山羊頜下腺生物活性物質的提取方法與應用的製作方法

2023-06-03 22:41:21 1

專利名稱：：山羊頜下腺生物活性物質的提取方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物化學醫藥領域，尤其涉及一種山羊頜下腺生物活性物質的提取方法與應用。
背景技術：
：消化道腺體，如頜下腺，十二指腸Brunner腺、胰腺體等器官合成並分泌表皮生長因子(EpidermalGrowthFactor,EGF)，EGF是一種強有力的細胞分裂促進因子。生理狀態下，消化道中EGF的含量較高，對黏膜有保護作用。EGF口服治療胃潰瘍的研究表明了其具有顯著的黏膜保護作用。EGF對胃潰瘍的治療作用的機理為增加胃黏膜血流量，促進黏液糖蛋白合成和分泌，促進巰基化合物合成，也與抑制胃酸有一定關係。Sinha等用EGF灌腸發現其對治療炎症性結腸炎有明顯效果。許多臨床使用的胃黏膜保護藥物，如硫糖鋁等，是通過刺激內源EGF的分泌來起作用的。1952年，美國科學家Cohen最先從小鼠頜下腺提取了EGF。國內外，天然與重組的EGF己應用於角膜、皮膚損傷和胃腸道黏膜癒合的臨床試驗。EGF的研究開發有重要的應用前景和經濟價值。但目前普遍存在著投資大、收益率低等缺陷。EGF的分離純化方法有1972年Savage採用酸抽提、BIO-纖維柱和DEAE-纖維柱分離、純化EGF。1975年Cohen等從預處理的濃縮尿液中分離EGF:使用Bio-Rex70柱吸附、Bio-GelP10柱過濾、SephadexG-75柱過濾、DE-52、CM-52柱層析分離、純化。EGF的在組織中的濃度比較低，需要經過較長時間的分離和純化，才能得到比較純的EGF。已有的工藝比較複雜，純化成本高。與小鼠相比，山羊頜下腺來源豐富，且不必為了提取EGF而大量飼養小鼠，造成巨大浪費。每隻山羊的頜下腺重約6-10g,在和小鼠頜下腺EGF含量大致相同情況下，分離純化後得到的產物遠遠高於小鼠頜下腺。本發明的製作成本低、得率高更適應治療需求。因此，開發山羊頜下腺中的生物活性作用的EGF類產品，具有廣泛的應用前景。
發明內容本發明的目的在於提供一種山羊頜下腺中生物活性物質的提取方法。本發明的另一目的在於提供一種山羊頜下腺中生物活性物質的應用方法。一種山羊頜下腺中生物活性物質的提取方法包括取山羊頜下腺組織勻漿或冷凍乾燥，將勻漿液或含冷凍乾燥粉的溶解液離心，將上清液裝入層析柱多次層析洗脫，檢測出具有生物學活性的、冼脫峰，濃縮乾燥活性峰即得生物活性物質。作為優選，所述的層析柱為陰離子層析柱、陽離子層析柱、凝膠層析柱中的一種或幾種。優選二乙基氨基乙酯Sphacel(diethylaminoethylcellulose,DEAE)層析柱、凝膠葡聚糖凝膠G50(S印hadex)層析柱、二乙基氨基乙酯52(diethylaminoethylcellulose,DE)層析柱、羧甲基纖維素層析柱(Carboxymethylcellulose,CM)等。作為優選，所述的洗脫峰生物學活性檢測方法為酶聯免疫吸附試驗、蛋白電泳試驗、WESTERN試驗、MTT法測定細胞增殖試驗、測定新生小鼠睜眼時間試驗中的一種或幾種。山羊頜下腺生物活性物質的特徵為對動物結腸炎和慢性萎縮性胃炎等模型有治療作用，可實現其對各3種消化道黏膜的保護作用。本發明具有提取方法便捷、高效，提取物生物活性強的優點。具體實施方式一、山羊頜下腺生物活性物質的提取以及活性檢測1、組織樣品的準備從一8(TC低溫冰箱內取新鮮成年浙江白山羊或改良浙江白山羊(l一2周歲)頜下腺4隻，分離附著的組織成分，用眼科剪剪碎，仔細剔除腺體內的血管、神經、結締組織等，加20ml0.05M醋酸，置於碾缽內碾碎，再用勻漿器勻漿數次，以上步驟均在4'C冰上操作。勻漿均勻後將勻槳置於離心管中，低溫離心機50000xg，30min，棄去沉澱，抽取上清液(約10ml)備用。2、DEAESphacel膠梯度洗脫將購置的DEAESphacel膠在20%乙醇中攪拌後，靜置，倒出上層的乙醇。加入0.02M醋酸銨，攪拌均勻，靜置。將製備好的膠上柱。達到平衡後，開始上樣。本次實驗平衡時泵速為1.4ml/min。建立洗脫程序，梯度從100XA液(0.02M醋酸銨)到100XB液(0.2M醋酸銨)，時間為1080min，流速為0.4ml/min，收集器設置為9min1管。UV—280nm檢測圖分析，見數個大峰，前面可能是雜蛋白，故從最大峰後開始共選出相應的94管做ELISA。3、ELISA法測定山羊頜下腺生物活性物質峰洗脫峰收集的94管做ELISA檢測，以0.2M醋酸銨做陰性對照、購買的rhEGF標準品做為陽性對照。抗原包被後，封閉非特異結合位點。抗體結合最後測定吸光度，酶標儀450nm處測定黃色吸光度。表DEAE柱層析後活性峰ELISA測定OD值tableseeoriginaldocumentpage4*與對照組(0.2M醋酸銨)比較P<0.01，△與EGF標準品組比較P<0.01活性峰濃縮液的活性接近EGF標準品。4、透析濃縮ELISA結果顯示，層析圖中，峰2與峰3之間有10餘管的讀數較高，顯示這幾處可能有EGF活性組份(讀數高、和EGF標準品讀數接近為有EGF活性組份的可能)。將與標準品EGF吸光度值接近的這些組份收集在一起，將這些組份合併後進行透析(透析袋分子量為3500)，透析過夜，透析過程在4'C冰箱中進行。脫去鹽分，將透析好的組分分別用甘油(丙三醇)或聚乙二醇(分子量20000)進行濃縮，除去水分。將合併後的組份濃縮到lOml.左右。將透析濃縮後的組份再次進行ELISA實驗，過程同上所述，只是分別取透析濃縮後的組份及0.2M醋酸銨和rhEGF標準品共五孔進行實驗。ELISA實驗結果表明，透析濃縮後組份的OD值與EGF標準品的OD值相近。5、SephadexG50膠洗脫6gSephadexG50幹膠，加入100ml超純水，溶脹2—5小時。平衡後，靜置。上柱，平衡流速，然後將過DEAESphacel柱並且透析、濃縮、經ELISA檢驗有活性的組份用滴管慢慢地加入層析柱上樣。建立洗脫程序，時間為1080min，流速0.8ml/min，收集器每9分鐘收集1管，共120管。洗脫液為超純水。在洗脫的同時開啟記錄軟體記錄280nmOD值及電導。洗脫峰收集的各管組份做ELISA檢測，以高純水做陰性對照、購買的rhEGF標準品做為陽性對照。步驟同上，簡述如下抗原包被—2%脫脂奶粉封閉—結合一抗—結合二抗—與底物作用—酶標儀在652nm處OD值。加1.5M硫酸中止液後其在450nm的OD值。16，17，18，19，20號管與層析圖中的一個洗脫峰正好相對應，因此該峰即為活性峰。表羊頜下腺EGF活性洗脫峰的OD值tableseeoriginaldocumentpage5*與對照組(高純水)比較P〈0.01，A與EGF標準品組比較P〈0.05活性峰濃縮液的活性與EGF標準品相近。6、山羊頜下腺生物活性物質SDS-PAGE電泳SDS-PAGE是對蛋白質進行量化，比較及特性鑑定的一種經濟、快速、而且可重複的方法。該法主要依據蛋白質的分子量對其進行分離。取純化好的山羊頜下腺山羊頜下腺生物活性物質原液30nl，加入5xSDS蛋白上樣緩衝液6m(比例5:1)置於一個Eppendorf管中混合震蕩混勻，100'C加熱3—5分鐘，使蛋白變性。加樣，第一泳道為蛋白Marker,4、5泳道分別為兩次DEAESphace柱陰離子層析並經活性檢測的組份，第6泳道為SephadexG50過濾柱層析並經活性檢測的組份。電泳後，考馬斯亮藍染色。結果顯示，DEAESphacel柱陰離子層析，並經ELISA法檢測後得到的組份，在6.5、10、15、18kD處有蛋白條帶。SephadexG50過濾柱層析，並經ELISA法檢測後得到的組份，在6.5、10、15處有蛋白條帶。7、山羊頜下腺生物活性物質的濃度測定將經DEAESphace柱陰離子層析和SephadexG50過濾柱層析，並且透析、濃縮的組份命名為Sample進行蛋白含量測定。測定方法採用FoIin酚法。釆用96孔酶標板，製作標準曲線，測定樣品蛋白含量。8、山羊頜下腺生物活性物質對人胚胎羊膜細胞增殖的影響對細胞形態學的影響光學顯微鏡下觀察山羊頜下腺生物活性物質刺激組和對照組細胞生長形態學變化。MTT法測定細胞增殖率。細胞增殖率氣實驗組^值一對照組J值)/對照組」值X100%。重複實驗3次。表山羊頜下腺生物活性物質促人胚胎羊膜細胞增殖的作用(義±S)tableseeoriginaldocumentpage5:50051.377±0.146*A#39.4%1:100051.234±0.087*24.9%艦GF組_10|ig/L5_1.389±0.179*_40.6%_*與對照組比較屍〈0.01，A與(1:100)組比較P〈0.01,#與(1:1000)組比較戶<0.05活性物質1500稀釋度組的促人胚胎羊膜細胞增殖的作用與EGF標準品相近。9、山羊頜下腺生物活性物質對細胞增殖過程中DNA含量、細胞周期變化的影響利用流式細胞儀可以對處於快速、直線、流動狀態中的單細胞進行多參數、快速定量分析以及能同時對特定群體加以分選的特點，主要測定山羊頜下腺生物活性物質在細胞增殖過程中對DNA含量與細胞周期變化的影響。人胚胎羊膜細胞以含10%新生牛血清的MEM培養基在37'C及5%C02的溼化培養箱中進行培養,隔天傳代加入山羊頜下腺生物活性物質和重組人EGF(10ng/L)。細胞處理，上機檢測，專用軟體分析處理。_表山羊頜下腺生物活性物質對人胚胎羊膜細胞周期時相的影響組別G0/G1SG2/M對照71.1±1.918.8±1.410.1±1.3頜下腺生物活性物質組60.3±2.2*25.8±1.1*13.9±1.8*_艦GF_57.8±2.1*_26.4±1.9*15.8±1.7*_*與對照組比較P〈0.01山羊頜下腺生物活性物質對人胚胎羊膜細胞周期時相的影響與rhEGF相似。二、山羊頜下腺生物活性物質對消化道黏膜保護作用的驗證大鼠結腸炎模型1、建模健康、性成熟、清潔級SD大鼠，雄性，體重(250±28)g，由浙江大學醫學院動物實驗中心提供。架式籠養，自由食用全價營養飼料，每日晨8時清籠，飼養溫度為20士rC，溼度5060%，光照每12小時明暗交替，通風815次/小時。大鼠適應性餵養一周後，隨機分為3組，即單純造模組、生理鹽水治療對照組及山羊頜下腺生物活性物質治療組。每組IO只。大鼠禁食24小時後用7X乙酸2ml經自製聚乙烯灌腸器(直徑約2mm)灌腸，灌腸器插入深度為距肛緣8cm,倒提大鼠準確定時15秒後，再在同一深度經灌腸器用生理鹽水5ml衝洗一次，24小時後即成模。2、給藥山羊頜下腺生物活性物質治療組，在模型建立後每日晨起空腹用山羊頜下腺生物活性物質270嗎/次/只，用生理鹽水2ml溶化後灌腸，療程7天。生理鹽水治療對照組模型建立後，每日早晨進食前，予生理鹽水2ml灌腸。模型組，造模後不灌腸飼養7天。3、指標觀察3.1大鼠一般情況在飼養過程中大鼠的精神狀態，活動情況，毛髮光澤度，食慾，大便情況(血便、腹瀉、大便次數增多等)，體重等。3.2山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織黏膜損傷的影響所有實驗動物給藥灌腸7天後，禁食不禁水24小時，乙醚麻醉處死，剖腹暴露全腸，在距肛門8cm處離斷，取出腸段，沿腸繫膜剪開並用生理鹽水衝洗乾淨後，將腸黏膜平鋪於泡沫板上，用大頭針固定，肉眼觀察腸黏膜的病理改變，計算黏膜損傷指數，並用數位相機攝片。大鼠結腸黏膜肉眼評分標準:_分數肉眼觀察_0分無損傷，無充血水腫，表面光滑，無糜爛或潰瘍l分黏膜充血、水腫,表面光滑，無糜爛或潰瘍2分黏膜充血、水腫，黏膜粗糙，呈顆粒樣，輕度糜爛，無潰瘍3分黏膜充血、水腫，中度糜爛有單個潰瘍4分黏膜充血、水腫，高度糜爛，有多處潰瘍5分黏膜充血、水腫，重度糜爛，有〉lcm潰瘍3J山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織黏膜組織病理損傷的影響計算黏膜損傷並攝片後的腸組織立即用10%的中性甲醛溶液固定，石蠟包埋，每份蠟塊切成厚度為5nm的切片HE染色，鏡下評價黏膜損傷指數。大鼠結腸炎的判定標準低倍鏡下取IO個視野，按炎症細胞侵潤的程度分成O、1、2、3四個級別。大鼠結腸組織病理評分標準分為上皮及腺體的破壞_0分正常1分上皮局部破壞2分上皮帶狀破壞或帶狀隱窩消失3分_彌散和/或黏膜潰瘍累及黏膜下和/或隱窩缺失腺隱窩擴張_0分正常1分局灶2分條狀3分__杯狀細胞耗竭及缺失_0分無1分輕度耗竭2分條狀或中度耗竭3分_彌散或完全耗竭_炎性細胞浸潤0分無l分局限於上皮下，固有層或隱窩基層2分浸潤黏膜基層3分_嚴重廣泛浸潤達黏膜下和/或累及固有基層水腫_0分無l分局灶2分帶狀或/和中度彌散3分_廣泛及嚴重_血管充血_0分無1分局灶2分條狀3分，_^_隱窩膿腫_0分無l分局灶2分條狀3分__萎縮_0分無l分局灶2分條狀3分彌散_3.4山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織中髓過氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)的影響取大鼠腸組織300mg稱重，於小燒杯中加磷酸緩沖溶液2.0ml，剪刀剪碎，轉移至試管中，於組織勻漿儀上勻漿10秒，4°C，4000rpm離心15min，棄上清液，按50mg(組織)/lml比例加入十六烷基三甲基溴化胺(HexadecyltrimethylanunoniumBromide,HTAB)溶液，勻漿30秒，超聲勻漿10秒。4°C，4000rpm離心15min。取上清液0.1ml加O-dianisidine溶液(含0.0005%H202)2.9ml，在460nrn處測定3min，計算每分鐘吸光度的變化(△A460nmmin")。MPO活性單位(U)定義為25'C時每分鐘分解1pmol過氧化物的量。lumol過氧化物H2(h的吸光度改變為0.13xl0力min,0.1ml樣品單位組織的酶活性為MPO(x103U)ng-'組織二AA柳咖.min力U3xlO-2)/5。4、實驗結果4.1大鼠一般情況造模組大鼠在灌腸後第15~24h起出現腹瀉，表現為黃色或血性稀便和/或肛周體毛被稀便沾染，精神萎靡，喜拱背扎堆，活動量少，食慾減退，毛髮欠光澤，體重增長較慢等。生理鹽水對照組生理鹽水灌腸後一直有稀便，肛周體毛不潔，精神差，活動少，食慾差，類似於造模組。山羊頜下腺生物活性物質治療組在山羊頜下腺生物活性物質灌腸後，稀便於第三天開始好轉，肛周體毛逐漸變乾淨，精神狀況好轉，食慾好轉，毛髮光澤度好轉，體重增加。4.2山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織黏膜損傷的影響造模組全部大鼠24h成模後均可見潰瘍多而大、嚴重充血水腫、糜爛出血點、穿孔腸粘連等。生理鹽水對照組亦可見潰瘍多而大、充血水腫、糜爛出血點、穿孔等。山羊頜下腺生物活性物質治療組在第一天有l只大鼠腸穿孔死亡，剩餘9隻治療後見有個別小潰瘍、充血水腫、糜爛出血較上述兩組明顯好轉，未見穿孔。表山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織黏膜損傷的影響(；±s)組別動物數組織損傷積分模型對照組104,20±0.92空白對照組102.70±1.06山羊頜下腺生物活性物質組90.67±1.00**與模型組比較？<0.01J與生理鹽水對照組比較P^0.054.3山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織黏膜組織病理損傷的影響造模組大鼠結腸黏膜可見黏膜上皮脫落、糜爛、炎症可累及腸壁全層，主要表現為中性粒細胞浸潤，亦可見數量不等的巨噬細胞和嗜酸性細胞，增生的纖維母細胞，潰瘍周圍可見隱窩變形。腺體增生，排列紊亂。肉芽組織增生，杯狀細胞減少。黏膜及黏膜下充血、水腫及典型潰瘍病形成。生理鹽水對照組黏膜充血水腫，可見典型潰瘍，腺體增生，杯狀細胞減少，炎症細胞浸潤，腺隱窩擴張及隱窩膿胂。山羊頜下腺生物活性物質組結腸黏膜可見潰瘍修復跡象，如潰瘍邊緣上皮修復，肉芽組織形成。表山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織黏膜組織病理損傷的影響(S士力組別動物數組織損傷積分模型對照組1015.80±3.82空白對照組109.卯±1.85山羊頜下腺生物活性物質組96.67±2.29**與模型組比較？<0.01,*與生理鹽水對照組比較？<0.054.4山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織中MPO的影響表山羊頜下腺生物活性物質對結腸炎大鼠腸組織中MPO的影響組別動物數MPO(Ung-1組織)模型對照組io2.16±0.39空白對照組101.93±0.639山羊頜下腺生物活性物質組9_0.97±0.12**與模型組比較P<0.01，*與生理鹽水對照組比較P<0.01人鼠慢性萎縮性胃炎模型1、建模0.1%氨水作為每日飲用水自由飲用；20mmd/L脫氧膽酸鈉每日灌胃，每次2ml;60°/。酒精每周空腹灌胃2次，每次2ml。上述處理24周後完成大鼠慢性萎縮性胃炎模型。2、給藥將體重相近的大鼠隨機分為3組，每組10隻。每天皮下注射rhEGF或山羊頜下腺生物活性物質，濃度為10嗎/kg,對照組以相同容積的生理鹽水皮下注射，共12周。另有IO只大鼠不建立慢性萎縮性胃炎模型，給予正常食物和水。3、指標觀察大滑鼠本製備及病理組織學檢査給藥12周後處死大鼠，距賁門和幽門1.5cm處離斷胃組織，沿大彎切開，觀察胃黏膜的色澤、彈性、皺襞情況。以10%的中性甲醛同定，分別沿小彎側和大彎側條狀取材，作病理切片，行HE染色作組織學檢查。採用免疫組織化學染色法胃黏膜腺體增殖細胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA)表達測定，以PBS置換一抗為陰性對照。PCNA以細胞核內出現明顯的棕褐色顆粒為陽性。觀察每一標本的胃竇5個完整腺體，應用測微器測定每個腺體PCNA陽性表達的寬度(單位m)，取其平均值。每張切片同時觀察有無腸上皮化生、假性幽門腺化生、不典型增生、腺瘤、類癌、腺癌發生情況。4、實驗結果山羊頜下腺生物活性物質對慢性萎縮性胃炎大鼠組織大體觀的影響對照組大鼠的胃壁彈性減弱，黏膜層變薄，皺襞變平，可見不同程度的陳舊性出血點；山羊頜下腺生物活性物質治療組大鼠胃黏膜有光澤，黏液較多，胃壁彈性較好，但和正常大鼠胃黏膜比較有不同程度的胃壁彈性降低，黏膜層變薄。山羊頜下腺生物活性物質對慢性萎縮性胃炎大鼠組織病理的影響山羊頜下腺生物活性物質治療組大鼠的胃竇腺體排列整齊規則，極少見到炎性細胞，無出血、腸化等現象，接近正常大鼠的表現；而對照組大鼠的胃竇腺體有不同程度的排列紊亂、稀疏，伴有腺體囊樣擴張，黏膜肌層增厚，部分可見炎性細胞聚集灶。山羊頜下腺生物活性物質對慢性萎縮性胃炎大鼠胃竇黏膜PCNA表達的影響rhEGF組、山羊頜下腺生物活性物質組的PCNA陽性表達分別為(77.70士4.16)nm和(75.60土2.92)pm，較對照組(54.40土4.54)jim明顯增加(PO.01);而兩治療組間差異無統計學意義。權利要求1、一種山羊頜下腺中生物活性物質的提取方法，其特徵在於包括如下步驟(1)、取山羊頜下腺組織勻漿或冷凍乾燥，將勻漿液或含冷凍乾燥粉的溶解液離心，取上清；(2)、將上清液裝入層析柱進行層析洗脫，並檢測具有生物學活性的洗脫峰；(3)、合併活性峰並濃縮；(4)、濃縮液過層析柱，洗脫液經生物學活性檢驗後，濃縮乾燥活性峰即得。2、根據權利要求l所述的提取、純化方法，其特徵在於所述的層析柱為陰離子層析柱、陽離子層析柱、凝膠層析柱中的一種或幾種。優選二乙基氨基乙酯Sphacel(diethylaminoethylcellulose,DEAE)層析柱、凝膠葡聚糖凝膠G50(S叩hadex)層析柱、二乙基氨基乙酯52(diethylaminoethylcellulose,DE)層析柱、羧甲基纖維素層析柱(Carboxymethylcellulose,CM)等。3、根據權利要求1所述的提取、純化方法，其特徵在於所述的洗脫峰生物學活性檢測方法為酶聯免疫吸附試驗、蛋白電泳試驗、WESTERN試驗、MTT法測定細胞增殖試驗、測定新生小鼠睜眼時間試驗中的一種或幾種。4、山羊頜下腺生物活性物質的特徵為對動物結腸炎和慢性萎縮性胃炎等模型有治療作用，可實現其對於各種消化道黏膜的保護作用。全文摘要本發明涉及一種山羊頜下腺中生物活性物質的提取方法與應用。取山羊頜下腺組織勻漿或冷凍乾燥，將勻漿液或含冷凍乾燥粉的溶解液離心，將上清液裝入層析柱多次層析洗脫，檢測出具有生物學活性的洗脫峰，濃縮乾燥活性峰即得生物活性物質。山羊頜下腺生物活性物質的特徵為對動物結腸炎和慢性萎縮性胃炎等模型有治療作用，可實現其對各種消化道黏膜的保護作用。本發明具有提取方法便捷、高效，提取物生物活性強的優點。文檔編號C07K14/435GK101317857SQ20071006912公開日2008年12月10日申請日期2007年6月5日優先權日2007年6月5日發明者姒健敏,徐立紅,王良靜,翁登坡,袁慶豐,趙曉燕,陳淑潔申請人:浙江大學;杭州博通胃腸病診治技術有限公司