利用酶生產蝦青素的方法

2023-06-03 05:49:16 2

專利名稱：利用酶生產蝦青素的方法
技術領域：
本發明涉及一種蝦青素的生產方法，特別是涉及一種利用酶生產蝦青素的方法。
背景技術：
蝦青素是一種萜烯類不飽和化合物，化學名稱為3，3- 二羥基-4，4- 二酮基， 胡蘿蔔素，分子式為C4tlH52O4，相對分子量為596. 86，不溶於水，具脂溶性。蝦青素廣泛
存在於生物體內，在大馬哈魚的肉質中，蝦青素佔類胡蘿蔔素的70%左右，有的甚至高達99. 8%。由於蝦青素分子結構中的共軛雙鍵，以及共軛雙鍵末端的不飽和酮基和羥基，能吸引自由基從而具有抗氧化作用，蝦青素是目前天然抗氧化劑中，抗氧化能力最強的化合物之一，其抗氧能力比￠-胡蘿蔔素強117倍，比維生素E強80倍。雨生紅球·藻(Haematococcus pluvialis)是一種淡水單細胞綠藻，隸屬綠藻門團藻目紅球藻科紅球藻屬。該藻的生長分為明顯的綠色遊動細胞和紅色不動孢子兩個階段。在弱光、氮磷豐富的環境中主要以綠色的遊動細胞形式存在，在該過程中雨生紅球藻生長旺盛，細胞內含有少量蝦青素；而在高光照、高溫、高鹽和營養鹽飢餓條件下，則以不動抱子(厚壁抱子)形式存在，此時，藻細胞中常因含有大量蝦青素而呈現紅色。目前，國內外主要利用紅法夫酵母為菌種發酵生產蝦青素。紅法夫酵母以葡萄糖、纖維二糖為碳源；硫酸銨為氮源；由於其為兼性好氧，間斷通氣；最適培養溫度為20 220C ;最適pH值為5. 0 ;供氧速率要高於30mmol/h ;紅法夫酵母對其培養條件較為苛刻，比如供氧速率低於30mmol/h時，細胞的產量和蝦青素的產量都明顯下降。氧氣濃度達到30mmol/h時，再繼續提高通氣量，蝦青素的產量提高不大。利用紅法夫酵母為菌種發酵生產蝦青素過程中，紅法夫酵母易被外界黴菌汙染，所以在發酵過程中需要在無菌環境，同時紅法夫酵母為好氧菌，發酵需要通入無菌氧，大大提高成本；發酵過程中要嚴格控制溫度，PH值以及供氧速率，任何一個發酵條件都直接影響蝦青素的生產效率；到發酵後期菌體會產生有毒副產物，對蝦青素後續淨化提純帶來困難，同時也汙染環境。

發明內容
基於此，本發明提供一種利用酶生產蝦青素的方法。解決上述技術問題的具體技術方案如下一種利用酶生產蝦青素的方法，包括以下步驟(I)康氏木黴的培養將康氏木黴孢子懸浮液接入PDY液體培養基中，培養1. 5-2. 5d，離心去上清液，得康氏木黴菌菌泥；(2)康氏木黴發酵物的培養取步驟(I)所得的康氏木黴菌菌泥接入固體發酵培養基中，先於30-32°C下培養29-31h，後於26-28°C下培養75-90h，離心去上清液，得康氏木黴發酵物；通過調控發酵條件，使所得的康氏木黴發酵物中富含纖維素酶；(3)雨生紅球藻的擴培將雨生紅球藻接入BBM培養基並置於封閉式光生物反應器中，通空氣培養1. 5-2. 5d,離心取雨生紅球藻藻泥；(4)富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉的製備將步驟(3)所得的雨生紅球藻藻泥接A BBM培養基中，通入CO2，通氣量為0. 5 1. 5L/(L *min)並於32_35°C培養2_3d，離心去上清液，冷凍乾燥得富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉；通過調控光照和溫度培養富集蝦青素雨生紅球藻；(5)蝦青素乾粉的製備將步驟(2)所得的康氏木黴發酵物和步驟(4)所得的富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉混合，勻質，離心，過濾取固體相，冷凍乾燥，得蝦青素乾粉；由於康氏木黴發酵物中富含纖維素酶可降解雨生紅球藻的細胞壁，而均質可進一步使藻細胞破碎，釋放蝦青素，由於蝦青素不溶於水，所以離心後蝦青素存在於非溶解相，即固體相，該固體相經乾燥後，即得蝦青素乾粉。(6)蝦青素的萃取用玉米油萃取步驟(5)所得的富含蝦青素的乾粉，即可得蝦青素；由於蝦青素為脂溶性的，用玉米油可有效萃取蝦青素。在其中一些實施例中，步驟(1)所述的PDY液體培養基的組成及重量份配比如下馬鈴薯18-22wt%，葡萄糖1. 5-2. 5wt%，酵母膏0. 8-1. 2wt%，餘量為水。在其中一些實施例中，步驟(1)所述的康氏木黴孢子懸浮液接入量為康氏木黴孢子懸浮液與PDY液體培養基的重量份配比為1:9-11，所述康氏木黴孢子懸浮液中康氏木黴孢子的濃度為0. 04-0. 06mg/L。在其中一些實施例中，步驟(1)所述的培養的條件為溫度23-27 °C、轉速120_150r/mino在其中 一些實施例中，步驟(2)所述的康氏木黴囷泥的接入量為康氏木黴囷泥與固體發酵培養基的重量份配比為1:490-560。在其中一些實施例中，步驟(2)所述的固體發酵培養基的組成及重量份配如下豆柏0. 9-1.1份、稻草11-13份、麩皮9-11份、羧甲基纖維素鈉0. 75-0. 85份、吐溫-800. 009-0. 011 份、(NH4) 2S040 . 07-0 . 09 份、水 28-30 份。在其中一些實施例中，步驟(3)所述的封閉式光生物反應器的參數為溫度25-28 °C，光照 55-65 u mo 1 m 2 s 1 在其中一些實施例中，步驟(3)所述的BBM培養基的組成及重量份配比如下硝酸鈉245-255份；磷酸二氫鉀170-180份；磷酸氫二鉀70-80份；七水硫酸鎂70-80份；二水氯化鈣23-38份；氯化鈉23-38份；EDTA48_53份；氫氧化鉀29-33份；七水硫酸亞鐵4. 8-5份；硼酸11-12份；七水硫化鋅8. 5-9份；氯化錳1. 4-1. 5份；氧化鑰0. 7-0. 8份；五水硫酸銅1. 5-1. 6份；六水硝酸鈷0. 7-0. 8份，蒸餾水1000ml。在其中一些實施例中，步驟(3)所述的雨生紅球藻的接入量為每IOOmLBBM培養基中接入雨生紅球藻3-5g。在其中一些實施例中，步驟(4)所述的BBM培養基的組成及重量份配比如下七水硫酸鎂70-80份，二水氯化鈣23-38份，氯化鈉23-38份，EDTA48-53份，氫氧化鉀29-33份，七水硫酸亞鐵4. 8-5份,硼酸11-12份,七水硫化鋒8. 5-9份,氯化猛1. 4-1. 5份,氧化鑰0. 7-0. 8份，五水硫酸銅1. 5-1. 6份，蒸餾水1000ml。在其中一些實施例中，步驟(4)所述的雨生紅球藻藻泥的接入量為 每IOOmL BBM培養基中接入雨生紅球藻藻泥20-25g。
本發明一種利用酶生產蝦青素的方法具有以下優點和有益效果本發明可高效地獲得天然蝦青素，工藝簡單，成本低，環境汙染少，且在發酵過程中不產生有毒的副產物，後期淨化提純方法簡易，適合工業化推廣。
具體實施例方式本發明採用康氏木黴固體發酵製備富含纖維素酶的發酵物，通過調控光照和溫度培養富集蝦青素雨生紅球藻，發酵物可高效分解雨生紅球藻細胞壁，經均質進一步破壞細胞膜，使雨生紅球藻體內富集的蝦青素釋放出來，離心取不溶解相，冷凍乾燥，最後利用玉米油萃取，即得蝦青素。以下將結合具體的實施例對本發明做進一步闡述。實施例1一種利用酶生產蝦青素的方法，包括以下步驟(I)康氏木黴的培養將斜面培養基上的康氏木黴孢子用無菌水洗下,製成康氏木黴孢子的濃度為0. 05mg/L孢子懸浮液；在IOOOml的PDY培養基(該培養基含馬鈴薯20wt%，葡萄糖2wt%,酵母膏lwt%,餘量為水,上述物質共計100wt%)中接入IOOml康氏木黴孢子懸浮液，在25°C 、120 150r/min條件下培養2d，離心去上清液，收集菌泥；(2)康氏木黴發酵物的培養將步驟(I)培養好的康氏木黴菌菌泥取IOOg接種到固體發酵培養基(該培養基含豆柏1kg、稻草12kg、麩皮10kg、CMC-NaO. 8kg、吐溫-800. 01kg、(NH4)2SO4O. 08kg、水29kg)，即取IOOg步驟(I)所得的康氏木黴菌泥接入52. 89kg的固體發酵培養基中，先於30-32°C下培養30h，後於26-28°C下培養88h，離心去上清液，並用無菌水清洗離心所得固體相，得康氏木黴發酵物；(3)雨生紅球藻的擴培取40g雨生紅球藻接入BBM培養基(硝酸鈉250mg，磷酸二氫鉀175mg，磷酸氫二鉀75mg，七水硫酸鎂75mg，二水氯化鈣25mg，氯化鈉25mg，EDTA50mg，氫氧化鉀31mg,七水硫酸亞鐵4. 9811^,硼酸11. 42mg,七水硫化鋅8. 82mg,氯化猛1. 44mg,氧化鑰0. 71mg,五水硫酸銅1. 57mg,六水硝酸鈷0. 75mg,蒸懼水IOOOml)並置於封閉式光生物反應器中，封閉式光生物反應器的參數為溫度s-1下連續光照，同時通空氣培養2d，離心取雨生紅球藻藻泥；(4)富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉的製備將步驟(3)所得的雨生紅球藻藻泥230g接入BBM培養基(七水硫酸鎂75mg，二水氯化鈣25mg，氯化鈉25mg，EDTA50mg,氫氧化鉀31mg,七水硫酸亞鐵4. 98mg,硼酸11. 42mg,七水硫化鋅8. 82mg,氯化猛1. 44mg,氧化鑰
0.71mg，五水硫酸銅1.57mg，蒸餾水1000ml)中，通入CO2通氣量為0. 5 1. 5L/(L min)並於32-35°C培養2. 5d，得藻液，藻液經沉降、離心濃縮去上清液，冷凍乾燥得富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉；(5)蝦青素的乾粉的製備將步驟(2)所得的康氏木黴發酵物和步驟(4)所得的富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉混合，勻質，離心，過濾取固體相，冷凍乾燥，得蝦青素的乾粉；(6)蝦青素的萃取用玉米油萃取步驟(5)所得的富含蝦青素的乾粉，即可得蝦青素提取率為0. 97% 0. 98%。實施例2一種利用酶生產蝦青素的方法，包括以下步驟
(I)康氏木黴的培養將斜面培養基上的康氏木黴孢子用無菌水洗下,製成康氏木黴孢子的濃度為0. 04mg/L孢子懸浮液；在IOOOml的PDY培養基(該培養基含馬鈴薯18wt%，葡萄糖1. 5wt%,酵母膏0. 8wt%,餘量為水,上述物質共計100wt%)中接入IOOml康氏木黴孢子懸浮液，在23°C、120 150r/min條件下培養1. 5d，離心去上清液，收集菌泥；(2)康氏木黴發酵物的培養將步驟(I)培養好的康氏木黴取IOOg接種到固體發酵培養基(該培養基含豆柏0. 9kg、稻草I lkg、麩皮9kg、CMC-NaO. 75kg、吐溫-800. 009kg、(NH4)2SO4O. 07kg、水28kg)，即取IOOg步驟(I)所得的康氏木黴菌泥接入49. 73kg的固體發酵培養基中，先於30-32°C下培養29h，後於26-28°C下培養76h，離心去上清液，並用無菌水清洗離心所得固體相，得康氏木黴發酵物；(3)雨生紅球藻的擴培將31g雨生紅球藻接入BBM培養基(硝酸鈉245mg，磷酸二氫鉀170mg,磷酸氫二鉀70mg,七水硫酸鎂70mg, 二水氯化韓23mg,氯化鈉23mg份，EDTA48mg,氫氧化鉀29mg,七水硫酸亞鐵4. 8mg,硼酸Ilmg,七水硫化鋅8. 5mg,氯化猛1. 4mg,氧化鑰0. 7mg,五水硫酸銅1. 5mg,六水硝酸鈷0. 7mg,,蒸懼水1000ml)並置於封閉式光生物反應器中，封閉式光生物反應器的參數為溫度25°C，55iimol.m-2. s-1下連續光照，同時通空氣培養1. 5d，離心取雨生紅球藻藻泥；(4)富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉的製備將步驟(3)所得的雨生紅球藻藻泥210g接入BBM培養基(二水氯化鈣23mg，氯化鈉23mg份；EDTA48mg ;氫氧化鉀29mg ;七水硫酸亞鐵4. 8mg ;硼酸Ilmg ;七水硫化鋅8. 5mg ;氯化猛L 4mg ;氧化鑰0. 7mg ;五水硫酸銅1.5mg ;蒸餾水1000ml)中，通入CO2通氣量為0. 8 1. 2L/(L .min)並於32_35°C培養2d，得藻液，藻液經沉降、離心濃縮去上清液，冷凍乾燥得富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉；所述BBM培養基中不含NaNO3 ；(5)蝦青素的乾粉的製備將步驟(2)所得的康氏木黴發酵物和步驟(4)所得的富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉混合，勻質，離心，過濾取固體相，冷凍乾燥，得蝦青素的乾粉；(6)蝦青素的萃取 用玉米油萃取步驟(5)所得的富含蝦青素的乾粉，即可得蝦青素提取率為0. 959T0. 96%。實施例3—種利用酶生產蝦青素的方法，包括以下步驟(I)康氏木黴的培養將斜面培養基上的康氏木黴孢子用無菌水洗下，製成康氏木黴孢子的濃度為0. 06mg/L孢子懸浮液；在IOOOml的PDY培養基(該培養基含馬鈴薯22wt%，葡萄糖2. 5wt%,酵母膏1. 2wt%,餘量為水,上述物質共計100wt%)中接入IOOml康氏木黴孢子懸浮液，在27°C、120 150r/min條件下培養1. 5d，離心去上清液，收集菌泥；(2)康氏木黴發酵物的培養將步驟(I)培養好的康氏木黴取IOOg接種到固體發酵培養基(該培養基含豆柏1. lkg、稻草13kg、麩皮11kg、CMC-NaO. 85kg、吐溫-800. 011kg、(NH4)2SO4O. 09kg、水30kg)，即取IOOg步驟(I)所得的康氏木黴菌泥接入56. 05kg的固體發酵培養基中，先於30-32°C下培養31h，後於26-28°C下培養81h，離心去上清液，並用無菌水清洗離心所得固體相，得康氏木黴發酵物；(3)雨生紅球藻的擴培將49g雨生紅球藻接入BBM培養基(硝酸鈉255mg，磷酸二氫鉀180mg,磷酸氫二鉀80mg,七水硫酸鎂80mg, 二水氯化韓38mg,氯化鈉38mg, EDTA53mg,氫氧化鉀33mg,七水硫酸亞鐵5mg,硼酸12mg,七水硫化鋅9mg,氯化猛1. 5mg,氧化鑰0.8mg,五水硫酸銅1. 6mg,六水硝酸鈷0. 8mg,蒸懼水1000ml)並置於封閉式光生物反應器中，封閉式光生物反應器的參數為溫度28°C，65iimol.m-2. s-1下連續光照，同時通空氣培養2. 5d，離心取雨生紅球藻藻泥；(4)富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉的製備將步驟(3)所得的雨生紅球藻藻泥248g接BBM培養基(七水硫酸鎂80mg，二水氯化鈣38mg，氯化鈉38mg，EDTA53mg,氫氧化鉀33mg,七水硫酸亞鐵5mg,硼酸12mg,七水硫化鋅9mg,氯化猛1. 5mg,氧化鑰0. 8mg,五水硫酸銅1.6mg，蒸餾水1000ml)中，通入CO2通氣量為I 1.4L/(L min)並於32-35°C培養3d，得藻液，藻液經沉降、離心濃縮去上清液，冷凍乾燥得富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉；所述BBM培養基中不含NaNO3 ；(5)蝦青素的乾粉的製備將步驟(2)所得的康氏木黴發酵物和步驟(4)所得的富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉混合，勻質，離心，過濾取固體相，冷凍乾燥，得蝦青素的乾粉；(6)蝦青素的萃取用玉米油萃取步驟(5)所得的富含蝦青素的乾粉，即可得蝦青素提取率為0. 959T0. 96%。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發 明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。
權利要求
1.一種利用酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，包括以下步驟(1)康氏木黴的培養將康氏木黴孢子懸浮液接入PDY液體培養基中，培養1.5-2. 5d， 離心去上清液，得康氏木黴菌菌泥；(2)康氏木黴發酵物的培養取步驟(I)所得的康氏木黴菌菌泥接入固體發酵培養基中，先於30-32°C下培養29-31h，後於26-28°C下培養75-90h，離心去上清液，得康氏木黴發酵物；(3)雨生紅球藻的擴培將雨生紅球藻接入BBM培養基並置於封閉式光生物反應器中， 通空氣培養1. 5-2. 5d，離心去上清液，得雨生紅球藻藻泥；(4)富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉的製備將步驟(3)所得的雨生紅球藻藻泥接入BBM 培養基中，通入CO2,通氣量為O. 5 1. 51/ (L -min)並於32_35°C培養2_3d，離心去上清液， 冷凍乾燥得富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉；(5)蝦青素乾粉的製備將步驟(2)所得的康氏木黴發酵物和步驟(4)所得的富集蝦青素的雨生紅球藻藻粉混合，勻質，離心，過濾取固體相，冷凍乾燥，得蝦青素乾粉；(6)蝦青素的萃取用玉米油萃取步驟(5)所得的富含蝦青素的乾粉，即可得蝦青素。
2.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(I)所述的PDY 液體培養基的組成及重量份配比如下馬鈴薯18-22wt%，葡萄糖1.5-2. 5wt%，酵母膏O.8-1. 2wt%，餘量為水。
3.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(I)所述的康氏木黴孢子懸浮液接入量為康氏木黴孢子懸浮液與PDY液體培養基的重量份配比為1:9-11，所述康氏木黴孢子懸浮液中康氏木黴孢子的濃度為O. 04-0. 06mg/L,所述的培養條件為溫度 23-27°C、轉速 120-150r/min。
4.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的康氏木黴菌菌泥的接入量為康氏木黴菌菌泥與固體發酵培養基的重量份配比為1:490-560。
5.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(2)所述的固體發酵培養基的組成及重量份配如下豆柏O. 9-1.1份、稻草11-13份、麩皮9-11份、羧甲基纖維素鈉 O. 75-0. 85 份、吐溫-800. 009-0. 011 份、(NH4) 2S040. 07-0. 09 份、水 28-30 份。
6.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的封閉式光生物反應器的參數為溫度25-28°C，光照55-65 μ mo I · m_2 · s-1。
7.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的BBM培養基的組成及重量份配比如下硝酸鈉245-255份，磷酸二氫鉀170-180份，磷酸氫二鉀 70-80份，七水硫酸鎂70-80份，二水氯化鈣23-38份，氯化鈉23-38份，EDTA48-53份，氫氧化鉀29-33份，七水硫酸亞鐵4. 8-5份，硼酸11-12份，七水硫化鋅8. 5_9份，氯化錳1. 4-1. 5 份，氧化鑰O. 7-0. 8份，五水硫酸銅1. 5-1. 6份，六水硝酸鈷O. 7-0. 8份，蒸餾水IOOOml。
8.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(3)所述的雨生紅球藻的接入量為每IOOmL BBM培養基中接入雨生紅球藻3_5g。
9.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(4)所述的BBM培養基的組成及重量份配比如下七水硫酸鎂70-80份，二水氯化鈣23-38份，氯化鈉23-38份， EDTA48-53份，氫氧化鉀29-33份，七水硫酸亞鐵4. 8-5份，硼酸11_12份，七水硫化鋅8. 5-9 份，氯化錳1. 4-1. 5份，氧化鑰O. 7-0. 8份，五水硫酸銅1. 5-1. 6份，蒸餾水IOOOml。
10.根據權利要求1所述的酶生產蝦青素的方法，其特徵在於，步驟(4)所述的雨生紅球藻藻泥的接入量為每IOOmL BBM培養基中接入雨生紅球藻藻泥20-25g。
全文摘要
本發明公開了一種利用酶生產蝦青素的方法，包括以下步驟將康氏木黴孢子懸浮液接入9-11倍重量的PDY液體培養基中，離心取康氏木黴菌泥；取菌泥接入490-560倍重量的固體發酵培養基中，先30-32℃培養29-31h，後26-28℃培養75-90h，離心得康氏木黴發酵物；利用封閉式光生物反應器，將雨生紅球藻於BBM培養基中培養2d，離心取藻泥；將藻泥接入BBM培養基中，通CO2於32-35℃培養2-3d，離心冷凍乾燥得藻粉；將發酵物和藻粉勻質，離心取固體相，冷凍乾燥，得蝦青素乾粉；用玉米油萃取乾粉，即得蝦青素。本發明可高效地獲得天然蝦青素，工藝簡單，成本低，環境汙染少。
文檔編號C07C403/24GK103044303SQ20121055731
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者劉立國, 王倩, 劉柏楠 申請人:廣州優銳生物科技有限公司