功能化的量子點及其製備方法和用途的製作方法
2023-06-03 05:35:31 1
專利名稱：功能化的量子點及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種功能化的量子點和其被功能化的方法以及用途。具體涉及一種N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點和其被N-羥基琥珀醯亞胺酯化的方法及用途。
背景技術：
近年來，納米技術已逐漸融合滲透至分析科學，極大地促進了生物分析的發展。
量子點(quantum dots，QDs)，又稱半導體納米微晶體，是一種由II-VI族或III-V族元素組成，直徑約為2nm～6nm，能夠接受激發光產生螢光的半導體納米顆粒，具有優良的光譜特徵和光化學穩定性。單獨的量子點顆粒易受到雜質和晶格缺陷的影響，螢光量子產率很低。如果以其為核心，用另一種半導體材料包覆形成核殼結構後，如包覆CdSe/ZnS後，量子產率可提高約50％甚至更高，消光係數數倍增加，能發射很強的螢光，可大大提高檢測靈敏度，十分有利於信號的檢測。
通過修飾量子點的表面結構，可使量子點具有水溶性，能與生物分子結合，不影響生物分子正常的生理功能，通過光致發光被檢測出等特點。故被用於生物分子的標記。目前，已經有商品化的量子點和量子點偶聯物。
生物分析中常用的標記物主要有酶或底物、化學或生物發光體系和螢光物質。早期應用的放射性同位素，其放射性汙染對環境和人體的損害較大。酶免疫分析法，因酶本身容易失活，應用的局限性較大。化學和生物發光分析法，易受外部環境影響，穩定性較差，瞬間化學反應後，樣品的發光無法再現，結果的重現性差。螢光探針，因其有機螢光染料激發光譜窄，發射光譜寬且不對稱，螢光穩定性差，實現多組分同時檢測較困難。
量子點螢光探針。優點是(1)不同粒徑大小的量子點具有不同的顏色，激發量子點的激發波長範圍很寬，且連續分布，所以可以用同一波長的光激發不同大小的量子點。(2)被激發的量子點所發射的螢光譜峰狹窄而對稱，半高峰寬通常只有40nm甚至更小，這樣就允許同時使用不同光譜特徵的量子點，且發射光譜不出現交疊。(3)量子點螢光探針的螢光強度比最常用的羅丹明6G染料高20倍，穩定性是它的100倍以上，可經受反覆多次激發，能夠進行定量檢測。所以，量子點螢光探針是一種理想的應用於分子生物學和生物工程學的超靈敏、多色和多組分檢測的螢光探針。目前，量子點螢光探針已廣泛用於細胞成像、免疫螢光檢測、活體成像等生物學方面的研究。(1)細胞成像。量子點納米晶體用作細胞內的螢光標記物，可進行長時間、多分子同時檢測。可進行從幾分鐘到幾小時長時間細胞內過程的實時監測、跟蹤。可用不同顏色的量子點同時觀測活細胞內或其表面的多個靶分子的生物功能。(2)免疫螢光檢測。將量子點與抗體結合用於螢光免疫分析、檢測。用交聯生物素的量子點對葡萄球菌腸毒素B進行免疫色譜檢測，檢測限最低可達10ng/mL。(3)病理組織檢測。用於病理組織標本的多重標記和分子水平的分析。用於檢測組織切片中的細胞內抗原時，螢光穩定性、靈敏度顯著增強。在分析不同的疾病或相同疾病的不同亞型的分子構像方面作用重大，且可將組織的形態結構同光譜的定量檢測聯繫起來。(4)體內成像。量子點作為螢光探針可追蹤活體，用於活體方面的研究。有試驗將不同的量子點表面經不同的多肽修飾後，注射到小鼠的體內，對活體切片後進行分析。有試驗將磷脂膠囊包覆單個量子點，注入非洲蟾蜍胚胎中，觀察蟾蜍胚胎發育過程。試驗將量子點聚合物注入大鼠體內，於不同的時間剖檢表明，量子點在肝臟、淋巴結、骨髓中至少可以保留1個月。量子點注射24h後，對脾臟、淋巴組織進行切片，證明量子點沒有蓄積在生發中心，而是集中在巨噬細胞的囊泡當中。試驗用QDs作為螢光探針觀察小鼠的淋巴瘤細胞成像，結果證明量子點標記物很穩定並且不會影響細胞活動和功能。(5)微生物學。有將量子點用於大腸桿菌競爭機制的研究。有將量子點用於環境微生物的檢測。
現有量子點標記技術主要存在如下缺點1.用量子點標記生物大分子的方法局限於實驗室研究階段，所用的試劑較為昂貴，無法大規模推廣應用。
2.採用靜電作用和配位作用實現量子點與生物大分子的偶聯，是一種物理吸附。外部環境變化時，量子點與生物大分子很容易脫離，標記率低。例如，緩衝液pH值變化時，即會影響至量子點與生物大分子的偶聯。
3.在水相中用碳二亞胺(EDC)和Sulfo-NHS對量子點進行功能化，然後再對生物大分子進行標記的方法，不僅所的試劑昂貴，而且功能化後的量子點不能長時間保存，易降解。
4.已商品化的用鏈親合素包被量子點的方法，所標記的生物大分子須經生物素化後，才能進行標記。
發明內容
本發明的目的在於提供一種功能化的量子點和其製備方法及用途，其解決了背景技術中標記率低，功能化後的量子點不能長時間保存，及無法大規模推廣應用的技術問題。
本發明的技術解決方案是一種功能化的量子點，其特殊之處在於該功能化量子點的結構式如下 其中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8…。
n＝1，2，3使較多用；n＝4，5，6使用較少，n＝6，7，8…使用更少。
一種上述功能化量子點的方法，其特殊之處在於該方法的實現步驟如下1)對穩定劑中合成的量子點進行預處理(1)在水溶液中加入穩定劑HS-(CH2)nCOOH，合成量子點，得水相合成的量子點；(2)將水相合成的量子點置於離心管中，加入丙酮，使量子點聚集；(3)離心分離，使量子點沉澱於離心管底部；(4)去掉上清，留取沉澱的量子點；(5)再加入水，使量子點微溶，得到經預處理的量子點；2)取離心管，加入有機溶劑，再加入N-羥基琥珀醯亞胺；振蕩，使N-羥基琥珀醯亞胺充分溶解，備用；3)另取離心管，加入有機溶劑，再加入二環己基碳二亞胺，振蕩，使二環己基碳二亞胺充分溶解，備用；4)按溶質比例經預處理的量子點∶N-羥基琥珀醯亞胺∶二環己基碳二亞胺＝1∶1∶1～2，向溶解的N-羥基琥珀醯亞胺中加入經預處理的量子點，同時向液面充入氮氣或惰性氣體；再加入溶解的二環己基碳二亞胺，同時繼續在液面上充入氮氣或惰性氣體；旋緊離心管蓋子，振蕩，得混合反應溶液；5)將混合反應溶液用避光紙包好，在振蕩器上避光反應至少12小時；6)用離心管分裝，置於冷凍真空濃縮儀中抽真空、乾燥，得N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點；7)將裝有N-羥基琥珀醯亞胺酯化量子點的離心管用避光紙包裝，在2-8℃冰箱中避光保存。
上述使量子點微溶加入的水以採用高純水為佳，也可採用雙蒸水、去離子水或純水；穩定劑為HS-(CH2)nCOOH或巰基異丙酸等。
上述有機溶劑可採用乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈等。
上述量子點可以是CdS、CdTe、CdSe或ZnSe及CdSe/CdS或CdSe/ZnS等公知量子點。
上述穩定劑可採用巰基乙酸、巰基丙酸或巰基丁酸等。
上述功能化量子點的用途，其特殊之處在於N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點用於標記帶氨基的生物大分子。
上述帶氨基的生物大分子可為蛋白質或氨基化修飾的核酸、多糖、脂類等。
本發明具有以下優點1.N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點能長期保存，而其化學性質、物理性質不受影響。
2.N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點，具有水溶性，標記生物大分子的方法簡單，標記效率高。
3.用N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點標記蛋白質、氨基化修飾的核酸、多糖、脂類等帶氨基的生物大分子，穩定性好。
4.用N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點標記生物大分子後，量子點的螢光量子產率不受影響。
5.用N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點標記的生物大分子，作為核酸、蛋白質等生物大分子分析檢測中使用的螢光探針，即螢光標示劑，可應用於生物晶片、分子信標等方面。通用性好。
6.生物相容性強，適合於生物分子的標記，但又不影響正常的生理功能。
圖1為本發明功能化量子點的製備原理示意圖。
圖2為本發明功能化的量子點與牛血清白蛋白偶聯的結構圖。
圖3為本發明功能化的量子點與牛血清白蛋白共價偶聯的SDS-PAGE電泳圖。
具體實施例方式
本發明功能化的量子點主要指N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點。本發明以HS-(CH2)nCOOH或巰基異丙酸等為穩定劑，將水溶液中合成的量子點轉到有機溶劑中，在二環己基碳二亞胺(DCC)的作用下，與N-羥基琥珀醯亞胺反應，生成活潑酯衍生物，再與帶氨基的生物大分子上的氨基反應，形成以醯胺鍵共價連接的偶合物，通過光致發光可以檢測出量子點，可用作帶氨基的生物大分子分析檢測中的螢光探針，即螢光標示劑，應用於生物晶片、分子信標等方面。
本發明功能化量子點的結構式如下 其中，n＝1，2，3，4，5，6…n＝1，2，3使較多用；n＝4，5，6使用已較少，n＝6，7，8…使用更少。
本發明功能化量子點被功能化的方法如下1.先對穩定劑中合成的量子點進行預處理1)在水溶液中加入穩定劑HS-(CH2)nCOOH，合成量子點，得水相合成的量子點。
2)將水相合成的量子點400μl置於離心管中，加入丙酮500μl，使量子點聚集。
3)進行離心分離，使量子點沉澱到離心管底部。
4)去掉上清，留取沉澱下來的量子點。
5)再加入高純水50μl，使量子點微溶，得到經預處理的量子點。穩定劑可採用HS-(CH2)nCOOH，其中n＝1、2、3時分別為巰基乙酸、巰基丙酸、巰基丁酸。穩定劑還可採用巰基異丙酸。量子點可以是公知的CdS、CdTe、CdSe、ZnSe及CdSe/CdS、CdSe/ZnS等。
2.取離心管，加入有機溶劑乙酸乙酯5ml，再加入N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)10mg；振蕩，使N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)充分溶解，備用。有機溶劑可採用乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈等。
3.另取50ml離心管，加入有機溶劑乙酸乙酯10ml，再加入二環己基碳二亞胺(DCC)15mg，振蕩，使二環己基碳二亞胺(DCC)充分溶解，備用。有機溶劑可採用乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈等。
4.向溶解的N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)中加入經預處理的量子點，同時向液面充入氮氣或惰性氣體；再加入溶解的二環己基碳二亞胺(DCC)，同時繼續在液面上充入氮氣或惰性氣體5分鐘左右；旋緊離心管蓋子，振蕩，充分混合反應溶液。該反應中，
經預處理的量子點Cd2+∶N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)∶二環己基碳二亞胺(DCC)＝1∶1∶1～2。
液面所充氣體可防反應物被氧化，一般取成本較低且易得的氮氣為宜，也可取氬氣。
5.將混合的反應溶液用錫箔紙包好，在振蕩器上避光反應至少12小時。
6.將15ml經避光振蕩反應的混合反應溶液分為15份，用1.5ml離心管進行分裝，置於冷凍真空濃縮儀中抽真空、乾燥，得到N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點，即功能化的量子點。參見圖1。
7.將裝有N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點的離心管用錫箔紙包裝，在2-8℃冰箱中避光保存。
本發明N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點用於標記帶氨基的生物大分子。帶氨基的生物大分子可以是蛋白質或氨基化修飾的核酸、多糖、脂類等。
圖2所示是用N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點標記牛血清白蛋白BSA，得到cDNA螢光探針。
取製備好的N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點6隻，向6個離心管中分別加入200μl、400μl、600μl、800μl及1000μl的牛血清白蛋白BSA溶液。向各離心管中分別加入硼砂緩衝液，使離心管中反應液體積為1ml。靜置1小時，加入250μl羥氨進行封閉。進行螢光掃描檢測，可以檢測出量子點。
圖3為本發明功能化的量子點與牛血清白蛋白BSA共價偶聯的SDS-PAGE電泳圖。其中，泳道1、8為1mg/mL BSA；泳道2、7為子點與BSA的物理吸附；泳道3、6是用不同量功能化的量子點標記BSA。
用N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點標記氨基化修飾的核酸，標記步驟是將一個化學活性核苷酸類似物，在鏈合成中摻入到螢光探針cDNA的第一鏈中，得到探針。化學活性核苷酸類似物為氨基烯丙基-dUTP或氨基己基-dATP。用N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點進行標記，採用間接cDNA螢光探針標記的方法可以產生高通量、標記均一的cDNA的標記系統，在微陣列實驗中展示了較高的敏感性和重複性。
權利要求
1.一種功能化的量子點，其特徵在於該功能化量子點的結構式如下 其中，n＝1、2、3、4、5、6、7、8…。
2.根據權利要求1所述的功能化量子點，其特徵在於所述功能化量子點的結構式如下 其中，n＝1、2、3、4、5或6。
3.根據權利要求1或2所述的功能化量子點，其特徵在於所述功能化量子點的結構式如下 其中，n＝1、2或3。
4.一種製備權利要求1所述功能化量子點的方法，其特徵在於該方法的實現步驟如下1)對穩定劑中合成的量子點進行預處理(1)在水溶液中加入穩定劑HS-(CH2)nCOOH，合成量子點，得水相合成的量子點；(2)將水相合成的量子點置於離心管中，加入丙酮，使量子點聚集；(3)離心分離，使量子點沉澱於離心管底部；(4)去掉上清，留取沉澱的量子點；(5)再加入水，使量子點微溶，得到經預處理的量子點；2)取離心管，加入有機溶劑，再加入N-羥基琥珀醯亞胺；振蕩，使N-羥基琥珀醯亞胺充分溶解，備用；3)另取離心管，加入有機溶劑，再加入二環已基碳二亞胺，振蕩，使二環已基碳二亞胺充分溶解，備用；4)按比例經預處理的量子點∶N-羥基琥珀醯亞胺∶二環已基碳二亞胺＝1∶1∶1～2，向溶解的N-羥基琥珀醯亞胺中加入經預處理的量子點，同時向液面充入氮氣或惰性氣體；再加入溶解的二環已基碳二亞胺，同時繼續在液面上充入氮氣或惰性氣體；旋緊離心管蓋子，振蕩，得混合反應溶液；5)將混合反應溶液用避光紙包好，在振蕩器上避光反應至少12小時；6)用離心管分裝，置於冷凍真空濃縮儀中抽真空、乾燥，得N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點；7)將裝有N-羥基琥珀醯亞胺酯化量子點的離心管用避光紙包裝，在2-8℃冰箱中避光保存。
5.根據權利要求4所述的製備功能化量子點的方法，其特徵在於所述使量子點微溶加入的水為高純水、雙蒸水或純水；所述的穩定劑為HS-(CH2)nCOOH或巰基異丙酸。
6.根據權利要求4或5所述的製備功能化量子點的方法，其特徵在於所述的有機溶劑為乙酸乙酯、乙酸甲酯或乙腈。
7.根據權利要求6所述的製備功能化量子點的方法，其特徵在於所述的量子點是CdS、CdTe、CdSe或ZnSe及CdSe/CdS或CdSe/ZnS。
8.根據權利要求7所述的製備功能化量子點的方法，其特徵在於所述穩定劑為巰基乙酸、巰基丙酸或巰基丁酸。
9.一種權利要求1所述功能化量子點的用途，其特徵在於N-羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點用於標記帶氨基的生物大分子。
10.根據權利要求9所述的製備功能化量子點的方法，其特徵在於所述的帶氨基的生物大分子為蛋白質或氨基化修飾的核酸、多糖、脂類。
全文摘要
一種功能化的量子點，其實現步驟是對穩定劑中合成的量子點進行預處理；向溶解的N－羥基琥珀醯亞胺中加入經預處理的量子點，再加入溶解的二環己基碳二亞胺，得混合反應溶液；將混合反應溶液用避光紙包好，在振蕩器上避光反應至少12小時；分裝，置於冷凍真空濃縮儀中抽真空、乾燥，得N－羥基琥珀醯亞胺酯化的量子點；本發明解決了背景技術中標記率低、功能化後的量子點不能長時間保存及無法大規模推廣應用的技術問題。本發明功能化的量子點具有水溶性，標記生物大分子的方法簡單，標記效率高；穩定性好，通用性好，能長期保存，且化學、物理性質不受影響。
文檔編號G01N33/533GK1952037SQ200510096210
公開日2007年4月25日 申請日期2005年10月19日 優先權日2005年10月19日
發明者李錚, 陳超, 任挺立, 顏樺 申請人:陝西西大北美基因股份有限公司