一種半夏離體塊莖的高效誘導方法
2023-07-03 14:14:16 1
專利名稱：一種半夏離體塊莖的高效誘導方法
技術領域：
本發明涉及通過組織培養技術的植物再生，尤其涉及一種培養半夏離體塊莖的方法。
背景技術：
半夏(Pinellia.ternata.(Thumb)Breit)為天南星科多年生宿根草本植物，基部形成塊莖，是主要的貯存器官和繁殖器官。含生物鹼、半夏蛋白等多種有效成分，入藥有燥溼化痰、降逆止咳、抗早孕、抗腫瘤等多種藥理作用，是我國特有的一種傳統中藥材，需求量較大。由於過度採集，半夏的野生資源已近枯竭。半夏有三種繁殖方式通過種子繁殖，小塊莖繁殖和珠芽繁殖，在自然進化中已形成了以無性繁殖為主的生殖特點，故人工栽培一般採用小塊莖作為繁殖器官。以上方法由於繁殖係數低，限制了半夏的大田生產。同時由於長期的無性繁殖，病毒侵染並不斷積累在塊莖中，導致其產量和藥用成分下降。
塊莖(鱗莖、球莖、塊根)是植物莖的一種變態，是一種遺傳性狀，但它的發生和發育在很大程度上受環境、營養條件的影響。植物離體培養中，通過添加外源物質影響植物內部生化反應進而影響植物的形態發生，誘導其形成離體塊莖(鱗莖、球莖、球根)等，這已在多種植物上試驗成功。組織培養快速繁殖方法能夠培養出脫去病毒的種苗(即脫毒種苗)。有關半夏組織培養的研究較多，且已能進行規模化生產。但是以往半夏常規組培快繁是通過半夏組織培養出半夏苗，要經過生根、煉苗、移栽等程序，較繁瑣，且受移栽成活率的影響，在移栽於大田一段時間後才能形成塊莖。半夏脫毒試管苗應用於大田生產需嚴格的馴化條件和管理操作。
發明內容
本發明的目的是提供一種高效誘導半夏離體塊莖的方法，生產半夏離體塊莖，克服半夏試管苗應用上的缺點。
它是將脫病毒半夏2-20mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出2-5cm無根芽；取繼代培養的脫毒三葉半夏2-5cm的生長試管芽，用於離體塊莖誘導，在誘導前先轉入MS基本培養基培養7-14天；用繼代培養基作轉移培養；用生根培養基作生根培養；用離體塊莖誘導培養基作離體塊莖誘導培養；培養基pH值為5.6-6.0，含瓊脂4.5-5.0g/L，常規溼熱滅菌20-22min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1000-2000lx，光照10-12h/d，溫度22-28℃。
繼代培養基組成的重量比為MS基本培養基∶細胞分裂素∶萘乙酸∶瓊脂粉∶蔗糖＝1000000∶0.5-1.2∶0.001-0.2∶4500-5000∶20000-30000；生根培養基組成的重量比為∶MS基本培養基∶萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.1-0.3∶200-600∶4500-5000∶15000-30000；離體塊莖誘導培養基組成的重量比為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶15000-120000∶0.5-1.5∶0.01-12.8∶500-2500∶0.005-0.5∶0.2-20.0∶0.05-0.5∶4500-5000。
本發明具有較強的抗逆性、貯藏性，不需特殊馴化可直接移栽於大田，不受生產季節的限制，可全年生產。離體塊莖的高效誘導是半夏脫毒苗生產與大田生產的對接技術，具有較大的生產應用價值。適宜條件下誘導形成離體塊莖外型、大小一致，發生同步性好，且可人為控制其生長發育。另外，離體塊莖發生發育利於種質資源保存和國際間交流，可直接作為繁殖材料應用於生產，節約了原種的繁殖空間，還可縮短大田生長周期，避免種苗遠程運輸和貯存過程中的種種問題，具有較廣闊的應用前景。與馬鈴薯類似，半夏離體塊莖形成還可作為研究半夏生理學、細胞學、酶學等的材料，有較大的應用價值。
具體實施例方式MS基本培養基配方為(單位mg/L)貯備液INH4NO3，33000；KNO3，38000；CaCL2.2H2O，8800；MgSO4.7H2O，7400；KH2PO4，3400。
貯備液IIKI，166；H3BO3，1240；MnSO4.4H2O，4460；ZnSO4.7H2O，1720；Na2MoO42H2O，50；CuSO4·5H2O，5；CoCL2·6H2O，5。
貯備液IIIFESO4·7H2O，5560；Na2·EDTA·2H2O，7460；貯備液IV肌醇，20000；煙酸，100；鹽酸吡哆醇，100；鹽酸硫胺素，100；甘氨酸，400。
製備1升MS培養基，取50ml貯備液I，5ml貯備液II，5ml貯備液III，5ml貯備液IV。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。
具體實施例
實施例1脫毒半夏2mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出2cm無根芽；取2cm的脫毒苗，在誘導前先轉MS基本培養基培養8天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.1∶200∶4500∶15000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶30000∶0.5∶5.0∶500∶0.005∶0.2∶0.05∶4800，40天後測重，單個塊莖重為0.653克。培養基pH值為5.6，含瓊脂4.5g/L，常規溼熱滅菌20min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1000lx，光照10h/d，溫度22℃。
實施例2脫毒半夏3mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出3cm無根芽；取3cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養7天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.3∶600∶5000∶30000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶15000∶1.0∶0.05∶2500∶0.05∶2.0∶0.5∶5000，40天後測重，單個塊莖重為0.776克。培養基pH值為5.8，含瓊脂4.7g/L，常規溼熱滅菌21min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1200lx，光照11h/d，溫度23℃。
實施例3脫毒半夏10mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出4cm無根芽；取4cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養10天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.2∶300∶4800∶25000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶20000∶1.5∶0.5∶2500∶0.5∶20.0∶5∶4500，40天後測重，單個塊莖重為0.556克。培養基pH值為6.0，含瓊脂5.0g/L，常規溼熱滅菌22min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度2000lx，光照12h/d，溫度28℃。
實施例4脫毒半夏20mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出4cm無根芽；取4cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養8天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.15∶400∶4900∶29000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶70000∶1.0∶0.5∶1000∶0.05∶2.0∶0.5∶50000，40天後測重，單個塊莖重為0.852克。培養基pH值為5.9，含瓊脂4.9g/L，常規溼熱滅菌21min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1800lx，光照12h/d，溫度27℃。
實施例5脫毒半夏19mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出4cm無根芽；取4cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養13天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.25∶500∶4200∶12000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶110000∶1.5∶5.0∶25000∶0.5∶0.2∶5∶4500，40天後測重，單個塊莖重為0.539克。培養基pH值為6.0，含瓊脂4.9g/L，常規溼熱滅菌22min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1700lx，光照11.5h/d，溫度26.5℃。
實施例6脫毒半夏15mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出5cm無根芽；取5cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養12天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.27∶240∶4800∶28000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶16000∶1.4∶0.05∶1000∶0.005∶20.0∶0.05∶4700，40天後測重，單個塊莖重為0.622克。培養基pH值為5.8，含瓊脂5.0g/L，常規溼熱滅菌20min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1900lx，光照12h/d，溫度28℃。
實施例7脫毒半夏17mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出4.5cm無根芽；取4.5cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養7天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.22∶350∶4480∶17000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶90000∶1.0∶0.05∶2500∶0.5∶0.2∶5∶4900，40天後測重，單個塊莖重為0.563克。培養基pH值為5.6，含瓊脂4.6g/L，常規溼熱滅菌20min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1500lx，光照12h/d，溫度23℃。
實施例8脫毒半夏16mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出2.5cm無根芽；取2.5cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養14天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.11∶210∶4100∶16000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶120000∶1.5∶12.8∶580∶0.05∶20∶0.05∶4800，40天後測重，單個塊莖重為0.596克。培養基pH值為6.0，含瓊脂4.9g/L，常規溼熱滅菌21min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1800lx，光照10.5h/d，溫度24℃。
實施例9脫毒半夏14mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出3.5cm無根芽；取3.5cm的脫毒苗，在誘導前先轉入MS基本培養基培養9天，用生根培養基培養，生根培養基組成比例為萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.29∶580∶4600∶24000，後用離體塊莖誘導培養基進行離體塊莖誘導培養，離體塊莖誘導培養基為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶110000∶0.8∶11.0∶2400∶0.005∶20.0∶0.5∶5.0，40天後測重，單個塊莖重為0.560克。培養基pH值為5.7，含瓊脂5.0g/L，常規溼熱滅菌20min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1600lx，光照12h/d，溫度28℃。
對照例1與誘導培養離體塊莖的同時，用與誘導培養離體塊莖的脫毒苗同樣大小的高2cm的脫毒苗轉入生根培養基至根長1~2cm時開蓋煉苗2~3天，移栽於裝有經消毒處理的泥炭土+珍珠巖+蛭石(體積比5∶1∶3)的育苗盤中，置馴化室。10天後移栽於經過消毒處理的防蟲溫室中。脫毒苗移栽60天後挖取塊莖稱量平均鮮重為0.515g，平均直徑為1.224cm，儘管與離體塊莖相比生長時間長，但其直徑、鮮重比離體塊莖仍明顯偏小。
對照例2與誘導培養離體塊莖的同時，用與誘導培養離體塊莖的脫毒苗同樣大小的高5cm的脫毒苗轉入生根培養基至根長1~2cm時開蓋煉苗2~3天，移栽於裝有經消毒處理的泥炭土+珍珠巖+蛭石(體積比5∶1∶3)的育苗盤中，置馴化室。10天後移栽於經過消毒處理的防蟲溫室中。脫毒苗移栽60天後挖取塊莖稱量平均鮮重為0.520g，平均直徑為1.230cm，儘管與離體塊莖相比生長時間長，但其直徑、鮮重比離體塊莖仍明顯偏小。
權利要求
1.一種半夏離體塊莖的高效誘導方法，其特徵在於脫毒半夏2-20mm叢生芽及同齡未脫毒母株三葉半夏組培苗，繼代培養於繼代培養基上，至長出2-5cm無根芽；取繼代培養的脫毒三葉半夏2-5cm的生長試管芽，用於離體塊莖誘導，在誘導前先轉入MS基本培養基培養7-14天；用繼代培養基作轉移培養；用生根培養基作生根培養；用離體塊莖誘導培養基作離體塊莖誘導培養；培養基pH值為5.6-6.0，含瓊脂4.5-5.0g/L，常規溼熱滅菌20-22min，赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯過濾滅菌後無菌加入滅菌過的培養基中，光照強度1000-2000lx，光照10-12h/d，溫度22-28℃。
2.根據權利要求1所述的一種半夏離體塊莖的高效誘導方法，其特徵在於，所述的繼代培養基組成的重量比為MS基本培養基∶細胞分裂素∶萘乙酸∶瓊脂粉∶蔗糖＝1000000∶0.5-1.2∶0.001-0.2∶4500-5000∶20000-30000。
3.根據權利要求1所述的一種半夏離體塊莖的高效誘導方法，其特徵在於，所述的生根培養基組成的重量比為MS基本培養基∶萘乙酸∶活性炭∶瓊脂粉∶蔗糖＝500000∶0.1-0.3∶200-600∶4500-5000∶15000-30000。
4.根據權利要求1所述的一種半夏離體塊莖的高效誘導方法，其特徵在於，所述的離體塊莖誘導培養基組成的重量比為MS基本培養基∶蔗糖∶細胞分裂素∶多效唑∶活性炭∶赤黴素∶二氫茉莉酸丙酯∶脫落酸∶瓊脂粉＝1000000∶15000-120000∶0.5-1.5∶0.01-12.8∶500-2500∶0.005-0.5∶0.2-20.0∶0.05-0.5∶4500-5000。
全文摘要
本發明公開了一種半夏離體塊莖的高效誘導方法。它是用繼代培養基作轉移培養；用生根培養基作生根培養；用離體塊莖誘導培養基作離體塊莖誘導培養。繼代培養基組成為MS基本培養基、細胞分裂素、萘乙酸、瓊脂粉、蔗糖；生根培養基組成為MS基本培養基、萘乙酸、活性炭、瓊脂粉、蔗糖；離體塊莖誘導培養基組成為MS基本培養基、赤黴素、脫落酸、二氫茉莉酸丙酯、蔗糖、多效唑、細胞分裂素、活性炭、瓊脂粉。半夏離體塊莖具有較強的抗逆性，不需特殊馴化可直接移栽於大田，不受生產季節的限制，可全年生產。離體塊莖的高效誘導是半夏脫毒苗生產與大田生產的對接技術，具有較大的生產應用價值。
文檔編號A01H4/00GK1701660SQ20051004974
公開日2005年11月30日 申請日期2005年4月30日 優先權日2005年4月30日
發明者陳集雙, 王海麗, 竺錫武, 何煜波, 張凱, 陳新愛, 黃幸雷 申請人:浙江理工大學