含小檗鹼的黃檗愈傷組織培養方法
2023-06-03 05:57:51 4
專利名稱：含小檗鹼的黃檗愈傷組織培養方法
技術領域：
本發明屬於植物組織培養技術的植株再生，以及未分化的人類、動物或植物細胞技術領域，具體涉及到高含量小檗鹼的黃檗愈傷組織培養方法。
背景技術：
黃檗(Phello dendron amurense Rupr.)又名關黃柏、黃波羅，為芸香科(Rutaceae)黃柏屬(Phellodendron)多年生落葉高大喬木，主要分布在我國的黑龍江、吉林、遼寧、河北等省，具有重要的經濟和藥用價值。其內皮(韌皮部)入藥，稱為關黃柏(產於四川等地的黃皮樹的內皮則稱為川黃柏)，是我國傳統中藥黃柏的重要來源植物之一。黃檗已經被國家列為二級保護植物和重點的植物保護資源，中國植物紅皮書將其列為漸危種。傳統的黃檗藥用方法主要是採取將黃檗立木扒皮，而黃檗的主要藥用成分為小檗鹼，其在植株中含量低，且黃檗生長緩慢，剝皮嚴重影響著植株的生長甚至導致死亡，而且消耗大而產出很少，不利於黃檗資源的有效利用。早在20世紀50年代，人們就發現離體培養的高等植物細胞具有合成並積累植物次生代謝產物的潛力，隨著生物技術的發展，用組織培養生產有用的次生代謝產物已成為可能並且取得了相當大的成績。目前已有80多種藥用植物可通過組織培養技術生產其體內含的藥用有效成分，有30多種藥用植物細胞培養物累積的有效成分等於或高於原植物的含量，如人參皂苷、迷迭香酸等。為了更有效地保護黃檗資源，利用細胞或組織培養生產天然產物藥物是開發利用珍貴藥用資源的重要途徑。
發明內容
本發明目的在於克服上述利用的不足之處，提供一種含小檗鹼較高的黃檗愈傷組織培養方法以及適應該方法所用的培養基。解決上述技術問題所採用的技術方案是它包括以下步驟(I)外植體製備材料消毒在超淨工作檯上將取下的黃檗葉或黃檗莖段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，期間不斷搖動，然後用無菌水衝洗3-5次，每次2分鐘，用無菌濾紙吸乾表面水分；(2)愈傷組織誘導將(I)中處理好的黃檗葉片切成0. 5X0. 5cm2的切塊，黃檗莖段切成0. 5cm長的切段接入誘導愈傷組織培養基中誘導愈傷組織，該誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖20 -40 g
瓊脂粉5.8 7.6 g
2，4_二氯苯氧乙酸 0.5 2.5 mg
6—(節胺基)嘌呤0.5 2.0 mgpH為5. 8，配製好的誘導愈傷組織培養基分裝在培養瓶中，每瓶25毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0. I 0. 15MPa下滅菌30分鐘，將培養瓶置於溫度為22 26°C、光照強度為40 u mo I m_2 s—1的培養室中培養，每天光照12 14小時，培養15 20天，待黃檗愈傷組織形成葉後，繼續培養30 50天，至黃檗愈傷組織褐化。本發明培養方法中所用的優選誘導愈傷組織培養基為I升MS培養基中加入下述 的原料及其配比製成
鹿糖25 35 g
瓊脂粉6 2 7.2 g
2，4_二氯苯氧乙酸 I 5 2.5 mg
6-(苄胺基)嘌呤0.8 1.5 mg本發明培養方法中所用的最用的最佳誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及配比製成
蔗糖30 g
瓊脂粉6.8 g
24一二氯苯氧乙酸2.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤LOmg本發明培養方法採用喜樹葉或莖段為外植體，在MS基本培養基中加入蔗糖、瓊脂粉、2，4 一二氯苯氧乙酸、6-(苄胺基)嘌呤的培養基中組織培養，得到黃檗愈傷組織。採用本發明組織培養方法以及使用的培養基所培養的褐化黃檗愈傷組織，經高效液相法檢測，本發明方法所得到的愈傷組織中小檗鹼的含量為5. 4%以上，高於現有報導的黃檗枝葉中和黃檗皮中的小檗鹼的含量。本發明培養方法以及所採用的培養基，可用於黃檗愈傷組織的培養。
具體實施例方式下面結合實例對本發明進一步詳細說明，但本發明不限於這些實施例。
實施例I(I)外植體製備材料消毒在超淨工作檯上將取下的黃檗葉或黃檗莖段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，期間不斷搖動，然後用無菌水衝洗3-5次，每次2分鐘，用無菌濾紙吸乾表面水分；(2)愈傷組織誘導將(I)中處理好的黃檗葉片切成0. 5X0. 5 I. Ocm2的切塊，黃檗莖段切成0. 5
I.Ocm長的切段接入誘導愈傷組織培養基中誘導愈傷組織，該誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖30 g
_脂粉6.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸 2.0 mg
6-(苄胺基)嘌呤1.0 mgpH為5. 8，配製好的誘導愈傷組織培養基分裝在培養瓶中，每瓶25毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0. I 0. 15MPa下滅菌30分鐘，將培養瓶置於溫度為22 26°C、光照強度為40 u mo I m_2 s—1的培養室中培養，每天光照12 14小時，培養15 20天，葉切塊明顯增厚，體積膨大，葉切塊切口周圍先形成黃檗愈傷組織，莖段切段兩端先形成愈傷組織，然後整個切段形成黃檗愈傷組織。黃檗愈傷組織質地疏鬆，呈淡綠色，繼續培養30 50天，黃檗愈傷組織褐化。實驗結果表明，葉片的誘導率為93. 5%，莖段的誘導率為90. 8%。實施例2在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖20 g
瓊脂粉5.8 g
2，4—二氯苯氧乙酸 1.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例3在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖40 g
瓊脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6 —(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例4在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖20 g
瓊脂粉7.6 g
2, 4—二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例5在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖40 g
瓊脂粉5.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸2.5 mg
6 —(苄胺基)嘌呤2.0 mg 在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例6在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖40 g
瓊脂粉7 6 g
2，4_二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本實施例中，其它培養步驟 與實施例I相同。實施例I在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖40 g
瓊脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸2.5 mg
6-(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例8在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖20 g
瓊脂粉5.8 g
2, 4—二氯苯氧乙酸2.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例9在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖20 g
瓊脂粉7.6 g
2，4一二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例10在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS·基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖20 g
瓊脂粉I 6 g
2，4—二氯苯氧乙酸2.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例11在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖40 g
瓊脂粉5 8 g
24_二氯苯氧乙酸0.5 mg
6—(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例12在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖40 g
瓊脂粉5.8 g
2，4_ 二氯苯氧乙酸 2.5 mg
6—(節胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例13在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖40 g
瓊脂粉7 6 g
24一二氯苯氧乙酸 1.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例14在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖20 g
_脂粉5.8 g
2，4_二氯苯氧乙酸1.0 mg
6-(苄胺基)嘌呤2.0 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例15在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖20 g
瓊脂粉5 8 g
2，4—二氯苯氧乙酸 2.0 mg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實 施例I相同。實施例16在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖20 g
瓊脂粉7.6 g
2，4—二氯苯氧乙酸 LOmg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例17在本實施例的愈傷組織誘導培養步驟中，所用的誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成
蔗糖40 g
瓊脂粉5 8 g
24_ 二氯苯氧乙酸l.Omg
6—(苄胺基)嘌呤0.5 mg在本實施例中，其它培養步驟與實施例I相同。實施例18在以上實施例I 17，愈傷組織誘導工藝步驟中，將黃檗葉片切成I. OX I. Ocm2的切塊，黃檗莖段切成I. Ocm長的切段接入誘導愈傷組織培養基中誘導愈傷組織，所用的誘導愈傷組織培養基與相應的實施例相同。為了驗證本發明培養方法的可行性以及愈傷組織培養基的最佳配比，發明人進行了大量研究和實驗室實驗，並採用本發明實施例I的培養方法和誘導愈傷組織培養基在實驗室誘導出的黃檗愈傷組織中小檗鹼含量進行了對比實驗，情況如下實驗材料黃檗葉、黃檗枝、黃檗莖皮、小檗鹼標準品、MS培養基、2，4 一二氯苯氧乙酸、6—(節胺基)嘌呤、瓊脂粉、蔗糖、甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)、磷酸(分析純)、乙腈(色譜純)，2，4_二氯苯氧乙酸實驗時名稱為2，4-D，6-(苄胺基)嘌呤實驗時名稱為6-BA。材料提供單位黃檗葉、黃檗枝和黃檗莖皮由東北林業大學實驗林場提供，MS基本培養基按照《植物組織培養》一書MS基本培養基配方由東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗組培實驗室配製，2，4_ 二氯苯氧乙酸和6-(苄胺基)嘌呤由Sigma公司生產，瓊脂粉由北京奧博星生物技術責任有限公司生產，蔗糖、甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)市售，乙腈(色譜純)由美國Tedia公司生產，小檗鹼標準品購自中國藥檢所。實驗儀器超淨工作檯、容量瓶、Waters高效液相色譜儀(Waters公司)，色譜柱、KQ-100DB超聲波儀由江蘇崑山超聲儀器公司生產。實驗方法與結果I、黃檗愈傷組織誘導實驗將黃檗的葉片和莖段分別接種在I升MS基本培養基中加入蔗糖30g、瓊脂粉6. 8g及不同種類和不同濃度激素的培養基上，30天後統計黃檗愈傷組織誘導率，實驗結果見表
Io表I黃檗愈傷組織誘導率
權利要求
1.一種含小檗鹼的黃檗愈傷組織培養方法，其特徵在於它包括如下步驟 (1)外植體製備 材料消毒在超淨工作檯上將取下的黃檗葉或黃檗莖段在70%的酒精中浸泡15-20秒，再用10%的次氯酸鈉消毒8分鐘，期間不斷搖動，然後用無菌水衝洗3-5次，每次2分鐘，用無菌濾紙吸乾表面水分； (2)愈傷組織誘導 將(I)中處理好的黃檗葉片切成0.5X0. 5 LOcm2的切塊，黃檗莖段切成0. 5 I. Ocm長的切段接入誘導愈傷組織培養基中誘導愈傷組織，該誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖20 40 g 瓊脂粉5.8 7.6 g2, 4—二氯苯氧乙酸 0 5 2.5 mg6—(苄胺基)嘌呤0.5 2.0 mg pH為5. 8，配製好的誘導愈傷組織培養基分裝在培養瓶中，每瓶25毫升，蓋好瓶蓋，在壓力為0. I 0. 15MPa下滅菌30分鐘，將培養瓶置於溫度為22 26°C、光照強度為40 u mo I m_2 s—1的培養室中培養，每天光照12 14小時，培養15 20天，待黃檗愈傷組織形成葉後，繼續培養30 50天，至黃檗愈傷組織褐化。
2.按照權利要求I所述的含小檗鹼的黃檗愈傷組織培養方法，其中誘導愈傷組織培養基為在I升MS培養基中加入下述的原料及其配比製成蔗糖25 35 g瓊脂粉6.2 7.2 g2 4_二氯苯氧乙酸 1.5 2.5 mg.6-(苄胺基)嘌呤0 8 1.5 mg。
3.按照權利要求I所述的含小檗鹼的黃檗愈傷組織培養方法，其中誘導愈傷組織培養基為在I升MS基本培養基中加入下述的原料及配比製成蔗糖30 g瓊脂粉6 8 g .2，4一二氯苯氧乙酸 2.0 mg .6-(苄胺基)嘌呤1.0 mg。
全文摘要
一種含小檗鹼的黃檗愈傷組織培養方法，包括(1)製備外植體；(2)愈傷組織誘導將(1)處理的黃檗葉片切成0.5×0.5～1.0cm2的塊，黃檗莖段切成0.5～1.0cm長的段接入誘導愈傷組織培養基中誘導愈傷組織。該誘導愈傷組織培養基為在1升MS基本培養基中加入蔗糖20～40g，瓊脂粉5.8～7.6g、2，4－二氯苯氧乙酸0.5～2.5mg，6－(苄胺基)嘌呤0.5～2.0mg，pH為5.8，配製好的誘導愈傷組織培養基分裝地培養瓶中，每瓶25毫升，在壓力為0.1～0.15MPa下滅菌25分鐘，將培養瓶置於溫度為22～26℃、光照強度為40μmol·m-2·s-1的溫度中培養，每天光照12～14小時，培養15～20天，待黃檗愈傷組織形成葉後，繼續培養30～50天，至黃檗愈傷組織褐化。
文檔編號A01H4/00GK102742505SQ201210252230
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者劉彤, 周志強, 張玉紅, 曲偉娣, 溫慧, 金鳳新 申請人:東北林業大學, 周志強, 張玉紅