一株紡錘芽孢桿菌及其在乾旱山地造林中的應用的製造方法與工藝
2023-06-03 02:54:36
本發明涉及一種紡錘芽孢桿菌及其在乾旱山地造林中的應用。
背景技術：
隨著全球氣候與環境的變化，加之降水季節和地域分布極不均勻，水資源短缺日趨明顯，土壤有效含水量逐年減少，必將影響植物個體的生長、發育和繁殖。在一些乾旱瘠薄山地地區，土壤養分貧瘠，水資源短缺，造林成活率極低，對生態環境產生嚴重影響，如何提高這些地區的造林成活率和存活率顯得尤為重要。目前，通過接種外源基因的和人工合成菌劑來提高植物在乾旱環境中適應能力，是近年來國內外研究的一個熱點領域。PGPR是指生存在植物根圈範圍中，對植物生長有促進或對病原菌有拮抗作用的有益細菌統稱，對植物生長及病害防治有極其重要的作用。目前關於PGPR篩選及應用研究報導很多，大量文獻證明，PGPR可改善植物生長的根際土壤生態環境，尤其是促進根際土壤的群落結構多樣性，促進植物生長和乾物質積累。本發明人從核桃根際土壤中篩選出了一株適宜乾旱環境中應用的蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)L90，可提高核桃的乾旱適應能力，已經獲得專利授權，專利號：201310654963.9。然而，乾旱生境中，大量微生物不能成活，不同的環境條件，諸如氣象、溫度、水分、土壤性質或其他土著微生物活力等均會對細菌生長造成影響，在乾旱生境中接種一些常用的PGPR對植物抗旱能力影響有限。因此，繼續篩選乾旱生境下應用的根際促生細菌，對提高植物的抗旱能力，提高幹旱瘠薄本山地的造林成活率，改善生態環境具有重要的意義。
技術實現要素：
本發明的目的就是為了解決上述問題，提供一種紡錘芽孢桿菌及其在乾旱山地造林中的應用。為了實現上述目的，本發明採用如下技術方案：一種紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)L106，已於2013年5月31日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.7666，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，郵編：100101。含有上述紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)L106的組合物。一種菌劑，其活性成分上述的紡錘芽孢桿菌。所述的菌劑還包括載體；所述載體為固體載體或液體載體。所述菌劑的劑型為液劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可溼性粉劑或水分散粒劑。一種復配菌，包括紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)L106。上述的紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)L106、菌劑或復配菌在乾旱山地造林中的應用。優選：所述的乾旱山地為金銀花的乾旱山地。所述菌劑的製備方法：將紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)L106接入牛肉膏蛋白腖培養基振蕩發酵培養製成。優選：應用的具體步驟為：將上述的菌液稀釋90-150倍(優選100倍)，均勻澆灌至苗木周圍即可。本發明的有益效果：本發明的紡錘芽孢桿菌(Bacillusfusiformis)L106，應用到金銀花的乾旱山地造林中，同接種普通根際促生細菌均相比，可顯著提高造林成活率、存活率，同時可促進造林植物的生長，提高植物的抗乾旱能力。因此，本發明為提高植物的抗旱能力提供了優良的菌株資源，為提高幹旱山地造林成活率提供了新的方法。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步說明。1.菌株的分離：採集山東省新泰市汶南鎮長期處於乾旱環境的果園土壤4個。通過梯度稀釋法，從土樣中分離出細菌分離物。通過三區劃線法對分離到的細菌進行純化，並通過鏡檢判斷菌株是否純化，對純化後的細菌進行編號，挑取單菌落，轉接到LB斜面上保存備用。向含有L-色氨酸的R2A液體培養基中接菌，28℃，180rpm，搖床培養4d。取50微升菌懸液滴於白色陶瓷板上，同時加入50微升Salkowski比色液(50ml35％HCLO4+1ml0.5mol/LFeCl3)。將加入50mg/LIAA的比色液作為陽性對照。白色陶瓷板於室溫避光放置30min後觀察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA，初篩出分泌IAA的細菌。然後通過小麥保綠法篩選出14株保綠效果較好的菌株，結合蘿蔔子葉增重法，最終通過金銀花的乾旱脅迫盆栽試驗篩選出1株具有應用潛力的細菌，記為L106。2.菌株的鑑定(1)菌落特徵及菌體形態紡錘芽孢桿菌L106在LB平板上培養24h後形成乳白色菌落，不透明，圓形，邊緣整齊光滑，中間有突起褶皺，菌體細胞大小為(0.5-2.5)μm×(1.2-10)μm，產芽孢，G+，細胞呈杆狀。培養的細胞經掃描電鏡觀察，細胞呈杆狀,周生鞭毛,無莢膜,細胞質均勻。芽孢端生,孢囊膨大,(2)生理生化特徵革蘭氏染色試驗陽性，馬尿酸鹽水解試驗陰性，酪氨酸水解試驗陰性，澱粉水解試驗陰性，明膠液化試驗陽性，葡萄糖產酸試驗陰性，葡萄糖產氣陰性，木糖產酸試驗陰性，麥芽糖產酸試驗陰性，伏-普試驗陰性，甲基紅試驗陰性，吲哚試驗陰性，硝酸鹽還原實驗陰性。(3)產吲哚乙酸(IAA)能力測定將紡錘芽孢桿菌L106接種於LB培養基，28℃，180rpm搖床培養4d。用分光光度法測定菌懸液的OD600值，然後將菌懸液10000rpm離心10min，取上清液加入等體積Salkowski(50mL35％HClO4+1mL0.5MFeCl3)比色液，避光靜置30min，測定其OD530值。計算菌濃度OD600值為1時，單位體積發酵液中IAA的含量，通過IAA梯度稀釋的標準曲線計算IAA的含量。通過測定，紡錘芽孢桿菌L13產IAA含量為92.51μg/(mL·OD600)-1。(4)解磷能力分析菌株在固體培養基上解磷能力的測定：分別把菌株接種於無機磷固體培養基中，分別倒置於37℃、28℃恆溫箱中培養7d，觀察透明圈的產生情況。結果表明，L106不具備解磷能力。(5)產蛋白能力分析採用Folin酚法。將1mL原發酵液加2mL質量分數為0.5％的酪蛋白液在pH值7.0、37℃水浴15min，再用質量分數為10％的三氯乙酸滅活，然後取1mL上述反應液的離心上清液加1mLFolin酚在5mL0.55mol/L的Na2CO3的鹼性條件下37℃水浴15min測660nm下的吸光度值。以加滅活酶液的反應系統為空白。在此反應條件下定義：每1min生成1ug酪氨酸所需酶量定義為一個酶活。L106發酵24h後酶活達到28.54ug/ml，48h後酶活達到69.67ug/ml。(6)16SrDNA序列分析將所測16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示與GenBank資料庫中的序列比對，結果表明：L106同Bacillusfusiformis在一個最小分支...