一種超聲輔助農桿菌介導的植物inplanta遺傳轉化方法

2023-06-03 19:30:46 4

專利名稱：一種超聲輔助農桿菌介導的植物in planta遺傳轉化方法
技術領域：
本發明屬於植物轉基因領域，更具體涉及一種超聲輔助農桿菌介導的植物in planta遺傳轉化的轉基因方法，適用於油菜、芝麻、大豆、擬南芥等大部分作物的轉基因。
背景技術：
隨著DNA重組和植物組織培養技術的發展，分子育種已成為植物育種的一個重要 研究領域。植物分子育種即基因工程育種，經過多年的科學實踐已發展建立了一整套有別 於傳統植物遺傳育種的、切實可行的外源基因(DNA)轉化、篩選和鑑定的技術。由於它可以 打破物種間遺傳物質橫向轉移的壁壘，創造出新的作物品種，因此為作物品種改良開闢了 一條更為直接有效的途徑。基因工程育種方法可分為3類直接基因導入法(通過物理或 化學方法引起)和載體介導法(即將目的基因插入到農桿菌質粒或病毒DNA分子上，隨著載 體DNA的轉移而將目的基因導入植物基因組)以及第三類種質系統法(花粉管通道法、生殖 細胞浸染法、胚囊和子房注射法等)。以上方法獲得的轉基因植株多數通過組織培養途徑獲 得，且轉基因後代所形成的細胞無性系變異較大，遺傳穩定性差，植株再生頻率低。為了解決再生培養體系等問題，1993年，Bechtold等發明了截然不同於離 體方法的in planta轉化法，研究發現將活體擬南芥植株浸泡在農桿菌菌液的同時將菌液 和植株進行抽真空處理，可明顯提高基因的轉移頻率，轉化率達到0.4%。(Bechtold N., Ellis J. and Pelletier G. In planta Aarobacterium~mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad Sci Paris, Life Sci., 1993，316:1194-1199)。In planta法是以生物自身的種質細胞為媒體，特別是植物 生殖系統的細胞(花粉，卵細胞，子房，幼胚等)，將外源DNA導入完整植物細胞，實現遺傳 轉化的基因導入技術，稱之為種質轉化(germ line transformation)，也稱為整株活體轉 化(in planta transformation)或植物原位轉化(閆新甫主編.轉基因植物.北京科學 出片反|土，2003)。 In planta Tj^iW^ft vacuum infiltration, floral-dip, spraying, 點滴微管法等。近年來，floral-dip轉化法(花序浸漬法)是擬南芥功能基因研究中廣泛釆 用的一種 In planta 轉基因方法。Feldmann 禾口 Marks (FeIdmann K. A. and Marks Μ. D., 1987， Agrobacterium-medi^ted transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaliana : a non-tissue culture approach. Mol. Gen. Genet. , 208:1—9)最先在擬南 芥中應用原位滲透法獲得了轉基因成功。Chmg等(Chmg S. S.，Park S. K. md Nam H. G.， 1990， Transformation of Arabidopsis by Agrobacterium inoculation on wounds, Plant J.，5(4):551-558)利用摘下的幼嫩花序和受傷的擬南芥植株進行農桿菌接種感染 獲得轉基因植株，但遺傳轉化率相對較低，而且遺傳轉化不穩定。Clough和Bent (Clough S.J. and Bent A. Floral—dip: a simplified method for Agrobacteruim~mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. , 1998, 16:735—743)用擬南芥 作為受體用表面活性劑silwet-77取代抽真空處理，通過floral-dip轉移基因獲得成功。 Floral-dip轉移外源基因的最大優點在於能直接獲得轉化的種子，避免了煩瑣的組織培養和繼代培養，並且基因轉化頻率高，一般在0. 5%-1% (轉基因成功種子與收穫種子之比)，且 轉基因後代遺傳穩定(劉凡，王國英，曹鳴慶.2003，農桿菌介導的植物原位轉基因方法 研究進展，分子植物育種，1(1): 108-116).據報導In planta轉基因方法已成功應用於 苜蓿，白菜和蘿蔔中，在油菜中已有初步應用(Trieu A.T.，Burleigh S. H. , Kardailsky I. V. , Maldonado-Mendoza I. Ε. , Versaw W. K. , Blaylock L. Α. , Shin H. , Chiou Τ., Kataki H. , Dewbre G. R. , Weigel D. , and Harrison Μ. J. , 2000, Transformation of Medicago Truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium, Plant J. , 22(6):531-541； Somers D. A. , Samac D. A. , and Olhoft P. Μ. , 2003, Recent advances in Legume transformation, Plant Physiol., 131:892-899； Curtis I.S., and Nam H. G. , 2001, Transgenic radish{Raphanussativus L. Iongipinnatus Bailey) by floral-dip method-plant development and surfactant are important in optimizing transformation efficiency, Transgenic Research, 10:363-371 ； Cao Μ. Q. , Liu F. , Yao L. , Bouchez D. , Tourneur C. , Li Y. , and Robaglia C. , 2000, Transformation of Pakchoi {Brassica rapa L. ssp. chinensis) by Agrobacterium infiltration, Mol. Breed. , 6:67-72;徐光碩，饒勇強，陳雁，張椿 雨，孟金陵，2004，用in planta方法轉化甘藍型油菜，作物學報，30 (1) 1_5)，但轉化頻 率仍然不高。芝麻作為世界上重要的油料作物之一，其組織培養研究較其他主要作物落後， 組織培養再生比較困難(RAMR et al. Sesame: New approaches for crop improvement[C] //: JANICK J, SIMON J. E. (eds). Advances in New Crops: Timber Press, Portland, 1990:225-228. BEATRICE et al. In vitro regeneration of sesame( Sesamum indicum L. ) from seedling cotyledon and hypocotyl explants[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2006, 85: 235-239)，從而制約了芝麻再生技術體系的建立，極大地阻礙 了芝麻細胞工程和遺傳轉化的深入研究，滯緩了芝麻生物技術育種的步伐。雖然研究者們 在芝麻離體培養方面進行了較多的嘗試，但相關研究報導不多.2010年7月，Manju Yadav 等才首次成功報導了利用農桿菌介導的芝麻遺傳轉化方法，轉化頻率也僅為1.01% (Manju Yadav, Darshna Chaudhary, Manish Sainger, Pawan K. Jaiwal, 2010, Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.), Plant Cell Tissue and Organ Culture, DOI 10. 1007/s 11240-010-9791-8)。芝麻組 織培養研究的整體水平較低，且已有的研究結果重複性較差，尚未形成一套通用的或具有 突破性的高頻率再生培養體系(孫建，張秀榮.芝麻組織培養研究進展與展望.山地農 業生物學報.2009，28(1): 72-78)。利用In planta植物遺傳轉化法，能直接獲得轉化的 種子，避免了煩瑣的組織培養和繼代培養，同時為一些不易建立遺傳再生體系的作物類型 提供了基因轉移的新途徑，而且在擬南芥上的研究結果還表現出對基因型的不敏感性，一 些應用其它方法轉化率低的生態型，也能夠獲得較高的轉化頻率。(Mysore K S, Kumar C Τ, Stanton B G. Arabidopsis ecotypes and mutants that are recalcitrant to Agrobacterium root transformation are susceptible to germ line transformation. The plant Journal, 2000, 21(1):9_16)。但是此法在模式植物上的應用較多，其他作物 上較為少見，有的甚至尚未成功，且有效性不高。當前，技術難點的攻克和空白薄弱領域的 深入研究是影響高效穩定轉基因植物研究取得突破的關鍵問題之一，因此有必要建立和發展多種植物遺傳轉化方法。超聲波作為一種物理手段也可以介導外源DNA分子進入帶壁的植物細胞和 組織。在超聲轉化條件下，以空化機制為主產生的高溫高壓作用於領近氣泡周圍的組 織、氣泡，從而可能導致這些細胞的細胞壁和質膜的擊穿或可逆的質膜透性改變，使 高分子的外源DNA進入細胞。賈士榮等(賈士榮，曹冬孫.轉基因植物.植物學通 報，1992,9:3-15)發展了這種轉化方法，其轉化率可達22.3%。王國英等(王國英，張 宏，丁群星等.幾種玉米基因轉移技術的研究及轉基因植株的獲得.生物工程學 報，1996，12 (1) 45-49)通過超聲波處理，成功地把Bt基因導入玉米未成熟胚和胚性愈 傷組織。章力健等(章力健，陳樂玫，袁靜等.超聲波直接導入外源基因高效菸草轉化 系統的建立.中國農業科學，1991，24(2) 83-89)用超聲波處理菸草葉片獲得了 gus表 達的轉基因菸草植株。Joersbo 等(Joersbo M.，Donalason I. and Kreiberg J.，et al. Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet. Mol. Breed. , 1998，4:111-117)利用超聲波法將cat基因導入甜菜和菸草原生質體，並獲 得短暫表達。Santarem( Ε. R. Santaremj H. N. Trick, J. S. Essig and J. J. Finer, Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation of soybean immature cotyledons: optimization of transient expression, Plant Cell Rep. , 1998， (17)， pp. 752 - 759)禾口 Tang等(Tang，Additional virulence genes and sonication enhance Agrobacterium tumefaciens~mediated loblolly pine transformation, Plant Cell Rep., 2003, (21)，pp. 555 - 562)利用農桿菌介導同時結合超聲的方法在植物體內進行 gus基因轉化，有效的促進了 gus基因在植物體內大量表達，並且發現超聲處理從0. 5到2 秒時間段內，外源基因瞬間表達頻率最高。Syed Sarfraz hassain(Syed Sarfraz hassain, Tayyab Husnain and S. Riazuddin, Sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation( SAAT ): an alternative method for cotton transformation, Pak. J. Bot., 2007，39(1):223-230)以棉花成熟胚為外植體將農桿菌侵染和超聲物理方法結 合起來有效的促進了 gus基因在植物體內大量表達。上述方法主要是在植物組織培養和細 胞上有應用，但是超聲輔助法尚未應用於in planta為基礎的植物遺傳轉化。

發明內容
本發明的目的是在於提供了一種農桿菌介導的植物in planta遺傳轉化的轉基因 方法，該方法易行，操作簡便，成本低，周期短，可2人1天內同時對1500-2000株植株進行 轉化，加強了菌液的滲透率，顯著提高了遺傳轉化效率並拓展了該方法在不同植物中的適 用範圍。為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施
本發明技術要點一常規的in planta轉化法在模式植物擬南芥上應用較多，轉化的 對象主要是胚珠，而在其他植物應用上少見且轉化頻率較低，這是因為農桿菌侵染受限於 大多數植物的花器官大小，不能進入細胞內部，轉化難以發生。通過超聲輔助法使農桿菌侵 染時能夠克服更多的花器官物理屏障，能進入到不同植物的花器官細胞內，使大多數花器 官大植物能有效使用此方法，從而使轉化更容易發生。技術要點二 通過超聲使轉化不僅僅 發生在胚珠，柱頭等雌配子細胞內，外源基因還可通過農桿菌侵染進入到花粉，花葯，花絲等雄配子細胞當中。這是由於農桿菌是通過傷口侵入的，利用超聲波的「空化作用」處理 植物的受體系統，使植物受體細胞或組織上造成傷口，這樣農桿菌中T-DNA攜帶外源基因 能夠更容易進入，並高效、穩定地再生無性系，接受外源DNA整合後，轉化選擇對抗生素敏 感的再生系統，提高轉化效率。技術要點三本發明能直接獲得轉化的Tl代種子，避免了煩 瑣的組織培養和繼代培養，而對於那些難以建立甚至尚未建立再生體系的植物，意義更加 重大。技術要點四不受植物株型大小以及基因型的限制，如芝麻、大豆、油菜(甘藍型，白菜 型，芥菜型)，擬南芥等不同作物均可採用本專利所述的方法實施高效轉化。技術要點五本 發明專利操作簡單，成本低，周期短，可同時對大批量植株進行轉化。技術要點六本發明專 利不依賴於抗生素篩選，可用不同的篩選標記進行轉基因植物篩選鑑定。—種超聲輔助農桿菌介導植物遺傳轉化的轉基因方法，其步驟是
1、農桿菌培養及轉化前處理將農桿菌菌株EHA105-gUS-2301接種於LB培養基， 28 V，搖床培養1 2d後，再轉接新鮮的LB培養液中，搖菌24 h左右(使OD6tltl在1. 8 2. 0)。6000rpm離心收集菌體10 15min，室溫為20_25°C。2倍體積轉化培養基溶解。2、超聲輔助農桿菌介導的in planta遺傳轉化
選擇待處理的甘藍型油菜浙油18等植株，去除所有已開放的花朵。將所有植株的主花 序用轉化培養基溶解的農桿菌菌液進行2 30 sec不同時間倒置超聲侵染處理，同時掛 牌 標明處理時間。侵染完後倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住，陰處平放22-26h後，除去 保鮮膜，蒸餾水衝洗植株後，於土壤缽中置正常生長條件下培養，待成熟期收穫Tl代種子。所述的待處理植株為甘藍型油菜浙油18 (Brassica napus L.)，擬南芥 {Arabidopsis thaliana (ecotype Columbia)},白菜型油菜 0639，3965 (Brassica rapa L.);芥菜型油菜 2522，I^iBrassica juncea L.)，野芥野油儀 Sinapis arvensis L.)， 蘇芝-1 (Sesamum indicum L.)；
所述的待處理植株為剛開放1-2朵花花蕾期的植株；
所述的超聲輔助農桿菌介導的植物in planta高效遺傳轉化的對象為未開花的花蕾； 所述的農桿菌為根癌農桿菌U^ro力acieriwsi腫e/acie/ ·^) EHA105，所含質粒pCAMBIA 2301攜帶含內含子的gus報告基因，抗性標記為卡那黴素(Km)和利福平(Rif)抗性，gus基 因通過CaMV35S啟動子啟動表達。所述的超聲儀器為雙頻數控超聲清洗儀(KQ-500VDE型)
所述的超聲輔助處理時裝有農桿菌轉化液的儀器為大容積的塑料大燒杯； 所述的超聲波處理的參數為電源220V 50Hz超聲頻率為28/45 KHz，超聲電功率為 500W ；
所述的超聲處理時間為2 sec, 5 sec, 15 sec,30sec 4個處理，分別以未經超聲直接侵 染處理的植株為各自對照2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck ；
3、卡那黴素抗性篩選將收集到的部分Tl代種子進行卡那黴素抗性植株篩選，所述的 卡那黴素抗性篩選最適濃度為350 mg/L，此時油菜等幼苗下胚軸呈現淡紫色，葉片嚴重黃 化。而在此濃度以上油菜等幼苗全部死亡。詳細篩選步驟見實施例1. 6. 1
4、PCR檢測抗性植株中的gus基因將篩選到的抗性植株進行PCR快速檢測，所述的 PCR檢測抗性植株中的gus基因所用到的引物是
GusF2 (5， to 3，)CGGCAAAGTGTGGGTCAATGusR2 (5， to 3，)AAGGGTAATGCGAGGTACGGT。本發明得到Gus基因擴增片段長度為500bp，並且超聲15sec處理時，gus基因轉 化頻率達到20%
本發明與現有技術相比，具有以優點和效果
1.本發明已經成功應用於不易建立遺傳再生體系作物芝麻，提供了基因轉移的新途 徑，得到了轉基因芝麻種子。2.本發明利用超聲技術對植株進行in planta轉化大大提高了外源基因轉化效率。3.本發明藉助超聲打破植物屏障，外源基因可成功進入各種細胞中，如胚珠，花 瓣，花梗，胚囊等，對不同植物的不同組織提高了轉化效率。4.本發明已經成功獲得了油菜、擬南芥、芝麻等轉基因種子，並且每粒種子都是一 個獨立轉化事件。5.本發明操作簡單，成本低，周期短，可2人1天內同時對1500-2000株植株進行 轉化，且不受基因型限制。6.本發明已經成功的用抗除草劑bar基因，gus基因(基因)，卡那黴素基因進行轉 基因植株的篩選，每粒轉基因種子都是獨立轉化事件。其中，本發明得到的gus基因轉化頻 率可達20%，卡那黴素篩選轉化頻率達到78. 38%。


圖1為一種卡那黴素抗性植株示意圖
圖2為一種油菜(子葉，下胚軸)gus基因化學組織染色示意圖 圖3，4為一種白菜型油菜0639、3965gus基因化學組織染色示意圖 圖5為一種野芥gus基因化學組織染色示意圖 圖6為一種擬南芥gus基因化學組織染色示意圖 圖7為一種芝麻gus基因化學組織染色示意圖。
具體實施例方式下文將通過實施例對本發明做進一步的詳細說明，但本發明的內容不僅僅局限於 下面的實施例。實施例1
一種超聲輔助農桿菌介導植物遺傳轉化的轉基因方法，其步驟是
1材料與方法
1.1供試植物材料
選擇初花期的甘藍型油菜浙油(Aral5lSica napus L. ) 18 1. 2農桿菌質粒及外源基因
菌株為根癌農桿菌(Agrobacteri^tumefaciens )EHA105 (項友斌等.農桿菌介導的蘇 雲金桿菌抗蟲基因crylA (b)和crylA (c)在水稻中的遺傳轉化及蛋白表達.生物工程學 報，1999，15(4) 494-500)，所含質粒 pCAMBIA 2301 (Manju Yadav, Darshna Chaudhary, Manish Sainger, Pawan K. Jaiwal, 2010, Agrobacterium tumefaciens-mediatedgenetic transformation of sesame (Sesamum indicum L.), Plant Cell Tissue and Organ Culture, DOI 10. 1007/s 11240-010-9791-8)(該質粒攜帶含內含子的 gus 報告基 因，抗性標記為卡那黴素(Km)和利福平(Rif)抗性，gus基因通過CaMV35S啟動子啟動表 達)
1. 3農桿菌培養及轉化前處理 將農桿菌菌株EHA105-gus-2301接種於LB培養基(蛋白腖10 g/L，酵母提取物10 g/ L，NaCl 5 g/L，NaOH 調節至 pH=7)，含 Km (50 mg/L)和 Rif (30 mg/L), 28°C, 200 rpm，搖床 培養1 2d後，再轉接新鮮的LB培養液中，搖菌24 h左右(使OD6tltl在1. 8 2. 0)。6000rpm 離心收集菌體10 15min，室溫為20_25°C。2倍體積轉化培養基溶解。所述的農桿菌菌種 為EHA105-gus-2301 (^ro力acieri腫 腫e/acie^s);轉化培養基為MS基本培養基+6-BAP (0. 01ng/L) +蔗糖 5% (m/v) + Silwet-77 0. 05% (ν/ν)，(ρΗ=5· 8 左右) 1. 4超聲處理
選取初花期的甘藍型油菜浙油18進行2sec，5sec, 15sec, 30sec不同的超聲處理(以未 經超聲直接侵染處理的植株為對照CK)，進行農桿菌侵染實驗，每處理隨機選擇20株，各4 個重複，同時掛牌標明處理時間。侵染完後倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住22-26 h， 將植株用蒸餾水衝洗，陰處平放。除去保鮮膜，蒸餾水衝洗植株後，放置於土壤缽中正常生 長條件下培養直至角果成熟。1. 5種子收穫收集處理部位成熟角果，脫粒，得到甘藍型油菜Tl代種子。1.6轉基因植株的篩選 1. 6. 1卡那黴素抗性篩選
取部分收穫的Tl代種子經75% (ν/ν)酒精表面消毒30 s,0. 1% (v/v) HgCl2消毒10 min，鋪在MS基本培養基上，將正常生長的綠苗轉到抗性篩選培養基中(含卡那黴素濃度為 350 mg/L)，兩周後，統計並記錄綠色苗子生長及變化情況.再將正常生長的綠色苗轉移到 土缽中培養，為開展後續實驗備用.
統計結果表明在卡那黴素濃度為350 mg/L時，少數植株死亡，部分葉片嚴重黃化，真 葉呈現深紫色(見圖1)。農桿菌侵染結合超聲處理所得到的綠色抗性植株比例均高於未經 超聲而直接侵染所得到的綠色抗性植株比例，並且4個處理中，超聲15 sec得到的抗性轉 化頻率可高達78. 38% (見表1)，初步表明超聲處理結合農桿菌轉化可大大提高轉基因植株 獲得的機率，有效的促進外源基因在植株中高效的表達，從而獲得大量的綠色正常生長的 轉基因植株。1. 6. 2 gus基因的組織化學法篩選
分別選取上述初步經過卡那黴素篩選到的綠色抗性植株子葉、下胚軸、根部不同部位 進行組織化學染色法檢測，棄去染色液，分別統計被染成藍色或未被染成藍色部位(見圖 2 )，鏡檢觀察並進行數據統計(見表2 )。結果表明農桿菌侵染並結合超聲處理植株被染成藍色的比例均高於未經超聲而 直接侵染植株，處理15 sec時，gus基因染色比例最高可達77. 06%,與以上抗性植株篩選得 到的結果基本一致，進一步說明此發明涉及的超聲處理結合農桿菌轉化方法可大大提高轉 基因植株獲得的機率，有效促進外源基因在植株中高效的表達。實施中發現油菜根部最容 易被染上藍色，下胚軸次之，子葉染上藍色比例最小，並且各部位染色深淺程度各不一致，說明轉基因油菜中外源基因在植株中表達強度表現不一致，T-DNA可以多位點插入，因此其 後代的遺傳規律可能會比較複雜。1.6.3 gus基因的PCR鑑定篩選
將上述步驟得到的轉基因油菜充分研磨，用CTAB法提取植物總DNA，用gus基因引物 (GusF2 和 GusR2)進行 PCR 擴增。通過PCR擴增雖然在一定程度上大大的降低了假陽性轉基因植株的比例，但結果 表明超聲15sec時，gus基因轉化頻率最高，並且可達到20%，超聲處理30sec時可達到 12. 12%，仍然遠遠高於其他文獻上提到的農桿菌侵染比例(見表3)。該結果進一步說明此發 明涉及到的超聲處理結合農桿菌轉化確實可大大提高轉基因植株獲得的機率，有效的促進 外源基因在植株中高效的表達。表1甘藍型油菜浙油18卡那黴素抗性篩選數據統計表
慫理綠苗數i-.ir . J. -· f -If,抗性轉-化頻車 =綠苗Z總It ι %: 浙油18(未.處理)j 815CK 2sec2411720.513010229-41CK 5sec12901333Ssec，^y10232.35CK 15secH90JO.D /15sec8711178.38CK30sec519951.5230sec6310261.76
表2甘藍型油菜浙油ISgus基因的組織化學法篩選數據統計表
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權利要求
一種超聲輔助農桿菌介導的植物in planta遺傳轉化方法，其步驟是A、農桿菌培養及轉化前處理 將農桿菌菌株接種於LB培養基，28℃，搖床培養1～2d後，再轉接新鮮的LB培養液中，搖菌22 26 h，使OD600在1.8～2.0，6000rpm 離心收集菌體10～15 min，室溫為20 25℃，2倍體積轉化培養基溶解；B、超聲輔助農桿菌介導的in planta遺傳轉化選擇待處理的植株，去除所有已開放的花朵，將所有植株的主花序用轉化培養基溶解的農桿菌菌液進行2～30 sec不同時間倒置超聲侵染處理，同時掛牌標明處理時間，侵染完後倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住，陰處平放22 26h後，除去保鮮膜，蒸餾水衝洗植株後，於土壤缽中置正常生長條件下培養，待成熟期收穫T1代種子；所述的待處理植株為剛開放1 2朵花花蕾期的植株；所述的超聲輔助農桿菌介導的植物in planta高效遺傳轉化的對象為未開花的花蕾；所述的超聲波處理的參數為電源220V 50Hz超聲頻率為28/45 KHz，超聲電功率為500W；所述的超聲處理時間為2 sec，5 sec，15 sec，30sec 4個處理，分別以未經超聲直接侵染處理的植株為各自對照2 sec ck，5 sec ck，15 sec ck，30 sec ck；C、卡那黴素抗性篩選將收集到的部分T1代種子進行卡那黴素抗性植株篩選，所述的卡那黴素抗性篩選濃度為350 mg/L；D、PCR檢測抗性植株中的gus基因將篩選到的抗性植株進行PCR快速檢測，所述的PCR檢測抗性植株中的gus基因所用到的引物是GusF2CGGCAAAGTGTGGGTCAAT 5’to 3』GusR2AAGGGTAATGCGAGGTACGGT 5’to 3』 Gus基因擴增片段長度為500bp。
2.根據權利要求1所述的一種超聲輔助農桿菌介導的植物inplanta遺傳轉化方 法，其特徵在於所述的農桿菌菌種為EHA105-gUS-2301 ；轉化培養基為MS基本培養基 +6-BAP+ 5% 蔗糖+Silwet-77，ρΗ=5· 8。
3.根據權利要求1所述的一種超聲輔助農桿菌介導的植物inplanta遺傳轉化方法， 其特徵在於所述的待處理植株為甘藍型油菜浙油18，擬南芥，白菜型油菜0639，3965，芥 菜型油菜2522，2565，野芥野油41。
全文摘要
本發明公開了一種超聲輔助農桿菌介導的植物inplanta遺傳轉化方法，步驟是A、農桿菌培養及轉化前處理；B、超聲輔助農桿菌介導的遺傳轉化選擇植株，去除開放的花朵，將植株的花序用轉化培養基溶解的農桿菌菌液進行不同時間倒置超聲侵染處理，標明處理時間，侵染完後倒置油菜，將其處理部位用保鮮膜套住，陰處平放，除去保鮮膜，蒸餾水衝洗植株後，於土壤缽中置培養，待成熟期收穫種子；C、卡那黴素抗性篩選將收集到的部分T1代種子進行卡那黴素抗性植株篩選；D、PCR檢測抗性植株中的基因將篩選到的抗性植株進行PCR快速檢測。方法易行，操作簡便，成本低，可2人1天內同時對1500-2000株植株進行轉化，加強了菌液的滲透率，顯著提高了遺傳轉化效率。
文檔編號C12Q1/68GK101979602SQ20101029851
公開日2011年2月23日 申請日期2010年10月8日 優先權日2010年10月8日
發明者伍曉明, 呂曉丹, 張天瑤, 李 浩, 許鯤, 閆貴欣, 陳碧雲, 高桂珍 申請人:中國農業科學院油料作物研究所