玉米低磷響應基因ZmARF31的SNP分子標記及其應用的製作方法

2023-06-03 09:44:26

玉米低磷響應基因ZmARF31的SNP分子標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了玉米低磷響應基因ZmARF31基因的SNP分子標記，該SNP標記位於玉米第10號染色體148636105bp位置，等位基因為T和G，位點側翼序列如SEQ ID NO.1所示，其由核苷酸序列如SEQ ID NO.2～3所示的引物擴增得到。該SNP分子標記在正常磷水平和低磷脅迫下與玉米總乾重顯著相關，位點基因型為G/G的玉米自交系在正常磷水平和低磷脅迫下總乾重均高於位點基因型為T/T的自交系。本發明的分子標記可用於玉米輔助育種，加速玉米磷高效特異材料創製與新品種選育進程。
【專利說明】玉米低磷響應基因 ZmARF31的SNP分子標記及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及分子遺傳學領域，特別是涉及與玉米耐低磷性狀相關的分子標記，具 體地，涉及玉米10號染色體上ZmARF31基因內的一個與總千重顯著關聯的SNP標記、擴^ 其的引物對以及該分子標記的應用。 '

【背景技術】
[0002]玉米是集糧、經、飼為一體的多元作物，同時也是重要的工業原料和能源作物，在 世界範圍內廣泛分布。20世紀末，隨著全球玉米需求的快速增長，其種植面積逐漸超過水稻 和小麥，成為總產量位居世界第一的糧食作物。預計到 2〇5〇年糧食增產的50%將來自玉 米。磷是植物生長發育所必需的二大營養兀素之一，在糖分代謝、能量代謝、酶促反應及光 合作用等過程中起著至關重要的作用，很大程度上決定了作物的產量和品質。然而，由於土 壤對磷強烈的吸附導致土壤中可被植物吸收的有效無機磷濃度低至2 μ m〇l/L左右，土壤 有效磷缺乏成為限制作物產量的重要非生物脅迫因素之一。因此，加強培育和推廣磷高效 品種是最為有效的措施，也是農業低碳和可持續發展的有效途徑。
[0003]研究和生產實踐表明，磷的吸收利用效率在玉米自交系間存在顯著的基因型差 異。磷對植物根系發育的影響是複雜的，不僅表現為品種特異性和基因型依賴性，還涉及多 種激素信號通路的交叉調節。磷缺乏時主要通過抑制細胞分裂和靜止中心的丟失而嚴重製 約初生根的生長，同時有效磷通過調控側生根根原基的初始化，初生根和側生根的生長以 及側生根的生長角度，根毛的密度和伸長等改變根系的適應性形態。
[0004]玉米耐低磷相關性狀作為一種複雜的數量性狀，利用連鎖作圖進行QTL定位以解 析相關性狀的遺傳基礎已有大量報導。但QTL定位費時費力，且大部分QTL區間寬泛，目前 玉米種質改良和分子輔助育種中尚未有耐低磷主效位點分子標記開發與利用的報導。
[0005]關聯分析是一種在自然群體中基於連鎖不平衡（LD)鑑定表型性狀與遺傳標記或 候選基因間關係的分析方法，主要包括基於全基因組掃描（GWAS)和基於候選基因的關聯 分析。其中，基於候選基因的關聯分析是發掘與表型變異密切相關的功能等位變異的有效 手段。


【發明內容】

[0006] 本發明的第一個目的在於提供玉米低磷響應基因 ZmARF31中與總千重顯著關聯 的SNP (單核苷酸多態性）標記。
[0007] 本發明的第二個目的是提供擴增上述SNP標記的引物對。
[0008] 本發明的第三個目的是提供上述SNP標記的應用。
[0009]本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0010] 基於以上目的， 申請人:收集了中國、美國、墨西哥等地的溫帶、熱帶、亞熱帶 玉米自交系331份，作為本研究的關聯群體，利用同源克隆方法獲得其低磷響應基因 ZmARF31(GRMZM2G023813)序列，通過多序列比對，發掘該基因在331份玉米自交系中的變 異位點。本申請結合正常磷水平和低磷脅迫處理下玉米自交系苗期根系性狀的表型數據， 運用TASSEL軟體的一般線性模型和混合線性模型兩種方法進行候選基因關聯分析，並同 時檢測到一個（基因組版本和位置為Maize B73AGP_v3:Chrl0:148636105)與玉米總乾重 顯著關聯的SNP位點。該位點的等位基因為T和G，在供試自交系中有T/T和G/G兩種純合 基因型，其側翼序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 該SNP分子標記在正常磷水平和低磷脅迫下與玉米總千重顯著相關，位點基因型 為G/G的玉米自交系在正常磷水平和低磷脅迫下總乾重均高於位點基因型為T/T的自交 系。
[0012] 進一步，本發明提供了上述SNP分子標記在提高玉米總乾重中的應用。優選地， SNP分子標記的位點基因型G/G為優異基因型。
[0013] 本發明還提供了上述SNP分子標記在玉米育種中的應用。
[0014] 篩選到該顯著關聯的SNP位點後，基於該位點側翼序列， 申請人:設計了包含上述 SNP位點的檢測玉米低磷響應基因 ZmARF31基因的特異性引物對。引物對序列如下所示：
[0015] 上遊（F) :GCCTCCCCACCGTCGGCGA(SEQ ID N0. 2)
[0016] 下遊（R) :TGGCCATCGGGAAAGTAGTAG(SEQ ID NO. 3)
[0017] 本發明提供了上述引物對在玉米種質改良中的應用。
[0018] 本發明還提供了上述引物對在選育抗逆玉米中的應用。
[0019] 本發明提供一種檢測玉米低磷響應基因 ZmARF31的方法，用上述引物對進行PCR 擴增，待檢測玉米基因組DNA，如果能夠擴增出SEQ ID NO. 1所示的片段，則說明該待檢玉米 存在低磷響應基因 ZmARF31。
[0020] PCR程序為：98°C預變性90s ;95°C變性5s、57°C退火5s，共50個循環。
[0021] 本發明提供了上述方法在玉米育種中的應用。
[0022] 為進一步驗證所開發標記的有效性，發明人在關聯群體中隨機挑選16份玉米自 交系，以DNA為模板，採用飽和螢光染料Eva-Green Super Mix進行基於PCR擴增的HRM(高 解析度溶解曲線）驗證，結果顯示該SNP位點成功地對I6份玉米自交系進行基因分型檢測 (見圖1)。
[0023] 同時，發明人利用前期構建的玉米耐低磷RIL群體（P178X9782)中的198個家系 的DNA為模板，對該位點進行HRM驗證（圖2)。結果發現在該RIL群體中，SNP位點與正常 磷水平和低磷脅迫下總乾重存在顯著相關性（圖3)，與ZmARF31基因在331份玉米自交系 中的關聯分析結果基本一致。
[0024] 本發明還提供了一種檢測玉米低磷響應基因 ZmARFl的試劑盒，其含有SEQ ID NO. 2?3所示的引物對。本發明結合ZmARF31在自然群體中的序列多樣性，利用候選基因 關聯分析策略揭示該基因與低磷脅迫下玉米根系性狀之間的內在聯繫，發掘其中顯著的功 能位點，並作為遺傳標記應用於玉米分子育種,對提高玉米抗逆性具有重要意義。
[0025]本發明的有益效果在於：運用候選基因關聯分析方法，能夠快速、精確地檢測與 特定性狀顯著關聯的SNP或InDel位點。玉米10號染色體148636105bp位置的SNP位點 (Maize B73AGP_v3:Chrl0:148636105)與正常磷水平下玉米苗期總乾重顯著相關，解釋表 型變異為 3· 〇8%。該SNP位點能夠作為遺傳標記，用於抗逆玉米育種，提高玉米耐低磷能 力，具有較高的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為16份玉米自交系中基於PCR擴增的HRM(高解析度溶解曲線）分析。其中 黑色和灰色曲線分別表示基因型"T/T"和"G/G"。
[0027] 圖2為RIL群體中72個家系基於PCR擴增的HRM(高解析度溶解曲線）分析。其 中黑色和灰色曲線分別表示基因型"T/T"和"G/G"。
[0028] 圖3為RIL群體T/T和G/G基因型個體的總乾重比較。TDW表示性狀總乾重；CK 和T分別表示正常磷水平對照組和低磷脅迫處理組；*表示〇· 01 < p < 05, ***表示 Ρ〈0· 001。RIL群體中具有T/T基因型和G/G基因型的家系分別為1〇1和82個。

【具體實施方式】
[0029] 以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離 本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明 的範圍。
[0030] 若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0031] 實施例1玉米低磷響應基因 ZmARF31與總千重顯著相關的一個SNP分子標記的獲 得及其檢測引物的確定
[0032] 本發明玉米低磷響應基因 ZMRF31與總乾重顯著相關的一個SNP分子標記是通過 以下方法獲得的：
[0033] 1)收集獲得331份來自中國、美國、墨西哥的玉米自交系，構建了作圖所用的關聯 群體。該群體有著豐富的遺傳多樣性，包含131個溫帶玉米自交系和200個熱帶/亞熱帶 玉米自交系。
[0034] 2)關聯群體苗期根系表型鑑定。分別於2010年在四川農業大學多營農場基地 和2〇12年在四川農業大學雅安教學實驗大棚對獲得的331份玉米自交系進行以新鮮河沙 為基質的盆栽試驗。待玉米生長至兩葉一芯期後，定期澆灌改良的霍格蘭營養液。其中對 照組施燒正吊的全素營養液（磷含量為In^ol/Q，低磷脅迫組施饒低磷營養液（磷含量為 Ιμπιο?/L)，培養至6葉期。每個自交系選取5株，運用Eps〇n Expressi〇n i〇〇〇〇XL掃描儀 和Regent Winrhizo Canada根系分析系統測定供試自交系的根系性狀，之後將植株分裝在 不同的紙袋中置於ΙΟδΓ殺青3〇 min，並75°C烘乾至恆重。正常磷水平條件下總千重的平均 值為1. 1扣，低磷脅迫下總乾重的平均值為〇· ?4g。方差分析表明，總乾重在不同自交系和 不同處理下差異達極顯著水平（表υ。
[0035]表1總乾重在正常供磷水平和低磷脅迫處理的方差分析
[0036]

【權利要求】
1. 玉米低磷響應基因 ZmARF31的SNP分子標記，該SNP分子標記位於玉米第10號染色 體148636105bp位置，等位基因為T和G。
2. 如權利要求1所述的SNP分子標記，其特徵在於，其位點側翼序列如SEQ ID NO. 1所 /_J、1 ο
3. 權利要求1?2任一所述的SNP分子標記在玉米育種中的應用。
4. 權利要求1?2任一所述的SNP分子標記在提高玉米總乾重中的應用。
5. 如權利要求4所述的應用，其特徵在於，SNP分子標記的位點基因型為G。
6. 檢測權利要求1或2所述SNP分子標記的引物對，其特徵在於， 上遊引物序列，5' -GCCTCCCCACCGTCGGCGA-3' ； 下遊引物序列，5 ' -TGGCCATCGGGAAAGTAGTAG-3 '。
7. 權利要求6所述引物對在玉米種質改良中的應用。
8. -種檢測玉米低磷響應基因 ZmARF31的方法，其特徵在於，用權利要求6所述的引物 對進行PCR擴增待檢測玉米基因組DNA，如果能夠擴增出SEQ ID NO. 1所示的片段，則說明 該待檢玉米存在低磷響應基因 ZmARF31基因。
9. 如權利要求8所述的方法，其特徵在於，PCR程序為：98°C預變性90s ;95°C變性5s、 57°C退火5s，共50個循環。
10. -種檢測玉米低磷響應基因 ZmARFl的試劑盒，其含有SEQ ID NO. 2、3所示的引物 對。
【文檔編號】C12Q1/68GK104232764SQ201410446335
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月3日 優先權日:2014年9月3日
【發明者】盧豔麗, 吳鋒鍇, 劉玲, 李嘉, 徐潔, 蘭海, 高世斌, 吳元奇, 周樹峰, 劉亞西, 曹墨菊 申請人:四川農業大學