一種人唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的檢測方法
2023-06-03 14:47:21
專利名稱：一種人唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的檢測方法
技術領域：
本發明屬於口腔流行病學技術領域，更具體涉及一種人唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的檢測方法。
背景技術：
齲病是一種細菌感染性疾病。大量研究表明，主要致齲微生物為變形鏈球菌組。變形鏈球菌組有幾種方法。目前普遍將變形鏈球菌組分為若干獨立菌種。在人類中普遍流行的血清型c及與其具有血清交叉反應的e和f型稱為「變形鏈球菌」(Streptococcus mutans，S.mutans)。D，g型稱為茸毛鏈球菌或遠緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus，S.sobrinus)，前兩種細菌在人類檢出率較高。而其他幾種變形鏈球菌組成員，如倉鼠鏈球菌(S.cricetus，血清型a)、鼠鏈球菌(S.rattus，血清型b)、猴鏈球菌(S.macacae，血清型e)、道勒鏈球菌(S.downei，血清型h)，很少在人類中檢出。因此，在變形鏈球菌組中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌為人類的主要致病菌。長期以來，變鏈菌備受關注。但近來的一些研究表明，茸毛鏈球菌與變形鏈球菌相比，可能具有更強的致齲潛力，對齲病的發生和活躍性可能更為重要。當唾液和牙菌斑中變形鏈球菌與茸毛鏈球菌同時存在時，此僅單一存在變形鏈球菌或茸毛鏈球菌齲病發生率顯著增高(Hirose H，Hirosek，Isogai E，eta1.Close association between Streptococcus sobrinus in the saliva of youngchildren and smooth-surface caries increment.Caries Res，1993，27(4)292)(Lindquist B，Emilson CG，et al.Differences in cariogenicity betweenfresh isolates of Streptococcus sobrinus and Streptococcus mutans.CariesRes，1991，25(2)146)。變形鏈球菌單獨感染的情況較常見，而茸毛鏈球菌常在有較多變鏈的宿主口內或能分離出變鏈菌的牙齒上存在。
以往的區分和鑑定變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的方法包括在輕唾培養基上觀察菌落形態、生化鑑定、免疫血清學鑑定、DNA探針等方法。但這些方法存在著費時、靈敏度不高等缺點。
PCR是一種DNA體外擴增技術，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時，對待檢原始材料質量要求低等特點。
近來，有許多研究者用PCR檢測口腔病源菌。Allaker選擇變鏈菌表面蛋白基因(spaP gene)中192bp片段作為特異性擴增片段，檢測在齲損的釉牙本質界(enamel-dentine junction，EDJ)的變形鏈球菌的檢出率；還將PCR法檢測出變形鏈球菌的檢出率與一種齲損染色劑的染色效果作了相關分析，結果表明兩者密切相關，推測治療過程中充分去除染色的組織將可預防可能殘餘的變鏈菌對牙體組織的繼續侵蝕。另外，分別有學者根據牙齦卟啉菌(Porphyromonas gingivalis，P.g)中纖毛基因(fimA gene)、膠原酶基因(collagenase gene)、16S rRNA基因等序列設計特異性引物，進行PCR反應，以鑑定牙齦卟啉菌，並用PCR反應檢測不同人群牙菌斑及唾液中牙齦卟啉菌的檢出率。至今，用PCR反應檢測不同人群牙菌斑及唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌國內外少見報導。
發明內容
本發明的目的是提供了一種人唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的檢測方法，能快速檢測變形鏈球菌和茸毛鏈球菌，方法簡單，成本低廉。
變形鏈球菌產生三種葡糖基轉移酶(glucosyltransferase，GTF)GTF-I(合成非水溶性葡聚糖的GTF)、GTF-SI(合成水溶性和非水溶性葡聚糖的GTF)、GTF-S(合成水溶性葡聚糖的GTF)。茸毛鏈球菌產生四種葡糖基轉移酶-GTF-I，GTF-S，GTF-SA，GTF-SB。變鏈菌gtfI基因與茸毛鏈球菌gtfB基因編碼的GTF-I能合成非水溶性葡聚糖，發揮重要致齲作用。而且gtfB和gtfI基因中有種屬特異性核苷酸序列，因此根據gtfB(M17361)(Shiroza T，Ueda S and KuramitsuK.Sequence analysis of the gtfB gene from Streptococcus mutans.JBacteriol，1987，169(9)4263-4270)(Ueda S，Shiroza T，and Kuramitsu K.Sequenceanalysis of the gtfC gene from Streptococcus mutans GS-5.Gene，1988，69(1)101-109)和gtfI(D90213)(Abo H，Matsumura T，Kodama T，et al.Peptidesequences for sucrose splitting and glucan binding within Streptococcus sobrinusglucosyltransferase(water-insoluble glucan synthetase).J Bacteriol.1991，173(3)989-996)的核苷酸序列分別設計引物，將兩種細菌的引物混合於一個PCR反應中，可明顯分辨兩種細菌。第一次PCR能檢測≥105CFU細菌，第二次PCR能檢測≥103CFU細菌。為了達到上述目的，本發明採用以下技術措施A設計引物。本發明所提供的套式聚合酶鏈式反應(nested polymerasechain reaction，N-PCR)包括二次PCR，4對引物(變形鏈球菌第一對正反引物為5′-TAACTACACTTTCGGGTGGCTT和5′-GATGTATCAGTATAAGCGCCAG，第二對正反引物為5′-AAAGCAGATTCTAATGAATCGA 和5′-AATGTAAAATTTTGCCATCAGC；茸毛鏈球菌第一對正反引物為5′-GGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-TTATCGATACCGTAAGCTGCC，第二對正反引物為5′-TGGTATCGTCCAAAATCAATCC 和5′-AGATTTGCAGTTGGTCAGCATC)。
B細菌染色體DNA及唾液染色體DNA提取。
細菌DNA的提取3ml細菌隔夜培養物，10,000rpm離心，4℃10分鐘，去上清，200μlTE緩衝液衝洗二次，將沉澱重懸於內含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分鐘，加40μg蛋白酶K，並加入10％SDS45μl(終濃度1.5％)，混勻，37℃，3小時，等體積苯酚、氯仿抽提二次，無水乙醇沉澱DNA，離心10,000rpm，10分鐘，棄上清，70％乙醇洗滌，溶於TE緩衝液中。
唾液染色體DNA的提取1ml唾液，8,000rpm，4℃離心，15分鐘，去上清，500μlTE緩衝液洗二次，將沉澱重懸於內含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分鐘，加4μg蛋白酶K，並加入10％SDS45μl(終濃度1.5％)混勻，37℃，3小時，等體積苯酚、氯仿抽提二次，無水乙醇沉澱DNA，離心1,0000rpm，10分鐘，棄上清，70％乙醇洗滌，溶於TE緩衝液中。
C第一次PCR。依次加入兩對外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50pmol，4種dNTP混合物(每種終濃度200μM)4μl，10×反應緩衝液5μl，細菌模板DNA2μl，TaqDNA聚合酶2.5U，滅菌水36μl，混勻。反應按94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環30次，最後72℃延伸5分鐘。
D第二次PCR。將第一次PCR產物取2μl，稀釋10倍後，取2μl作模板，以thp7、thp8、thp9、thp10各50pmol，其它成份及步驟同第一次PCR。
E電泳。取擴增產物5μl，1.0％瓊脂糖凝膠電泳電壓80V，0.5μg/ml溴化已錠染色，以DL2,000DNA Marker為標準對照，在紫外檢測儀下觀察擴增帶。
與經典的細菌培養法相比，N-PCR具有以下優點①N-PCR可直接以唾液為模板，通過PCR反應，進行口腔中變鏈菌與茸毛鏈球菌檢出率的研究，而經典的細菌培養法需經過細菌的分離和鑑定，步驟繁瑣；②N-PCR可以快速從唾液中鑑別出是否存在變形鏈球菌和茸毛鏈球菌(僅需6小時)，而經典的細菌培養法相對複雜，一般需4-5天；③N-PCR經兩次PCR連續放大提高了檢測的靈敏度和特異性，而經典的細菌培養法根據細菌形態和生化特性進行鑑定，受較多人為因素影響，靈敏度和特異性低；④針對個體研究對象1ml唾液樣本進行PCR的結果可將細菌感染水平分為三個水平≥105CFU，為高度感染對象；≥103-＜105CFU，為中度感染對象；＜103CFU，為低度感染對象。因此，用套式PCR法在分辨變鏈菌與茸毛鏈球菌的同時，可以通過比較兩種細菌數量上的差異，結合齲患狀況(如以齲失補DMF為指標)，進一步探索哪種細菌與齲病易感性關係更加密切，為預防齲病的發生奠定基礎，而經典的細菌培養法無此特點。
圖1以thp3，thp4，thp5，thp6為引物第一次PCR擴增變鏈菌組產物電泳示意圖1倉鼠鏈球菌S.cricetus AHT；2.鼠鏈球菌S.rattus BHT；3.變形鏈球菌S.mutansIngbritt；4.茸毛鏈球菌S.sobrinus OMZ176；5.變形鏈球菌S.mutans LM-7；6.變形鏈球菌S.mutans OMZ175；7.茸毛鏈球菌S.sobrinus 6715；8.道勒鏈球菌S.downei Mfe28.MarkerDL2,000 Ladder.
圖2以thp7，thp8，thp9，thp10為引物第二次PCR擴增變鏈菌組產物電泳示意圖1倉鼠鏈球菌S.cricetus AHT；2.鼠鏈球菌S.rattus BHT；3.變形鏈球菌S.mutansIngbritt；4.茸毛鏈球菌S.sobrinus OMZ176；5.變形鏈球菌S.mutans LM-7；6.變形鏈球菌S.mutans OMZ175；7.茸毛鏈球菌S.sobrinus 6715；8.道勒鏈球菌S.downei Mfe28.MarkerDL2,000 Ladder圖3以thp3，thp4，thp5，thp6為引物，不同細菌DNA為模板的PCR產物電泳示意圖1唾液鏈球菌S.salivarius HB；2.唾液鏈球菌S.salivarius HBC 12；3.口腔鏈球菌S.oralis ATCC 10557；4.輕鏈球菌S.mitis ATCC 9811；5.血鏈球菌S.sanguis903；6.格登氏鏈球菌S.gordonii；7.粘性放線菌A.viscosus ATCC 19246；8.粘性放線菌A.viscous ATCC 29525；9.大腸桿菌E.coli JM 109；10.大腸桿菌E.coliDH 5α；11.牙齦卟啉菌P.g ATCC 33277；12.假單胞菌Pseudomonas AP 930065；13.變形鏈球菌S.mutans Ingbritt；14.茸毛鏈球菌S.sobrinus 6715圖4以thp3，thp4，thp5，thp6為引物的PCR的靈敏度變形鏈球菌Ingbritt菌數量依次為1∶108CFU，2∶107CFU；3.106CFU；4.105CFU圖5以thp3，thp4，thp5，thp6為引物的PCR的靈敏度茸毛鏈球菌6715菌數量依次為1107CFU，2106CFU；3105CFU圖6以thp7，thp8，thp9，thp10為引物的第二次PCR的靈敏度變形鏈球菌Ingbritt菌數量依次為1104CFU，2103CFU圖7以thp7，thp8，thp9，thp10為引物的第二次PCR的靈敏度茸毛形鏈球菌S.sobrinus 6715株菌數量依次為1105CFU，2104CFU；3103CFU圖8以thp3，thp4，thp5，thp6為引物，PCR擴增直接檢測唾液中變形鏈球菌S.mutans和茸毛形鏈球菌S.sobrinus.
1.變形鏈球菌S.mutans Ingbritt；2.茸毛形鏈球菌S.sobrinus 6715；3.A研究對象的唾液樣本；4.B對象的唾液樣本；5.C對象的唾液樣本圖9以thp3，thp4，thp5，thp6為引物，二次PCR擴增直接檢測唾液中變形鏈球菌S.mutans和茸毛形鏈球菌S.sobrinus.
1.變形鏈球菌S.mutans Ingbritt；2.茸毛形鏈球菌S.sobrinus 6715；3.A研究對象的唾液樣本；4.B對象的唾液樣本；5.C對象的唾液樣本具體實施方式
下面根據附圖對本發明作進一步詳細描述變形鏈球菌產生三種葡糖基轉移酶(glucosyltransferase，GTF)GTF-I、GTF-SI、GTF-S。茸毛鏈球菌產生四種葡糖基轉移酶-GTF-I，GTF-S，GTF-SA，GTF-SB。變鏈菌gtfI基因與茸毛鏈球菌gtfB基因編碼的GTF-I能合成非水溶性葡聚糖，發揮重要致齲作用。而且gtfB和gtfI基因中有種屬特異性核苷酸序列，因此根據gtfB(M17361)和gtfl(D90213)的核苷酸序列分別設計引物(引物序列見表1)，運用套式多聚酶鏈反應技術使用Taq DNA聚合酶建立PCR反應體系，從變鏈菌組標準株細菌DNA及唾液提取的混合細菌DNA中擴增出不同長度的目的DNA片段(見表2及圖1-3)。
A設計引物。本發明所提供的套式聚合酶鏈式反應(nested polymerasechain reaction，N-PCR)包括二次PCR，4對引物(變形鏈球菌第一對正反引物為5′-TAACTACACTTTCGGGTGGCTT和5′-GATGTATCAGTATAAGCGCCAG，第二對正反引物為5′-AAAGCAGATTCTAATGAATCGA 和5′-AATGTAAAATTTTGCCATCAGC；茸毛鏈球菌第一對正反引物為5′-GGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-TTATCGATACCGTAAGCTGCC，第二對正反引物為5′-TGGTATCGTCCAAAATCAATCC 和5′-AGATTTGCAGTTGGTCAGCATC)。
B細菌染色體DNA及唾液染色體DNA提取。
細菌DNA的提取3ml細菌隔夜培養物，10,000rpm離心，4℃10分鐘，去上清，200μlTE緩衝液衝洗二次，將沉澱重懸於內含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分鐘，加40μg蛋白酶K，並加入10％SDS45μl(終濃度1.5％)，混勻，37℃，3小時，等體積苯酚、氯仿抽提二次，無水乙醇沉澱DNA，離心10,000rpm，10分鐘，棄上清，70％乙醇洗滌，溶於TE緩衝液中。
唾液染色體DNA的提取1ml唾液，8,000rpm，4℃離心，15分鐘，去上清，500μlTE緩衝液洗二次，將沉澱重懸於內含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃，30分鐘，加4μg蛋白酶K，並加入10％SDS45μl(終濃度1.5％)混勻，37℃，3小時，等體積苯酚、氯仿抽提二次，無水乙醇沉澱DNA，離心1,0000rpm，10分鐘，棄上清，70％乙醇洗滌，溶於TE緩衝液中。
C第一次PCR。依次加入兩對外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50pmol，4種dNTP混合物(每種終濃度200μM)4μl，10×反應緩衝液5μl，細菌模板DNA2μl，TaqDNA聚合酶2.5U，滅菌水36μl，混勻。反應按94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環30次，最後72℃延伸5分鐘。
D第二次PCR。將第一次PCR產物取2μl，稀釋10倍後，取2μl作模板，以thp7、thp8、thp9、thp10各50pmol，其它成份及步驟同第一次PCR。
E電泳。取擴增產物5μl，1.0％瓊脂糖凝膠電泳電壓80V，0.5μg/ml溴化已錠染色，以DL2,000DNA Marker為標準對照，在紫外檢測儀下觀察擴增帶。
表1變形鏈球菌與茸毛鏈球菌N-PCR引物序列
表2變鏈菌組在N-PCR反應中擴增的產物長度
經過多組電泳鑑定，證實變形鏈球菌與茸毛鏈球菌擴增片段長度(第一次PCR 529bp和700bp，第二次PCR 468bp和663bp)，在瓊脂糖凝膠上易於分辨。而非變形鏈球菌組的標準菌株均未見任何擴增帶(見圖3)。可見，此PCR反應對變鏈球菌組細菌亦具有特異性，又因變形鏈球菌和茸毛鏈球菌擴增片段長度具有特異性，證明該PCR反應可有效區分這兩種菌。並且第一次PCR反應，以105CFU的DNA作模板，可見特異性擴增帶。而第二次PCR反應，僅103CFU的DNA作模板都有特異性擴增帶(見圖4-7)。N-PCR亦可檢測唾液樣本中的變形鏈球菌和茸毛鏈球菌(見圖8和9)。因此，針對個體研究對象1ml唾液樣本進行PCR的結果可將細菌感染水平分為三個水平≥105CFU，為高度感染對象；≥103-＜105CFU，為中度感染對象；＜103CFU，為低度感染對象。
權利要求
1.一種人唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的檢測方法，它包括下列步驟A、設計引物所提供的套式聚合酶鏈式反應包括二次PCR，變形鏈球菌第一對正反引物為5′-TAACTACACTTTCGGGTGGCTT和5′-GATGTATCAGTATAAGCGCCAG，第二對正反引物為5′-AAAGCAGATTCTAATGAATCGA和5′-AATGTAAAATTTTGCCATCAGC；茸毛鏈球菌第一對正反引物為5′-GGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-TTATCGATACCGTAAGCTGCC，第二對正反引物為5′-TGGTATCGTCCAAAATCAATCC和5′-AGATTTGCAGTTGGTCAGCATC；B、細菌染色體DNA及唾液染色體DNA提取首先是細菌DNA的提取3ml細菌隔夜培養物，10000rpm離心，4℃10分鐘，去上清，200μlTE緩衝液衝洗二次，將沉澱重懸於內含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃30分鐘，加40μg蛋白酶K，並加入10％SDS45μl，混勻，37℃3小時，等體積苯酚、氯仿抽提二次，無水乙醇沉澱DNA，離心10000rpm10分鐘，棄上清，70％乙醇洗滌，溶於TE緩衝液中；其次是唾液染色體DNA的提取1ml唾液，8000rpm，4℃離心15分鐘，去上清，500μlTE緩衝液洗二次，將沉澱重懸於內含2mg溶菌酶的200μlTE液中，37℃30分鐘，加4μg蛋白酶K，並加入10％SDS45μl，混勻，37℃3小時，等體積苯酚、氯仿抽提二次，乙醇沉澱DNA，離心1,0000rpm，10分鐘，棄上清，70％乙醇洗滌，溶於TE緩衝液中；C、第一次PCR依次加入兩對外引物thp3、thp4、thp5、thp6各50pmol，4種dNTP混合物4μl，10×反應緩衝液5μl，細菌模板DNA2μl，TaqDNA聚合酶2.5U，滅菌水36μl，混勻，反應按94℃預變性5分鐘，94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，循環30次，最後72℃延伸5分鐘；D、第二次PCR將第一次PCR產物取2μl，稀釋10倍後，取2μl作模板，以thp7、thp8、thp9、thp10各50pmol，其步驟同第一次PCR；E電泳取擴增產物5μl，1.0％瓊脂糖凝膠電泳電壓80V，0.5μg/ml溴化已錠染色，以DL2,000 DNA Marker為標準對照，在紫外檢測儀下觀察擴增帶。
全文摘要
本發明公開了一種人唾液中變形鏈球菌和茸毛鏈球菌的檢測方法，首先是設計引物，所提供的套式聚合酶鏈式反應包括二次PCR，4對引物，變形鏈球菌兩對正反引物和茸毛鏈球菌兩對正反引物；其次是細菌染色體DNA及唾液染色體DNA提取；第三是第一次PCR，依次加入兩對引物，四種dNTP混合物及模板DNA和Taq酶；第四是第二次PCR，將第一次PCR產物稀釋，加入另外兩對引物，進行擴增；第五是電泳。本發明方法簡單，成本低廉。
文檔編號G01N27/447GK1737161SQ20051001913
公開日2006年2月22日 申請日期2005年7月21日 優先權日2005年7月21日
發明者邊專, 譚海平, 孟柳燕, 樊明文 申請人:武漢大學