地二聚，接著在DNA結合前NF-YA相連，並且伴隨NF-YA介導的三聚體序列特應性的相互作用(Mantovani，1999)。NF-YA和NF-YC亞單位含有對激活轉錄重要的富含穀氨醯胺和疏水殘基的大結構域(Mantovani，1999)。在動物和酵母中，NF-Y的各亞單位由單個基因編碼，然而，擬南芥基因組編碼10個NF-YA、13個NF-YB和13個NF-YC(Gusmaroli等人，2002)。已經證實AtNFYB9(LECl)在胚的發育中具有關鍵的作用(Lee等人，200。最近，在擬南芥和玉米中AtNFYBl的過表達被證實顯著地增加了乾旱脅迫條件下的抗旱和產量(Nelson等人，2007)。然而，植物中大多數NF-Y家族成員的生物學作用是未知的。本公開提供的數據證實幹旱脅迫和ABA處理強烈地誘導了擬南芥NF-YA家族中的成員AtNFYA5的表達。啟動子GUS分析表明該誘導的部分發生在轉錄水平；然而，只有轉錄調節不能解釋乾旱脅迫或ABA處理後發現的高水平的NFYA5轉錄物。本公開進一步證實NFYA5含有miR169的靶位點，和乾旱下調miR169表達。當分析miR169前體的表達時，兩個前體miR169a和miR169c被乾旱脅迫下調。miR169和NFYA5mRNA的共表達表明miR169a比miR169c更加有效地下調NFYA5mRNA。由此，結果表明乾旱脅迫對miR169a的下調促成了乾旱和ABA高水平誘導NFYA5。NFYA5在液泡組織和保衛細胞中高表達，而且對nfya5敲除的植物和miR169a或NFYA5過表達品系的分析顯示NFYA5在控制氣孔孔徑和抗旱性上是重要的。綜上，結果表明NFYA5對抗旱是重要的，其受到乾旱脅迫的轉錄水平和轉錄後水平的調節。因此，本公開提供分離的多核苷酸，其包括可操作連接至異源啟動子的NFY5A多核苷酸、其同系物或直向同源物。在一個實施方案中，NFY5A包含與SEQIDNO:1、3、5或7構成的多核苷酸至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、100%的同一性。在另一個實施方案中，NFY5A多核苷酸編碼包括SEQIDNO:2的多肽。在另一個實施方案中，異源啟動子包括組成型啟動子或誘導型啟動子。在一個方面，組成型啟動子是花椰菜花葉病毒35S或19S啟動子或植物ACT2啟動子或植物泛素啟動子。在另一個方面，組成型啟動子是來自擬南芥的肌動蛋白2啟動子。在另一個方面，誘導型啟動子包括光誘導型啟動子。本公開也提供了轉化有上述多核苷酸的植物細胞。本公開也提供以比野生型植株高的水平表達NFY5A多核苷酸的轉基因植物，並且轉基因植物具有增加的抗旱性。本公開進一步提供缺失NFY5A基因、其同系物或直向同源物的3'UTR的轉基因植物。本公開提供基因組缺失功能性miR169多核苷酸的轉基因植物。例如，轉基因植物能夠缺失基因組中的功能性miR169a或miR169c多核苷酸。本公開也提供使用上述多核苷酸產生抗旱植物的方法，其包括步驟將多核苷酸或構建物導入植物組織，篩選多核苷酸分子的存在以產生轉基因植物細胞或轉基因植物組織和從轉基因植物細胞或轉基因植物組織再生植物，由此產生抗旱植物。在一個實施方案中，多核苷酸包括可操作地連接至異源啟動子的編碼NFY5A多肽的序列。在另一個實施方案中，多核苷酸包括減少mirl69a或mirl69c的表達的構建物或提供mirl69a或mirl69c的補體的構建物敲除植物細胞中mirl69a或mirl69c的構建物。本公開也提供鑑定用於改變植物抗旱性的製劑的方法，其包括將含有NFY5A基因的植物與試劑接觸，測量存在植物細胞中該基因的表達或mRNA轉錄物的量改變；其中與對照相比表達或轉錄物水平的改變指示改變抗旱性的製劑。一般地，本公開的方法涉及將期望形式的NFYA5多核苷酸整合到植物表達載體用於轉化植物細胞，並且NFYA5多肽在宿主植物中組成性或誘導性地表達或過表達。在另一個實施方案中，本公開提供由不結合siRNA或miRNA分子(例如miR169分子)多核苷酸編碼的NFYA5多肽。因為野生型NFYA5被mrR169抑制，所以與野生型相比，抗抑制的NFYA5多核苷酸也提供調節耐旱性的方法(即，增加耐旱性)。另外，缺乏編碼或提供miRNA(例如miR169)的序列的敲除轉基因植物也提供耐旱植物。NFYA5核酸和多核苷酸也被用於產生具有改變的(如增加的)耐旱表型的基因改造的植物。這樣的植物還顯示對其他非生物應激尤其是鹽脅迫和冷凍的增加的耐性，因為對這些應激和乾旱脅迫的響應由ABA介導(Thomashow，1999Annu.RevlPlantPhysiol.PlantMol.Biol50571；CushmanandBohnert,2000,Curr.Opin.PlantBiol.3117；Kang等人，2002，PlantCell14:343-357;Quesada等人，2000，Genetics154421；Kasuga等人，1999，NatureBiotech.17:287-291)。本文所述的方法一般適用於所有的植物。耐旱性是幾乎任何農作物的重要性狀；大多數大田農作物，包括穀物、大豆、棉花、苜蓿、甜菜、洋蔥、番茄和菜豆對乾旱脅迫敏感。儘管以下提供的具體實例是在選擇物種中進行的，但是NFYA5基因(或直向同源物、其變體或片段)可以在任何類型植物中表達。本公開能夠用於賦予以下植物耐旱性結果和營養生長植物(fruit-andvegetable-bearingplants)，用於切花葉的植物、產穀粒的植物、產油植物、產堅果植物、作物包括玉米(Zeamays)、大豆(Glycinemax)、棉花(Gossypium)、番^jp(Lycopersicumesculentum)、苜猜(Medicagosativa)、亞麻(Linumusitatissimum)、菸草(Nicotiana)和草坪植物(禾本科)和其它草類作物等。本領域技術人員會看出本領域存在大量的轉化技術，並且新的技術一直是可以獲知的。適於靶宿主植物的任何技術能夠用於本公開的範圍內。例如，構建物可以大量的形式導入，包括但不限於DNA鏈、質粒或人工染色體。構建物導入靶植物細胞可以通過多種技術實現，包括但不限於農桿菌介導的轉化、電穿孔、微注射、微粒轟擊、磷酸鈣DNA共沉澱或脂質體介導的異源核酸轉化。優選地植物轉化時永久性的，即通過將導入的表達構建物整合到宿主植物基因組中，由此導入的構建物傳遞給連續的植物世代。根據目的用途，包含NFYA5多核苷酸的異源多核苷酸構建物可以其整個蛋白或其生物活性部分。在一個實施方案中，基於Ti的雙元載體系統可以用於轉移多核苷酸。標準的農桿菌雙元載體為本領域技術人員所知的，並且許多是商業可得的例如，PBI121ClontechLaboratories，PaloAlto,Calif.)0如此處所用，術語「載體」指設計用於在不同宿主細胞轉移的核酸構建物。「表達載體」指能夠將異源DNA片段整合到外源細胞並在其中表達的載體。許多原核和真核表達載體是商業可得的。篩選合適的表達載體在本領域技術人員的知識範圍內。「異源」核酸構建物或序列具有不是在其中表達的植物細胞自身的序列的部分。異源的，針對對照序列而言指本性沒有功能來調節目前正在調節的基因表達的調控序列(即啟動子或增強子)。一般地，異源核酸序列對它們存在的細胞或基因組的部分而言不是內源性的，並且已經通過注射、轉染、微注射、電穿孔等加到細胞中。「異源的」核酸構建物可以含有調控序列/DNA編碼序列組合，其與在天然植物中發現的調控序列/DNA編碼序列組合相同或不同。本文所用術語「基因」指參與產生多肽鏈的DNA片段，其可以包含或不包含編碼區前和編碼區後的區域，例如在5'未翻譯(5'UTR)或「前導區"序列和/或3'UTR或"尾部非編碼區"序列，以及在單個編碼區段(外顯子)和非轉錄調節序列之間的插入序列(內含子)。如此處所用，「重組子〃包括已經通過導入異源核酸序列被改造的細胞或載體或來自這樣改造的細胞的細胞或載體。由此，例如，重組的細胞表達不存在於天然(非重組)形式的細胞中的基因或表達在其他情況下由於人類有意的幹預而異常表達、欠表達或根本不表達的天然基因。如此處所用，術語"基因表達"指這樣的過程通過該過程基於基因的核酸序列產生多肽。該過程包括轉錄和翻譯兩者；因此，「表達」可以指多核苷酸或多肽序列，或指兩者。有時，多核苷酸序列的表達不引起蛋白質的翻譯。「過表達」指相對於野生型或其他植物的多核苷酸和/或多肽序列的增加的表達，並且可以涉及天然存在的或非天然存在的序列。「異位表達"通常時間、地點和/或增加的水平上的表達，在非改變的或野生型的植物中不天然發生。「欠表達"指多核苷酸和/或多肽序列通常是內源基因相對於它在野生型植物中的表達減少。術語「錯誤表達」和「改變的表達」包括過表達、欠表達和異位表達。術語「導入」在將多核苷酸插到細胞的情況下，指「轉染」或「轉化」或「轉導」，並包括將多核苷酸整合到真核細胞或原核細胞，其中多核苷酸可以整合到細胞的基因組中(例如，染色體、質粒、質體或線粒體DNA)，轉化成自主複製子或暫時表達(例如，轉染的mRNA)。如此處所用，「植物細胞」指來自植物的任何細胞，包括來自未分化組織(例如，愈傷)以及植物種子、花粉、繁殖體(progagules)和胚的細胞。本公開包括改良的植物和植物組成，包括整株植物、營養器官/結構(例如葉、幹和和塊莖)、根、花和花器官/結構(例如，苞葉、萼片、花瓣、雄蕊、心皮、花葯和胚珠)、種子(包括胚、胚乳和種皮)和果實(成熟的子房)、植物組織(例如，維管組織、基本組織等)和細胞(例如，保衛細胞、卵細胞等)及其後代。能夠用於本公開方法中的植物類別通常為廣泛的適於轉化技術的高等和低等植物類，包括被子植物(單子葉和雙子葉植物)、裸子植物、蕨類植物、楔葉類、裸蕨植物、石松類脂物、苔蘚類植物和多細胞藻類。「植物組織"包括分化的和未分化的植物組織，包括但不限於根、莖、枝、葉、種子、腫瘤組織和各種形式的細胞和培養物如單細胞、原生質體、胚和愈傷組織。植物組織可以在植株中或在器官、組織或細胞培養物中。本公開不限於任何植物種類。可以考慮的植物種類包括但不限於苜蓿、紫苑、大麥、秋海棠、甜菜、低芥酸菜籽、香瓜、胡蘿蔔、菊花、]三葉草、玉米、棉花、黃瓜、飛燕草、葡萄、草坪和草坪草、萵苣、豌豆、薄荷、水稻、蕪菁甘藍、高粱、糖用甜菜、向日葵、菸草、粘果酸漿、番茄、蕪菁、小麥和百日菊。如此處所用，相對於給定植物性狀或表型的術語"天然的"和"野生型的"指其中在自然界的同種植物中存在的該性狀或表型的形式。如此處所用，關於植物性狀的術語「改良的(改變的)」指轉基因植物相對於類似的非轉基因植物在表型上的改變。關於轉基因植物的"目的表型(性狀)"指Tl和/或後代植株顯現的可觀察到的或可測量的表型，該表型在對應的非轉基因植物(即，在相似的條件下培育的或分析的相似基因型的植物)中不顯示(即，在相似的條件下培育的或分析的相似基因型的植物)。目的表型可以表現植物的改進或可以提供產生其他植物改善的手段。「提高(改善)"是通過提供具有獨特和/或新的品質可以增強植物種或品種實用的特徵。「改變的耐旱表型」指與類似的但未改良的植物相比，基因改良的植物耐受低水條件的能力的可檢測改變。一般地，改良的(增加的)耐旱表型(即，植物在通常對植物有害的低水條件下存活的能力)是目的表型。如此處所用，『『突變的〃多核苷酸或基因在序列或表達上不同於對應的野生型多核苷酸或基因，其中這種不同導致了改良的植物表型或形狀。相對於植物或植物品系，術語「突變體」指具有改良的植物表型或性狀的植物或植物品系，其中改良的表型或性狀與改良的野生型多核苷酸或基因的改良的表達相關。如此處所用，術語〃Tl"指從種子到TO植物的代。Tl代是第一組轉化的植物，其能夠通過使用選擇製劑例如抗生素或除草劑來選擇，所述轉基因植物含有相應的對這些抗生素或除草劑的抗性基因。術語"T2"指通過先前篩選為轉基因的Tl植物的花的自體受精產生的代。如此處所用，術語「植物部分」包括任何的植物器官或組織，包括但不限於種子、胚、分生組織區、愈傷組織、葉片、根、莖、配子體、孢子體、花粉和小孢子。植物細胞可以從任何植物器官或組織和從他們製備的培養物獲得。能夠用於本發明的方法中的植物類一般和適於轉化技術的高等植物類一樣廣泛，包括單子葉和雙子葉植物。如此處所用，「轉基因植物"包括在基因組內包括異源的多核苷酸的植物。所述異源的多核苷酸或能夠穩定地整合到基因組中，或為染色體外的。優選地，本公開的多核苷酸被穩定地整合到基因組中，使得多核苷酸被傳遞到後續多代。其中導入異源多核苷酸的植物細胞、組織、器官或植株被認為是「轉化的」、「轉染的」或「轉基因的」。也含有所述異源多核苷酸的轉化植物或植物細胞的直接和間接後代也被認為是轉基因的。「蛋白」或"多肽"，這兩個術語在本文中可以互換使用，包括一條或多條稱為胺基酸的構件的鏈，胺基酸通過稱為肽鍵的化學鍵連在一起。「天然的」或"野生型"的蛋白、酶、多核苷酸、基因或細胞，指自然界中存在的蛋白質、酶、多核苷酸、基因或細胞。「胺基酸序列」是胺基酸胺基酸的聚合物(蛋白、多肽等)或代表胺基酸聚合物的字符串，這取決於上下文。在本說明書中提到的各種胺基酸序列中存在的胺基酸具有它們在本領域常規使用的通常的三字母縮寫或一個字母縮寫A、Ala，丙氨酸；C、Cys，半胱氨酸；D、Asp，天門冬氨酸；E、Glu，穀氨酸；F、Phe，苯丙氨酸；G、Gly，甘氨酸；H、His，組氨酸；I、Ile，異亮氨酸；K、Lys，賴氨酸；L、Leu，亮氨酸；M、Met，甲硫氨酸；N、Asn，天門冬醯胺；P、Pro，脯氨酸；Q、Gln,穀氨醯胺；R、Arg,精氨酸；S、Ser,絲氨酸；T、Thr，蘇氨酸、V、Val，纈氨酸；W、Try,色氨酸，Y、Tyr,酪氨酸。具體序列的"保守的胺基酸序列取代"或簡單地說，「保守的變異"指用基本相同的胺基酸序列代替一個胺基酸或胺基酸串。本領域技術人員會知道改變、插入或缺失編碼序列中單個胺基酸或胺基酸百分比的單次取代、缺失或插入導致「保守的變異」，其中所述改變造成胺基酸的缺失、胺基酸的插入或胺基酸被化學相似的胺基酸取代。提供功能相似的胺基酸的保守取代表為本領域公知。例如，保守的取代基包括丙氨酸(A)、絲氨酸(和蘇氨酸(T)。另一個保守的取代基包括天門冬氨酸(D)和穀氨酸(E)。另一個保守的取代基包括天門冬醯胺(N)和穀氨醯胺⑴)。然而，另一個保守的取代基包括精氨酸(R)和賴氨酸(K)。另一個保守的取代基包括異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)和纈氨酸(V)。另一個保守的取代基包括苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)。由此，本公開所列的多肽的"保守的胺基酸取代"包括所述多肽的通常小於10%百分比的胺基酸被相同保守取代基的保守選擇的胺基酸取代。因此，本公開的多肽的保守取代的變異能夠含有具有相同保守取代基保守取代的變異的100、75、50、25或10次取代。「保守的變異體"是其中給定的胺基酸殘基已經改變但沒有改變其整體構象和功能的蛋白質或酶，包括但不限於被具有相似性質的胺基酸的取代，所述性質包括極性或非極性特性、尺寸、形狀和電荷。那些指明為保守的那些之外的胺基酸在蛋白質或酶中會不同，使得在具有相似功能的任何兩個蛋白質之間的蛋白質或胺基酸序列相似性百分比可以不同，並且可以為例如，至少30%、至少50%、至少70%、至少80%或至少90%，這根據比對方案確定。如本文所述，「序列相似性"指核苷酸或蛋白質序列相關的程度。兩個序列之間的相似程度能夠建立在序列同一百分率和/或保守百分率基礎上。「序列同一性"在本文中指兩個核苷酸或胺基酸序列不變的程度。「序列比對"指排列兩個或更多個序列以得到最大同一水平的過程(並且，在胺基酸序列的情況下，指保守性)，以用於評價相似性的程度的目的。用於比對序列和評價相似性/同一性的許多方法是本領域已知的，諸如，例如ClusterMethod，其中相似性是建立在MEGALIGN算法基礎上，以及BLASTN、BLASTP和FASTA(Lipman和Pearson，1985；Pearson和Lipman，1988)。當使用所有這些程序時，優選的設置時那些導致最高序列相似性的那些。如此處所用，關於指定的主題序列或其指定部分的"同一性百分率"被定義為在在比對序列和導入空位後，候選衍生物中的核苷酸或胺基酸與主題序列(或其規定部分)中的核苷酸或胺基酸相似的百分率，如果需要，獲得最大的序列同一性百分率，這通過用設為預設值的檢索參數的程序WU-BLAST-2.0al9(Altschul等人，J.Mol.Biol.(1990)215403-410；網址blast,wustl.edu/blast/README.html)產生。HSPS和HSPS2參數是動態值，並且通過程序本身依賴於具體序列的組成和具體資料庫的組成建立，目的序列通過該具體資料庫檢索。「％同一性值"通過匹配的相同核苷酸或胺基酸的數除以所要報導序列同一性百分率的序列的長度。「胺基酸相似性百分率"通過進行與確定胺基酸序列同一性相同的計算確定，但是在計算中除了相同的胺基酸外還包括保守的胺基酸取代。特定的多肽的非保守修飾是取代任何胺基酸的修飾，非表徵為保守的取代。這些修飾包括用鹼性或酸性胺基酸取代中性胺基酸(例如，Asp、Glu、Asn或Gln代替Val、lie、Leu或Met)，芳族胺基酸代替鹼性或酸性胺基酸(例如，Phe、Tyr或Trp代替Asp、Asn、Glu或Gin)或不用類似的胺基酸置換胺基酸的任何其它的取代。鹼性側鏈包括賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)；酸性側鏈包括天門冬氨酸(D)、穀氨酸(E)；不帶電荷的極性側鏈包括甘氨酸(G)、天門冬醯胺(N)、穀氨醯胺⑴)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、半胱氨酸(C)；非極性側鏈包括丙氨酸(A)、纈氨酸(V)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)；β分支側鏈包括蘇氨酸(T)、纈氨酸(V)、異亮氨酸⑴；芳族側鏈包括酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、組氨酸(H)。應理解，不改變多核苷酸編碼的多肽的活性的序列插入，諸如非功能或非編碼序列的插入是鹼性多核苷酸的保守改變。本領域技術人員會意識到公開的核酸構建物的許多保守變化產生功能相同的構建物。例如，如上述，遺傳密碼的簡併，「沉默取代」(即，不產生編碼多肽中的改變的核酸序列中的取代)是編碼胺基酸的每個核酸序列的隱含特徵。類似的，在被具有高度相似性質的不同胺基酸取代的胺基酸序列中的一個或幾個胺基酸中的"保守的胺基酸取代"也容易鑑定為與公開的構建物高度相似。各公開序列的這樣的保守變異是本文提供的多肽的特徵。當與通常相連的組分(其它蛋白質、核酸、合成試劑等)完全或部分分開時，多核苷酸、多肽或其它的組分是「分離的」或「純化的」。當多核苷酸或多肽是人工的或工程設計的或來自人工或工程構造的蛋白質或核酸時，它們是"重組的"。例如，插入載體或任何其它異源位置例如重組有機體的基因組中的多核苷酸，使得其與在自然界發現的通常位於所述多核苷酸側翼的核苷酸序列不連接，這樣的多核苷酸是重組的多核苷酸。從重組的多核苷酸體外或體內表達的蛋白質是重組的多肽的實例。同樣，不在自然界出現的多核苷酸，例如天然出現的基因的變體是重組的。任何載體，包括質粒、粘粒、噬菌體或農桿菌雙元載體，雙鏈或單鏈的線形或環形的形式，可以是或可以不是自我傳遞或遷移的，並且能夠通過整合到細胞基因組或染色體外存在的方式轉化原核或真核宿主(例如，具有複製原點的自我複製質粒)能夠用於本公開的方法和組合物中。具體地說，包括穿梭載體，其指自然地或通過設計能夠在兩種不同的宿主生物體複製的DNA運載體，宿主生物體選自放線菌和相關種，細菌和真核生物(例如，高等植物、哺乳動物、酵母或真菌細胞)。載體中的多核苷酸是在合適的啟動子或其他在宿主細胞轉錄的調控元件的控制下並可操作地連接到所述啟動子或調控元件，宿主細胞如微生物、例如細菌或植物細胞。載體可以是在多宿主中具有功能的雙功能表達載體。在基因組DNA的情形下，這可以含有其自身啟動子或其它調控元件，在cDNA的情況下，這可以在合適的啟動子或其他宿主細胞中的表達調控元件的控制下。如此處所用，「組成型啟動子"指有助於可操作地連接的編碼多核苷酸或目的多核苷酸以基本連續的或基礎水平表達的啟動子。誘導型啟動子是能夠瞬時被誘導或通過接觸使得在特定的時間表達水平改變的啟動子。適於用於NFY5A多核苷酸或本公開的片段的啟動子的實例包括來自脂肪酸去飽和酶基因的調控序列、來自玉米的醇脫氫酶啟動子、光誘導型啟動子諸如核酮糖二磷酸脫羧酶小亞基基因、主要葉綠素a/b結合蛋白基因啟動子、花椰菜花葉病毒的花椰菜花葉病毒19S啟動子(CaMV，-46bp花椰菜花葉病毒(CaMV)35S最小啟動子，其在多數植物組織中以低(基礎)水平表達。組織特異性啟動子，諸如根特異性啟動子或根皮層特異的啟動子，也考慮在內。種子特異性的啟動子的非限定性實例包括油菜籽蛋白、菜豆蛋白、油質蛋白和十字花科蛋白啟動子。其它合適的植物啟動子包括本領域技術人員知曉的那些。本公開包括術語"調節序列"、「調控元件"和"表達調控序列"指包括影響轉錄起始和轉錄速率的多核苷酸結構域。調節序列包括但不限於啟動子、啟動子調控元件、蛋白質結合結構域、5'和3'非翻譯區(UTR)、轉錄起始位點、終止序列、聚腺苷酸化序列、內含子和位於編碼區內的其它調節序列。術語「可操作地連接」和「可操作地相連」在本文中可以互換使用，廣泛地指在分子中兩個其它方面不同的結構域的化學或物理連接(直接或間接)，其中各結構域具有獨立的生物學功能。例如，可操作地連接指在調節序列和被該調節序列調節的多核苷酸之間的功能連接。例如本公開的可操作地連接的5NFYA5多核苷酸或片段能包括可操作地連接到啟動子的5NFYA5多核苷酸或片段，其依次可操作地連接到編碼多肽的多核苷酸或要表達的抑制性核酸分子。啟動子是由通常轉錄起始位點上遊100個核苷酸內的DNA分子區域(通常在RNA聚合酶II的起始點附近)組成的。啟動子參與識別和結合RNA聚合酶和其它蛋白質以起始和調節轉錄。為了使編碼序列在啟動子的控制下，通常需要將多肽的翻譯閱讀框的翻譯起始位點置於啟動子下遊的1到約50個核苷酸之間。最小啟動子僅包括必需量用於轉錄起始的轉錄複合物的組裝的序列。最小啟動子通常包括位於轉錄起始位點上遊約15至約35個核苷酸之間的"TATA盒"元件。最小啟動子也可以包括"CCAAT盒"元件，其可以位於轉錄起始點上遊約40至約200個核苷酸之間，通常約60到約120個核苷酸之間。擬南芥NFYA5核酸(cDNA)序列以SEQIDNO:1、3、5或7提供。相應的蛋白質序列分別以SEQIDNO:2、4、6和8提供。如此處所用，術語〃NFYA5多肽〃指全長的NFYA5蛋白，或其「功能活性」片段、衍生物(變體)或直向同源物(表示所述蛋白質片段、衍生物或直向同源物顯示與SEQIDNO2、4、6或8的多肽相關的功能活性)。在一個實施方案中，功能活性的NFYA5多肽當在植物中過表達或錯表達時，導致改變的耐旱表型。在進一步的實施方案中，功能活性的NFYA5多肽的錯表達或過表達導致增加的抗旱性。在另一個實施方案中，功能活性的NFYA5多肽當在植物或植物細胞中表達時，能夠挽救缺陷(包括缺乏的)內源的NFYA5活性；挽救的多肽可以來自與具有缺陷活性的種相同或不同的種。在另一個實施方案中，全長NFYA5多肽(即，具有SEQIDNO:2、4、6或8序列的天然的多肽或其天然存在的直向同源物)的功能活性的片段保留與全長NFYA5多肽相關的一個或多個生物學性質，諸如信號活性、結合活性、催化活性或細胞定位胞外定位活性。NFYA5片段優選包含NFYA5結構域，諸如C-或N-端結構域或催化結構域等，並優選包含至少10個，優選至少20個、更優選至少25個和最優選至少50個連續的NFYA5的胺基酸。功能結構域能夠用PFAM程序鑑定(BatemanA等人，NucleicAcidsRes(1999)27:260-262；網址pfam.wustl.edu)。全長NFYA5多肽或其片段的功能活性變體包括含有胺基酸插入、缺失或取代的多肽，具有與全長NFYA5相關的一個或多個生物學性質。在一些情況中，產生改變NFYA5多肽的翻譯後加工的變體。例如，與天然的多肽相比，變體可以具有改變的蛋白質運輸或蛋白定位特性或改變的半衰期。如此處所用，術語〃NFYA5多核苷酸〃包括含有以下序列的多核苷酸以SEQIDNO1提供的序列所述的序列或與該序列互補的序列以及其功能活性片段、衍生物或直向同源物的序列。本公開的NFYA5多核苷酸可以是DNA，其衍生自基因組DNA或cDNA或RNA或其組合。在一個實施方案中，NFYA5多核苷酸編碼功能活性的NFYA5多肽或互補於編碼功能活性的NFYA5多肽(例如，包括SEQIDNO:2、4、6或8的多肽或其功能片段)的核酸。充當初級RNA轉錄物(mRNA前體)的模板的基因組DNA包括在該定義內，該初級RNA轉錄物在編碼功能活性的NFYA5多肽前需要加工，如剪接。NFYA5多核苷酸能夠包括其他的非編碼序列，其可以或不可以被轉錄；這樣的序列包括本領域公知的5'和3'UTR、多聚腺苷酸化信號和調控基因表達的調節序列等。一些多肽需要加工事件，諸如蛋白水解裂解、共價修飾等，以完全變得具有活性。因此，功能活性的核酸可以編碼成熟的預加工的NFYA5多肽或中間體形式。NFYA5多核苷酸也可以包括異源編碼序列，例如編碼包括在內以利於融合多肽的純化的標誌物的序列或轉化標誌物的序列。在另一個實施方案中，功能活性的NFYA5多核苷酸能夠用於產生功能喪失的NFYA5表型，例如經反義抑制、共抑制等。在一個實施方案中，本公開的方法使用的NFYA5多核苷酸包括編碼與SEQIDNO2、4、6或8中所示的多肽具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多序列同一性的NFYA5多肽的核酸序列，或與編碼與SEQIDNO:2、4、6或8中所示的多肽具有至少50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更多序列同一性的NFYA5多肽的核酸序列互補。在另一個實施方案中，本公開的NFYA5多肽包括與SEQIDNO:2、4、6或8的NFYA5多肽序列具有至少50%或60%同一性的多肽序列，和可以與SEQIDNO:2、4、6或8的NFYA5多肽序列具有至少70%、80%、85%、90%或95%或更多的序列同一性。在另一個實施方案中，NFYA5多肽包括與在SEQIDNO:2、4、6或8中存在的多肽的功能活性片段具有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%或95%或更多的序列同一性的多肽序列。在另一個方面，NFYA5多核苷酸包括在其全部長度上與SEQIDNO:1、3、5或7所示的NFYA5多核苷酸至少相同50%到60%的序列，或與與這樣的NFYA5序列互補的核酸序列，NFYA5多核苷酸可以包括與SEQIDNO1所示的NFYA5序列具有至少70%、80%、85%、90%或95%或更多的序列同一性，或其功能活性片段或互補序列。本公開也包括能夠與由SEQIDNO:1、3、5或7組成的多核苷酸雜交並編碼賦予植物耐旱的多肽的核酸分子。雜交的嚴謹性可以通過在雜交和洗脫期間的溫度、離子強度、PH和存在變性劑如甲醯胺控制。常規使用的條件是公知的(見，例如CurrentProtocolinMolecularBiology,Vol.l,Chap.2.10,JohnWiley&Sons,Publishers(1994)；Sambrook等人，如上)。在一些實施方案中，本公開的核酸分子能夠在包括以下的嚴謹雜交條件下雜交到含有SEQIDNO1的核苷酸序列的核酸分子在含有6x—倍濃度的檸檬酸(SSC)(IxSSC是0.15MNaCl.O.015MNa檸檬酸；pH7.0)、5xDenhardt溶液、0.05%焦磷酸鈉和100μg/ml鯡魚精DNA溶液中在65°C預雜交含有核酸濾膜的8小時至過夜；在含有6xSSC、IxDenhardt溶液、100μg/ml酵母tRNA和0.05%焦磷酸鈉的溶液中在65°C雜交18-20小時；在65°C在含有0.hSSC和0.SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中洗滌濾膜1小時。在其他生物實施方案中，使用中度嚴謹雜交條件，其包括在含有35%甲醯胺、5xSSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mMEDTA、0.1%PVP、0.1%Ficoll、1%BSA和500μg/ml變性鮭魚精DNA的溶液中預處理含有核酸的濾膜Mi；在40°C在含有35%甲醯胺、5xSSC、50mMTris-HCKpH7.5)、5mMEDTA、0.02%PVP、0.02%Ficoll、0.2%BSAU00μg/ml鮭魚精禾口10%(wt/vol)硫酸葡聚糖的溶液雜交18-20h；接著在55°C在含有2xSSC和0.1%SDS的溶液中1小時洗滌2次。可選地，可以使用低嚴謹條件，其包括在37°C在含有20%甲醯胺、5xSSC、50mM磷酸鈉(pH7.6)JxDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20μg/ml變性的剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育8小時到過夜；在同樣的緩衝液中雜交18到20個小時，並在IxSSC中洗滌濾膜約1小時。本公開的方法可以使用可以使用擬南芥NFYA5的直向同源物。鑑定其他植物中的直向同源物的方法是本領域公知的。通常，不同種中的直向同源物保留相同的功能，因為存在一個或多個蛋白基序和/或3維結構。在進化過程中，當物種形成後發生基因複製事件時，在一個物種諸如擬南芥中的單個基因，可以對應於另一個物種中多個基因(共生同系物)。如此處所用，術語「直向同源物」包括共生同系物。當特定植物種的序列數據是可知時，通常通過序列同源分析技術如BLAST分析通常用蛋白餌序列鑑定直向同源物。如果從正向的BLAST結果獲得的最好的靶序列在反向BLAST檢索到原始的查詢序列，序列被指定為潛在的直向同源物(HuynenMA禾口BorkP,ProcNatlAcadSci(1998)95:5849-5856；HuynenMA等人，GenomeResearch(2000)101204-1210)。用於多序列比對程序，諸如CLUSTAL(ThompsonJD等人NucleicAcidsRes(1994)22:4673-4680)可以用於突出直向同源蛋白的保守區域和/或殘基，並產生系統樹。在表示來自不同種的多個同源序列(例如，從BLAST分析中檢索)的系統樹中，兩個種的直向同源序列相對於這兩個種的所有其他序列一般在樹上顯示最近。蛋白質結構預測線索法或蛋白摺疊的其它分析技術(例如，使用ProCeryon,Biosciences,Salzburg,Austria的軟體)也可以鑑定可能的直向同源物。並且當序列數據未知時也可以使用核酸雜交方法來尋找直向同源基因。cDNA或基因組DNA文庫的簡併PCR和篩選是常用的尋找相關基因序列的方法，並且是本領域公知的(見，例如上述的Sambrook;DieffenbachCandDvekslerG(Eds.)PCRPrimer:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,NY,1989)例如,用於產生目的植物種的cDNA文庫和用部分同源的基因探針檢測文庫的方法在Sambrook等人中有描述。擬南芥NFYA5編碼序列的高度保守部分可以用作探針。NFYA5直向同源核酸序列可以在高度、中度或低度嚴謹條件下雜交到SEQIDNO:1的核酸序列。在擴增或分離假定的直向同源物後，通過標準的技術克隆並測序所述片段並用作探針來分離完全的cDNA或基因組克隆。可選地，有可能啟動EST探針來產生目的植物種的序列信息資料庫。在另一個方法中，特異性結合已知的NFYA5多肽的抗體用於直向同源物分離。Western印跡分析能夠測定NFYA5直向同源物(即直向同源蛋白)存在於特定植物種的粗提取物中。當觀察到反應性時，編碼候選直向同源物的序列可以通過篩選代表特定植物種的表達文庫來分離。表達文庫能夠構建在各種商業購買的載體中，包括Xgtll，如在Sambrook，等人中描述，如上。一旦候選的直向同源物通過這些方法中的任何一種鑑定，候選的直向同源序列用作針對擬南芥的序列或其中NFYA5核酸和/或多肽序列已經鑑定的其它種的序列的反向BLAST的餌(「詢問")。NFYA5多核苷酸和多肽可以使用任何已知的方法獲得。例如，用於通過篩選DNA文庫或使用聚合酶鏈反應(PCR)分離目的cDNA或基因組DNA序列的技術，如前所述，是本領域公知的。可選地，多核苷酸寡核苷酸可以被合成。任何已知的方法，諸如定點突變(KimkelTA等人，MethodsEnzymol.(1991)204:125-39)可以用於將期望的改變導入到克隆的核酸中。如本領域技術人員所知，修飾編碼序列以增強其在特定宿主中的表達是有利的。遺傳密碼具有64個可能的密碼子是冗餘的，但是大多數生物體優選使用這些密碼子的子集。物種最常使用的密碼子稱為最優密碼子，不經常使用的密碼子稱為稀有或不常用密碼子(見，例如^iang等人，(1991)Gene105:61-72)。密碼子可以被取代以反應宿主的優選密碼子使用，這個過程有時也稱為"密碼子優化"或"控制物種密碼子偏愛"。含有特定原核或真核宿主優選的密碼子的最優編碼序列(也可以見Murray等人，(1989)Nucl.AcidsRes.17:477-508)可以被製備，例如以增加翻譯速率或產生與從非優化序列產生的轉錄物相比具有期望性質如更長的半衰期。翻譯終止密碼子也可以被修飾以反應宿主的偏愛。例如，釀酒酵母和哺乳動物的偏愛終止密碼子分別是UAA和UGA。單子葉植物的優選終止密碼子是UGA，其中昆蟲和大腸桿菌偏愛使用UAA作為終止密碼子(Dalphin等人，(1996)Nucl.AcidsRes.24=216-218)0用於優化在植物中表達的核苷酸序列的方法學在例如U.S.Pat.No.6，015，891中以及其中引用的參考文獻中提供。用農桿菌載體轉化植物的最優程序會根據被轉化的植物變化。用於農桿菌介導的轉化的示例性方法包括轉化來自無菌的幼苗和/或植株的下胚軸、牙尖、莖或葉片組織的外植體。這種轉化的植物可以有性再生或通過細胞或組織培養再生。農桿菌轉化先前已經描述用於大量的不同類型的植物，用於這樣的轉化的方法可以在科技文獻中見到。NFYA5的表達(包括轉錄和翻譯)可以在表達水平、發生表達的組織類型(一種或多種)和/或表達發育階段上進行調節。大量的異源調節序列(例如，啟動子和增強子)可以用於控制NFYA5核酸的表達。這些包括組成型的、誘導型的和調節型的啟動子以及調控以組織特異性或時間特異性的方式調控表達的啟動子和增強子。示例性的組成型啟動子包括樹莓E4啟動子(U.S.Pat.Nos.5，783，393和5，783，394)、35SCaMV(JonesJD等人(199TransgenicRes1:285-297)、CsVMV啟動子(VerdaguerB等人，PlantMolBiol(1998)37:1055-1067)和甜瓜肌動蛋白啟動子(出版的PCT申請W00056863)。示例性的組織特異性的啟動子包括番茄E4和E8啟動子(U.S.Pat.No.5，859，330)與番茄2AII基因啟動子(VanHaarenMJJ等人，PlantMolBio(1993)21:625-640)。在一個實施方案中，NFYA5表達在來自表達與乾旱脅迫相關的基因的調節序列的控制下。來自其他物種的乾旱脅迫誘導的基因的啟動子也可以使用。實例是來自玉米的rabl7、ZmFerl和ZmFer2基因(Bush等人1997PlantJ11:1285；Fobis-Loisy,1995EurJBiochem231:609)，來自番茄的tdi-65基因(Harrak，2001Genome44:368)，菸草的Hisl基因(Weiand0'Connel1，1996PlantMolBiol30:255)，來自豇豆的Vupatl基因(Matos，2001FEBSLett491:188)和來自馬鈴薯的CDSP34(GiIlet等人1998PlantJ16:257)。在另一個方面，在一些情況中，期望抑制宿主細胞中內源NFYA5的表達。實施本公開的這方面的示例性方法包括但不限於反義抑制(Smith，等人，Nature(1988)334724-726；vanderKrol等人，Biotechniques(1988)6:958-976)；共抑制(Napoli,等人PlantCell(1990)2:279-289)；核酶(PCT出版WO97/1032S)和有義和反義的組合(Waterhouse，等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95:13959-13964)。用於抑制宿主細胞中內源序列表達的方法通常利用所要抑制的序列的至少部分的轉錄或轉錄與反義。這樣的序列可以與內源序列的編碼以及非編碼區同源。反義抑制可以使用完整的cDNA序列(Sheehy等人，Proc.Natl.Acad.ki.USA(1988)85:8805-8809)、包括5『編碼序列的片段的部分cDNA序列(Cannon等人，PlantMolec.Biol.(1990)15:39-47)或或3'非編碼序列3'的片段的部分cDNA序列(Ch'ng等人，Proc.Natl.Acad.ki.USA(1989)8610006-10010)。共抑制技術可以使用整個cDNA序列(Napoli等人，supra；vanderKrol等人，ThePlantCell(1990)2:291-299)或部分cDNA序列(Smith等人，Mol.Gen.Genetics(1990)224:477-481)。可以進行標準的分子和遺傳試驗來進一步分析基因和觀察的表型之間的關聯。示例性的技術描述如下。在突變體和野生型的株系中階段特異性的表達和組織特異性的基因表達模式可以通過例如原位雜交來測定。可以進行基因特別是側翼的調節區的甲基化狀態的分析。其它合適的技術包括過表達、異位表達和在其他植物種的表達和基因敲除(反向遺傳學、靶向敲除、病毒誘導的基因沉默[VIGS，見BaulcombeD，ArchVirolSuppl(1999)15189-201])。通常通過微陣列分析技術進行的表達圖譜可以用於同時測量許多不同基因的表達的差異或誘導的改變。用於微陣列分析的技術是本領域公知的(SchenaM等人，Science(1995)270:467-470；BaldwinD等人，(1999)CurOpinPlantBiol.2(2):96-103；DangondF,PhysiolGenomics(2000)2:53-58；vanHalN入，JBiotechnol(2000)78271-280；RichmondTandSomervilleS,CurrOpinPlantBiol(2000)3:108-116)。可以進行對個體標記的株系的表達作圖。這樣的分析能夠鑑定由於目的基因的過表達而被並行調節的其他基因，這可助於將未知的基因置於特定的途徑中。例如，以下進行的分析證實在非應激條件下幹擾RNA分子抑制NFY5A活性。減少該分子的抑制能夠助於賦予耐旱性或優化NFY5A的表達或活化。基因產物的分析可以包括重組蛋白表達、免疫定位、生化分析催化活性或其它活性，磷酸化狀態的分析和經酵母雙雜交分析與其它蛋白的相互作用。路徑分析可以包括基於期望的表型或通過與相關基因的序列同源性將基因或基因產物放在特定的生化、代謝或信號途徑內分析。可選地分析可以包括與野生型株系和其它的突變株系的遺傳雜交(產生雙重突變)以將基因放在路徑中，或確定突變對途徑中下遊「報告」基因的表達的影響。本公開還提供了鑑定具有使耐旱性增加的內源NFYA5的突變的植物的方法，和產生非基因改良的這些植物的耐旱後代的方法。在一個方法中，稱為"TILLING"(用於靶向誘導的基因組中的局部病變)的突變在目的植物的種子中被誘導，例如，使用EMS處理。獲得的植物生長並自我受精，並且後代被用於製備DNA樣品。NFYA5-特異性的PCR被用於鑑定突變的植物是否具有NFYA5突變。具有NFYA5突變的植物接著可以被檢測耐旱性；或可選地，可以檢測植物的耐旱性並且接著使用NFYA5特異性的PCR來確定具有增加的耐旱性的植物是否具有突變的NFYA5基因。TILLING能夠鑑定可以改變特定基因的表達或由這些基因表達的蛋白的活性的突變(見Colbert等人(2001)PlantPhysiol126:480-484；McCallum等人(2000)NatureBiotechnology18:455-457)。在另一個方法中，候選基因/數量性狀基因座^TLs)方法能夠用於標誌物輔助選擇育種程序以鑑定使耐旱性增加的NFYA5基因等位基因或NFYA5基因的突變或NFYA5基因的直向同源物(見Foolad等人，TheorApplGenet.(2002)104(6-7):945-958；Rothan^人，TheorApplGenet(2002)105(1):145-159)；DekkersandHospital,NatRevGenet.(2002)January；3(1):22-32)。由此，在本公開的進一步的方面，NFYA5核酸被用於鑑定耐旱的植物是否具有內源NFYA5中的突變。實施例擬南芥的突變體rdr2-l、dcl2-l、dcl3-l和dcl4-l獲自於CenterforGeneResearchandBiotechnology，俄勒同州州立大學。dcll—7禾口henl—1由XuemeiChen提供。rdr6禾口sde4/nrpdla由英國的JohnInnesCenterforPlantScienceResearch,SainsburyLaboratory，|!(子i^i"共。sgs3的LaboratoiredeBiologieCellulaire,InstitutNationaldelaRechercheAgronomique,Versailles,France提供。hyll由賓夕法尼亞州立大學的TheHuckInstituteofLifeScience提供。這些突變體為Columbia(Col-O)、Landsbergerecta(Ler)、Nosssen-O(No)或C24的遺傳背景，如在在說明書文本和附圖中所示。NFYA5的T-DNA插入突變體(SALK_042760)獲自於ABRC。擬南芥植株生長在23士1°C下的連續光照(70μπιΟ1m-2s-l)下。菸草本塞姆氏植物生長在23士1°C下的1光/8h黑暗的光周期下。對於脫水處理，將2周大小的苗子從瓊脂培養基中拔出並在試驗臺上的Whatman3MM紙上乾燥規定的時間。對於乾燥處理，植物生長在具有充足水分的土壤中3周，接著控水一定的時間。通過QuickChangeII定點突變試劑盒(Stratagene)進行定點突變以產生在與小RNA互補的區中突變的NFYA5。測序該片段以確保只引入了期望的突變。具有和不具有3』-UTR的NFYA5用指定的引物擴增(具有/沒有3』-UTR的正向5』-CACCATGCAAGTCTTTCAAAGGAAAG-3，(SEQIDNO9)、具有3，-UTR反向5，-GTAATGCAATTGTACTCTCGAG-3，(SEQIDNO:10)和沒有3，-UTR反向5，-TCAAGTCCCTGACATGAGAGCTGAGG-3，(SEQIDNO:11))。Atlg54150的全長cDNA用以下引物擴增正向5，-CACCATGTCCTCGCCGGAGCGTGCTCTC_3，(SEQIDNO:12)，反向5，_TAGTTCGATCTCACCGAGCTCCA-3，(SEQIDNO:13)。這些構建物克隆到植物表達GATEWAY目的載體pMDC32中。為了產生PMDC32miR169構建物，從基因組DNA用下列引物擴增包括折回結構的圍繞miRNA序列的200bp片段miR169a正向5』-CACCTGGGTATAGCTAGTGAAACGCG-3，(SEQIDNO14)和反向5，-CCTTAGCTTGAGTTCTTGCGA-3，(SEQIDNO:15)、miR169b正向5，-CACCCCCAACGGAGTAGAATTG_3，(SEQIDNO:16)和反向5，-CTCATACGGTCGATGTAATCCGT-3，(SEQIDNO:17)、miR169c正向5，_CACCTCGTCCATTATGAGTATT-3，(SEQIDNO:18)和反向5，-CTAATATGATATGAATATGGATGA-3，(SEQIDNO19)、miR169h正向5，-CACCTCATATAAGAGAAAATGGTG-3，(SEQIDNO:20)和反向5，-CCAAAAAAGAGAAATGTGAATGAG-3，(SEQIDNO:21)。將擴增的片段導入到pENTRTM/D-TOPO載體Qnvitrogen)並通過LR反應克隆到pMDC32中。對於NFYA5啟動子GUS構建物，用正向引物5，-CACCTGTATGACATATTCTGTGTGGAG-3，(SEQIDNO22)和反向引物5，_TGCAAATTGGGTATTGGCTATG_3，(SEQIDNO23)擴增起始密碼子上遊的1.7kb片段並按照Gateway重組克隆到pMDC164載體中。產生YFP與NFYA5的C端的融合體並通過Gateway重組導入到pEarleyGate101載體中。在LeicaSP2共聚焦顯微鏡上採集YFP像。從野生型、突變體和轉基因植物用Trizol試劑(Invitrogen)提取總RNA。為了富集小RNA，通過加入一體積的20%PEG-IMNaCl選擇性沉澱高分子量的RNA(Llave等人，2002)。在1.2%甲醛-MOPS瓊脂糖上分離高分子量的RNA並在17%的變形聚丙烯醯胺凝膠上分級分離低分子量的RNA。探針檢測印跡並如文獻所述洗滌(Borsani等人，2005)。對於實時RT-PCR，使用SuperscriptIIIFirst-StrandSynthesisSupermix(Invitrogen)合成第一鏈cDNA。對miR169前體特異的引物被用於檢測miR169的表達水平(見表1)。引物也被設計為檢測NFYA5的轉錄水平。在iQ5實時PCR檢測系統中用iQTMSYBRGreenSupermix(Bio-Rad)進行實時RT-PCR。各實驗重複三次。採用比較Ct方法。表1_引物名稱(SEQIDNO)序列(5，_3，)_miR169a正向U4)TGGGTATAGCTAGTGAAACGCGmiR169a反向Q5)CCTTAGCTTGAGTTCTTGCGAmiR169b正向U6)CTCCACTCCCTAAACCATCACAACmiR169b反向27)CTCATACGGTCGATGTTAATCCGTmiR169c正向28)CTACATTCACAAACGAGAGAATTmiR169c反向29)GCTCTACTTTAGCATCTCAACCAmiR169h正向30)GTAGTCTTGTGGGATACTCATCAmiR169h反向31)ATCCCCAAATTTGGAGGCCAAACAmiR169i正向32)AAGGTGTCTCCTGGGTTGAAAATmiR169i反向33)CCATGATCATTCATGTCGTGCCTmiR169j正向34)GAGAGCACATCCATGTGAGGAAmiR169j反向35)GTCAGGCAAGTCATCCTTGGCTmiR169k正向36)CTCTTTGGCTATCTTGACATGCTmiR169k反向37)CCAAGGAGACTGCCTGATGTCTmiR1691正向38)GAGAGCACATGAATGTAAGGCAmiR1691反向39)AATAATGTGTAGACTCAGCCACATmiR1691反向40)CTTGCGGGTTAGGTTTCAGGCAmiR169m反向41)GCCTCGAAATCATGAACATTATCTmiR169n正向42)AGAGAGCACATGCATGTATGGAmiR169n反向43)GAAAAGTAGGTATAACATGGATGGNFYA5正向04)GAAGATTCATCTTGGGGAAACTCNFYA5反向05)GAGCAGGAAACACAGAGTCTTGAAt4gl5120正向(46)GGTTGGGTGTTTCCCGGCATCGGAAt4gl5120反向(47)GGCTTCTCCTAAGATCTGATCTCCAAtlgl7170正向(48)CCTTCCCTCCGATCCTTACAAGAAtlgl7170反向(49)CAACCCAAGTTTCTTCCTACGTTCGAt2g37870正向(50)CGTTGAGGCGGCAGGTGAGTGTAt2g37870反向(51)TGTAACGTCCACATCGCTTGCCAAt2g42530正向(52)TCAGTGGCATGGGTTCTTCTTCCAAt2g42530反向(53)GAGGTCATCGAGGATGTTGCCGTAt2g42540正向(54)GTTCTCACTGGTATGGCTTCTTAt2g42540反向(55)GTCTTTCGCTTTCTCACCATCTGCT18S正向(tobaco)(56)AGGAATTGACGGAAGGGCA18S反向(tobaco)(57)GTGCGGCCCAGAACATCTAAGTub8正向(58)ATAACCGTTTCAAATTCTCTCTCTCTub8反向(59)TGCAAATCGTTCTCTCCTTG具有和不具有3』-UTR構建物的定點突變構建物被轉化到根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciensstrain)3301中。收集過夜培養物並與各種組合以11的比例混合。在室溫下在IOmMMgC12、10mMMES(pH5.6)和150μM乙醯丁香酮溫育Ih後，農桿菌懸浮液被共滲到3周齡的菸草本塞姆氏葉子中。在共滲2天後採集葉片並如上所述提取小RNA並印跡。從3周大小的在土壤栽植的相似發育階段的植物收集蓮座葉。立即在液氮中冷凍葉片並通過環境掃描電子顯微鏡觀察(HITACHI，TM1000)保衛細胞。測定氣孔孔徑的寬和長用於統計分析。對於水損失測定，剪下生長在正常環境下3周的每單個突變株和野生型植物的6個葉片並在規定的時間間隔測定鮮重。每個株系進行4次重複。水損失表示為在各時間點的初始鮮重的百分率。根據Rabino和Mancinelli(1986)與Sukar等人，Q006)測定花青苷含量。用991甲醇HCl(v/v)在4°C提取色素並且測定每個樣品的OD53t^POD657，OD530-O.25XOD657用於補償Chl和其產物對在530處貢獻的吸收。通過在37°C在ImgmL15_溴_4_氯_3吲哚β-D-葡糖醛酸、0.IMNa2HPO4緩衝液(ρΗ7.0)、0.5mMK3(Fe[CN]6)和IOmMEDTA中培養轉基因植物過夜，然後用70%乙醇清洗進行⑶S染色的組織化學定位。根據Jefferson(1987)的程序分析⑶S活性。在100μ1提取緩衝液(50mMNaPO4,ρΗ7.OUmMNa2EDTA^O.1%(v/v)TritonX-100,0.1%[w/v]月桂醯肌氨酸鈉和IOmM二硫蘇糖醇)中在4°C以13，OOOrpm離心IOmin均化IOOmg冷凍組織。在0.5-mL添加有ImM4-乙酸4-甲基傘形酯-β-D-葡糖苷酸(Sigma)體積的提取緩衝液溫育2h，接著用0.2MNa2CO3終止反應進行螢光分析。根據隨蛋白質分析試劑盒提供的Bio-Rad手冊確定蛋白質濃度。GUS活性計算為皮摩爾MU每分鐘每毫克蛋白。對於AffymetrixGeneChip陣列分析，野生型和!35S::NFYA5苗子在22°C在16h光和8h黑暗的循環中在MS平板中生長。使用RNeasyPlantMiniKit(Qiagen)提取總RNA並用於製備生物素基互補RNA靶。如Breitling等人Q004)等人所述進行微陣列分析。產生了使用Bioconductorpackage,RankProd(Gentleman等人，2004，Hong等人，2006)上調和下調的基因列表。為了預測共有的新順式調節元件，使用了AlignACE程序(Hughes等人，2000)。該程序應用於上調或下調基因的啟動子序列上遊11Λ。在幾個候選共有元件中，選擇出一個含有弱CCAAT共有基序，其在上調基因的啟動子內發現。NFYA5首先被研究是因為其被注釋為與另一個基因(Atlg54150)在它們的3』UTR區域在反義鏈重疊形成天然的順式-反義轉錄物(NAT)基因配對。NFYA5轉錄物在響應脫水處理時快速積累並在脫水處理開始池後顯示大約30倍的峰誘導(圖1A)。當脫水處理進行更長的時間後，NFYA5的mRNA水平減少，但是仍然高於對照(圖1A)。在遭受乾旱脅迫的生長在土壤中的植物的NFYA5轉錄也被大大地誘導(圖1B)。一些乾旱脅迫誘導的基因表達上調需要ABA積累(Shinozaki和Yamaguchi-Shinozaki，1996；Zhu,2002)由此，檢測NFYA5對ABA處理的反應。在施用100μMABA後MhNFYA5表達增加大約13倍。為了證實ABA與乾旱誘導的NFYA5表達相關，產生ABA缺失(aba2-l)的突變株和ABA敏感的(abil-Ι)突變株。在Col-O和Ler野生型中，通過控水10天強烈地誘導了NFYA5的表達；然而，在aba2-l和abil_l中，乾旱誘導的NFYA5mRNA的積累大大減少(圖1B)。這個結果表明AtNFYA5表達至少部分依賴於ABA信號途徑。儘管實時PCR和RNA印跡分析都顯示響應脫水和乾旱脅迫或ABA而明顯的NFYA5RNA積累的誘導，這些分析不能說明所述增加是否由增加的啟動子活性或改變的RNA穩定導致。為了說明這個問題，使用來自NFYA5起始密碼子上遊的1.71Λ片段構建啟動子GUS融合。在幾個轉基因株系中的GUS染色的分析顯示對脫水應激或ABA處理的響應增加了GUS染色(圖2A)。因此，這些處理的確增加了NFYA5啟動子的轉錄活性。然而，定量分析表明對脫水處理的響應增加了大約5倍的GUS活性。這比通過定量PCR分析觀察到的NFYA5mRNA的30倍上調小的多(圖1A)。因此，除了轉錄誘導外，NFYA5的轉錄後調節也發揮作用。所述啟動子⑶S轉基因株系也用於檢測NFYA5的表達譜。在葉片中NFYA5高表達，其中在葉片微管組織顯著表達，重要地是在保衛細胞中具有高水平的表達(圖2B，圖I和II)。在花組織和根維管束中也觀察到⑶S染色(圖2B，圖III和IV)。在不同組織中的NFYA5mRNA水平的定量PCR分析與GUA染色的組織模式一致，並顯示在葉片和根組織中表達最高，在花組織和莖組織中也存在顯著的表達(圖2C)。在擬南芥中，NF-Y複合物的A亞基由10成員的基因家族編碼。儘管蛋白的其他區變化，但是NF-YA含有高度保守的核心區，該核心區由兩個功能亞區組成NF-YB/NF-YC結合亞區和DNA亞區，它們通過小的連接子連接(Romier等人，2003；Wenkel等人，2006)。PsortII程序預測NFYA5蛋白的定位，準確率為70%。為了證實NFYA5蛋白的亞細胞定位，黃色螢光蛋白(YFP)和NFYA5的C端之間翻譯融合物被轉化到擬南芥中。表達NFYA5-YFP融合蛋白的細胞顯示YFP信號只在核中出現(圖2D)。在脫水下高水平的NFYA5mRNA積累，其不能只通過AtNFYA5的啟動子活性解釋，這強烈地表明在轉錄後轉錄水平上存在另一個調節機制。一種可能是通過小RNA(s)調節。為了開始研究這種可能性，檢索ArabidopsisMPSSPlusDatabase(全球資訊網址mpss.udel.edu/at/)，鑑定了兩個小RNA特徵(17nt)，其與Atlg54150的3，端配對並與AtNFYA5的3，UTR互補。在ArabidopsisMPSSPlusDatabase中的小RNA特徵與ASRP小RNA資料庫(全球資訊網:asrp.cgrb.oregonstate.edu)中的ASRP1815(19nt)部分相同。因此，設計了與ASRP1815互補的寡核苷酸探針(圖3A)。使用該寡核苷酸探針，檢測到在正常生長條件下的植物中的21-nt小RNA。在進行控水10天的植物中，ASRP1815小RNA的水平降低到在未脅迫的植物中水平的(圖3B)。在該同樣的處理中，對乾旱脅迫的響應使NFYA5的表達增加14倍。這與在乾旱下ASRP1815表達的減少可以降低小RNA指導的NFYA5mRNA降解的可能性一致。也與ABA誘導的NFYA5mRNA積累一致，ABA處理抑制ASRP1815的水平約為對照水平的16%(圖。在Col-O和Ler野生型中，乾旱脅迫強烈地誘導ASRP1815的表達；然而，在aba2_landabil-1突變體中ASRP1815表達基本不受乾旱的影響(圖;3B)。因此，乾旱脅迫對ASRP1815的抑制依賴於ABA信號轉導。NFYA5和Atlg54150形成NAT基因對的事實產生了可能性它們可以產生調節NFYA5的nat-siRNA。nat-siRNA的生物合成需要DCL2或DCLl、RDR6、SGS3和NRPDla(Borsani等人，2005；Katiyar-Agarwal等人，2006)。為了檢測ASRP1815是否為nat-siRNA，檢測在缺乏已知對生物合成特定類型的小RNA所需的各種蛋白的突變體中的其生物合成。ASRP1815仍然在dcl3、rdr2、dcl4、dcl2、rdr6、sgs3或nrpdla中產生(圖3C)。這表明其不是前述類型的異染色質siRNA、tasiRNA或nat-siRNA。相反，ASRP1815在henl、del1-7和hyll(Figure3C)中不存在。對這些組分的需要表明ASRP1815可能是微RNA。NFYA5表達的破壞對ASRP1815的影響很小，這與ASRP1815不是nat_siRNA的觀點一致。檢測了ASRP1815小RNA不存在的突變體中NFYA5mRNA的水平。NFYA5mRNA的水平在henl、dcll-7和hyll中高於野生型(圖3D)。這個結果表明ASRP1815的確下調了NFYA5表達。HEN1、DCL1和HYLl的需要表明miRNA用ASRP1815探針檢測。因此，在小RNA資料庫中進行檢索與ASRP1815同源的序列，發現ASRP1815與miR16W21nt)家族的序列同源。擬南芥中miR169家族含有14個成員，並且該miRNA家族在水稻和毛果楊(Populustrichocarpa)是保守的(Bonnet等人，2004Jones-Rhoades禾口Bartel，2004；Sunkar合Zhu,2004；Sunkar等人，2005)。基於產生的miRNA序列，可以將MIR169a/b/c//h/i/j/k/l/m/n家族分為三個亞組。MIR169a代表第一個亞組，MIR169b和MIR169c形成了第二個組，第三個組由MIR169h/i/j/k/l/m/n組成。這些亞組的主要不同是3，端的序列MIR169a的最後兩個核苷酸是G和A，然而MIR169b/c和MIR169h/i/j/k/1/m/n的最後兩個核苷酸分別是GGUG0而且，MIR169h/i/j/k/l/m/n的5，端是UA，這與其他兩個亞組的CA不同。因為它們的序列相似性，IOR169家族成員由於交叉雜交而不能在小RNA印跡中得到區分。為了確定MIR169哪一個基因座可以調節NFYA5，用miR169基因座特異的引物進行實時RT-PCR，以確定miR169基因座的任一個是否被乾旱脅迫調節。從經過控水10天的生長在土中的擬南芥植物提取RNA。只有iOR169a和iOR169c顯示對乾旱脅迫響應的轉錄物豐度的基本改變(圖4A)。iOR169a和fflR169c兩者都被乾旱脅迫下調，這與乾旱下調成熟miRNA的結果一致。進行進一步的實驗以確定MIR169a和MIR169c是否下調AtNFYA5mRNA。在許多情形下，已經假定miRNA家族的成員具有最豐富的功能；然而，Sieber等人，O007)最近提出了證據表明被預測靶向相同基因的密切相關的miRNAs事實上在發育期間具有不同的功能。為了證實fflR169a或fflR169c是否可以在調節NFYA5表達中具有特定的作用，在菸草本塞姆氏中進行了瞬時共表達。因為miR169的靶位點位於NFYA5的3』UTR，所以檢測了三個NFYA5構建物包括3』UTR的全長NFYA5、沒有3』UTR的構建物和在3，UTR突變以引入在3，UTR和miR169之間的四個錯配的另一個構建物(圖4B)。NFYA5和miR169a或miR169c構建物都在35S啟動子的控制下表達。在菸草本塞姆氏中共表達2天後，提取RT-PCRRNA並通過定量定量RT-PCR分析。來自缺少功能性miR169靶位點的構建物、NFYA5cds和NFYA5突變體的mRNA水平沒有受到與miR169共表達的影響(圖4C)。然而，當與iOR169a共表達時，NFYA5mRNA的水平顯著減少(對照水平的37%)(圖4C)。有趣的是，與miR169c的共表達只導致NFYA5轉錄物水平減少13%。這些結果表明NFYA5mRNA的降解主要受到iOR169a指導。從相同樣品製備並用與互補MIR169的寡核苷酸探測的小RNA印跡清楚地顯示21-nt小RNA在所有的共表達樣品中高度表達。由此，miR169c不能指導強的AtNFYA5裂解不是由於缺乏miR169c表達。為了證實這些結果，在擬南芥中過表達MIR169a和fflR169c前體並選擇具有相似miR169表達水平的株系，以定量miR169a和miR169c過表達對NFYA5表達的影響(圖4D)。與瞬時共表達分析結果一致，miR169a的過表達導致比miR169c過表達更大的NFYA5mRNA水平減少(圖4E)。也選擇miR169家族的兩個其它成員，miR169b和miR169h，而且他們也在擬南芥中過表達。NFYA5的相對mRNA水平沒有顯著改變，儘管miRNA過表達(圖9)。這些結果再次表明iOR169a作為主要的miRNA基因座對調節AtNFYA5的表達是重要的。乾旱反應基因調節和ABA信號轉導對抗旱是至關重要的(Pei等人，1998；Zhu,2002)。乾旱和ABA誘導的NFYA5表達和其在保衛細胞中的強表達促使我們分析其在抗旱中的潛在作用。首先，其中NFYA5mRNA的水平為野生型的33%的過表達miR169a的植物(35S::MIR169a，株系#15)被檢測(圖4D)。野生型和35S::MIR169a_15植物生長在土壤中3周，接著進行控水8天。35S::MIR169a-15植物顯示葉片捲曲並且葉片變紫，然而野生型植物仍然飽滿，葉片仍然為綠色(圖5A)。這個結果表明35S::MIR169a-15植物可能已經比野生型植物更快地耗竭土壤水並由此更快地枯萎。為了研究這種可能性，分析來自生長在土壤中的35S::MIR169a-15和WT植物以確定他們的氣孔孔徑。35S::MIR169a_15葉片的氣孔孔徑指數為0.25，其比WT的大約20%(圖5B)。與這些結果一致，35S::MIR169a_15脫落的葉片一直比野生型的脫落葉片更快地失水(圖5C)，這表明在控水後35S::iOR169a-15更快地出現枯萎，這可能至少部分是由於這些植物不能有效地關閉他們的氣孔和減少蒸騰。一位ABA是氣孔孔徑和蒸騰的調節者，所以這種表型與ABA誘導的NFYA5表達一致，表明了NFYA5對於保衛細胞中的ABA信號轉導可能是重要的。應激敏感性的另一個指示物是葉片中紫色的類黃酮色素、花青苷的積累。在35S::MIR169a-15植物中控水8天後花青苷水平為19.41μgg-lFW，這大約是野生型的3倍，這再一次支持了35S::MIR169a_15對乾旱脅迫更敏感。這些結果表明NFYA5的充分表達為抗旱所需。搜索公眾可獲得的T-DNA保藏並從ArabidopsisBiologicalResourceCenter獲得了T-DNA插入突變體(SALK_042760，Columbia背景)，以進一步研究NFYA5的功能。通過對T-DNA側翼區PCR和測序T-DNA插入純合的植物證實在NFYA5的啟動子區的插入位點(圖6A)。RNA印跡分析表明NFYA轉錄物不存在於命名為nfya5的T-DNA株系中(圖6A)。與35S::MIR169a-15植物的表型一直，nfya5敲除的突變植物也對乾旱脅迫高度敏感(圖6B)。nfya5葉片的氣孔孔徑指數為0.27，這比野生型葉片大42%(圖6C)。與這些結果一致，nfya5脫落的葉子比野生型的脫落的葉子更快地失水(圖6D)。在nfya5葉子中的花青苷水平在控水8天後為野生型的4倍，這再一次支持了nfya5植物對乾旱脅迫更加敏感。這些結果證實NFYA5是抗旱因子。為了進一步表徵NFYA-5在抗旱中的功能，產生過表達在組成型的CaMV35S啟動子控制下的基因的轉基因擬南芥植物。基於他們高水平的NFYA5表達選擇三個轉基因株系(#2，3和5)用於進一步的分析(圖7A)。為了評價NFYA5過表達的影響，3周大小的生長在土壤中的野生型和35S::NFYA5植物經控水14天。在控水的第14天，大多數的野生型植物顯示失水，但是35S::NFYA5植物顯示比野生型失水少(圖7B)。與nfya5相反，35S::NFYA5_3的氣孔孔徑比野生型小(圖7C)。35S::NFYA5-3的脫落的葉片比野生型更慢地失水(圖7D)並且35S::NFYA5-3中葉片中的花青苷水平在控水14天後要低得多(圖6E)。這些結果表明NFYA5過表達增加抗旱。NFYA5的核定位和DNA結合結構域表明蛋白可以在調節對抗旱重要的其它基因的表達中發揮作用。為了檢測這種可能性，通過使用AffymemetrixArabidopsisATHl基因晶片進行微陣列試驗。與在非應激條件下的野生型苗子相比，在35S::NFYA5中總共28個基因顯示了35S::NFYA5表達改變2倍或更多，其中在所述轉基因植物中分別有17個基因和11個基因增加或減少(表2)。這些基因的大多數具有已知的或假定的與非生物應激反應相關的功能，並且他們中的一些似乎參與氧化應激(例如，細胞色素M-f複合體的亞基、GST、過氧化物酶和氧化還原酶家族蛋白)。在NFYA5異位表達影響的這些基因中，如預期的一樣，他們中多數在啟動子區域中含有的CCAAT基序(表幻，因為這種短序列基序一般能夠大量的基因啟動子片段中發現。使用AlignACE程序(Hughes等人，2000)，鑑定了一個順式調節元件TX(C/A)TTXGX(C/A)CAXT(SEQIDNO:60)，其在一亞組基因的啟動子中含有「CCAAT基序」，所述亞組基因在NFYA5過表達的植物中顯示表達增加(表幻。這些基因是NFYA5的直接靶是可能的。表2.在微陣列分析中在35S::NFYA5轉基因植物中表達改變至少2倍(P<0.05)的基因列表權利要求1.分離的多核苷酸，包括可操作地接至異源啟動子的NFY5A多核苷酸、其同系物或直向同源物。2.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述NFY5A包括與選自SEQIDN0:l、3、5或7的多核苷酸具有至少50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%或99%的同一性。3.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述NFY5A包括SEQIDN0:l、3、5或7。4.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述NFY5A多核苷酸編碼包括SEQIDNO:2、4、6或8的多肽。5.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述NFY5A多核苷酸編碼與SEQIDNO:2、4、6或8具有至少80%同一性的多肽，其中所述多肽改變植物細胞中的氣孔開口。6.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述異源啟動子包括組成型啟動子。7.權利要求1的分離的多核苷酸，其中所述異源啟動子包括誘導型啟動子。8.權利要求1的多核苷酸，其被包含在表達載體中。9.權利要求6的多核苷酸，其中所述組成型啟動子選自下組花椰菜花葉病毒35S啟動子或19S啟動子、植物ACT2啟動子和植物泛素啟動子。10.權利要求6的多核苷酸，其中所述組成型啟動子是衍生自擬南芥的肌動蛋白2啟動子。11.權利要求7的多核苷酸，其中所述誘導型啟動子包括光誘導型啟動子。12.權利要求11的多核苷酸，其中所述光誘導型啟動子是大豆的SRSl啟動子。13.用權利要求1-12任一項的多核苷酸的轉化的植物細胞。14.轉基因植物，其以比野生型植物更高的水平表達權利要求1的多核苷酸，並且所述轉基因植物具有增加的耐旱性。15.轉基因植物，其缺乏NFY5A基因、其同系物或直向同源物的3'UTR，並且與野生型植物相比具有增加的耐旱性。16.轉基因植物，其包括miR169a或miR169c多核苷酸的減少表達，並且與野生型植物相比包括增加的耐旱性。17.權利要求16的轉基因植物，其中所述miR169與SEQIDNO:61至少98%或99%相同。18.轉基因植物，其包括miR169a或miR169c多核苷酸的敲除，並且與野生型植物相比具有增加的耐旱性。19.從權利要求14-18任一項的轉基因植物獲得的植物部分或細胞。20.利用權利要求1-12任一項的多核苷酸產生抗旱植物的方法，包括將所述多核苷酸導入植物細胞或植物組織中，篩選所述多核苷酸分子的存在以產生轉基因植物細胞或轉基因植物組織，和從所述轉基因植物細胞或轉基因植物組織再生植株，由此產生抗旱植物。21.用於鑑定可用於改變植物抗旱性的製劑的方法，包括將含有NFY5A基因的植物與製劑接觸；測定細胞中所述基因表達的變化或存在的mRNA轉錄物的量的變化；其中與對照相比表達的增加或轉錄物水平的增加指示了增加耐旱性的製劑。22.用於鑑定可用於改變植物耐旱性的製劑的方法，包括將植物與製劑接觸，所述植物包含可操作連接到報告基因的序列TX(C/A)TTXGX(C/A)CAXT(SEQIDNO60)；測量所述報告基因表達的變化；其中與對照相比報告基因表達的變化指示了改變耐旱性的製劑。23.增加植物耐旱性的方法，包括將植物與增加(1)NFY5A基因、其同系物或直向同源物和/或(表2所列基因的表達的製劑接觸。全文摘要本公開提供用於產生抗旱植物的多核苷酸，包括改變這樣的多核苷酸的表達的轉基因植物及其後代。也提供了用於提供植物抗旱性的分子。文檔編號C12N15/29GK102124110SQ200980125123公開日2011年7月13日申請日期2009年4月30日優先權日2008年4月30日發明者朱健康,李文學申請人:加利福尼亞大學董事會