Il-6結合分子的製作方法
2023-06-03 21:35:11 2
Il-6結合分子的製作方法
【專利摘要】本發明提供了結合分子(例如抗體或其抗原結合片段)，其特異性結合於IL-6(例如人類，小鼠或非人靈長類IL-6)並抑制其生物活性。在一個優選的實施方案中，本發明的抗體或抗原結合片段結合於IL-6並抑制其對IL-6受體的結合。此類抗體或抗原結合片段對於治療IL-6相關的疾病或病症(例如炎性疾病和癌症)特別有用。
【專利說明】IL-6結合分子
[0001]相關申請
[0002]本申請要求2012年5月23日提交的美國臨時申請系列號61/650，883、2012年10月30日提交的美國臨時申請系列號61/720，102和2012年11月14日提交的PCT/IB2012/056424的優先權，均通過全文提述併入本文。
[0003]發明背景
[0004]白介素-6 (IL-6)是主要的促炎症細胞因子。其導致免疫活性細胞和造血細胞的增殖和分化。人IL-6是由212個胺基酸組成的單一糖蛋白，其具有兩個N-連接的糖基化位點，並具有約26kDa的分子量。IL-6的結構包含四個α-螺旋域，所述域具有四個半胱氨酸殘基的基序，這對於IL-6的三級結構是必需的。IL-6信號傳導由IL-6對於可溶性或表面結合的IL-6受體α鏈(IL-6Ra)的結合介導，所述結合使得該複合物能夠與細胞表面跨膜gpl30亞基相互作用，所述亞基介導胞內信號傳導。
[0005]IL-6涉及炎性疾病的疾病發生，所述炎性疾病包括炎性自身免疫病如類風溼性關節炎(RA)，脊椎強直性關節病，系統性紅斑狼瘡(SLE)，炎性腸病(IBD)，和Castleman病。IL-6亦涉及癌症的疾病發生，所述癌包括前列腺癌，彌散性大細胞淋巴瘤，多發性骨髓瘤，和腎細胞癌。亦報導了 IL-6在促進癌症相關的食慾缺乏(anorexia)，口腔黏膜炎和惡病質中的作用。
[0006]儘管本領域中已知來源於對非人動物的免疫接種的IL-6結合分子，但這些分子通常需要大量的抗體工程(例如CDR移植和人源化)以減少其免疫原性。而且，所得的人源化變體通常受對IL-6靶的不理想的結合親和力困擾，並需要大量的抗體工程和親和力成熟以試圖恢復IL-6結合親和力。其最終結果是大多數IL-6抗體呈現對IL-6靶的不理想的結合親和力。
[0007]因此，考慮到IL-6在疾病發生中的重要性和已知的IL-6抗體的缺點，顯然在本領域中有對於改善的(例如幾乎未經工程改造的)IL-6藥劑的需要，所述藥劑可抑制IL-6的生物活性，並因此治療與IL-6活性相關的疾病。
[0008]發明概述
[0009]本發明通過提供結合分子(例如抗體或其抗原結合片段)來改善現有技術，所述結合分子具有改善的結合概貌，即以高結合親和力(例如皮摩爾結合親和力)特異性結合於IL-6(例如人或非人靈長類IL-6)並強力地抑制其生物活性(例如結合於IL-6受體)。在某些示例性實施方案中，本發明的IL-6結合分子來源於經受用IL-6抗原的主動免疫接種的駝類物種(例如美洲駝)的常規抗體全集。例如，本發明的駝類來源的IL-6結合分子可包含成對的VH/VL域或其它備選框架，其中VH或VL域的一個或多個超變環(hypervariable loop)(例如H1,H2,H3,L1,L2和/或L3)來源於所述騎類物種。而且,在某些實施方案中，至少所述超變環之一採取規範摺疊(或規範摺疊的組合)，其與人類抗體的摺疊相同或實質上相同。此類結合分子呈現高的人類同源性(序列和結構)並因此由於其低免疫原性而特別有用於治療IL-6相關的疾病或病症(例如炎性疾病和癌症)。令人驚訝的是，本發明的IL-6抗體呈現高結合親和力，可製造性(manufacturability)和熱穩定性，而無需已知IL-6抗體通常所需的大量和耗時的抗體工程和親和力成熟。
[0010]因此，在一個方面，本發明提供特異性結合於IL-6的結合分子，所述結合分子包含至少一個抗體⑶R，其中所述⑶R包含至少一個當所述結合分子結合於IL-6時埋在IL-6的F229空穴或F279空穴中的胺基酸殘基。在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，所述VH域具有根據Kabat在98位的胺基酸，其當所述抗體或片段結合於IL-6時，埋在IL-6的F229空穴中。在一個具體實施方案中，在98位的胺基酸是色氨酸。在某些實施方案中，所述結合分子包含VL域，所述VL域具有根據Kabat在30位的胺基酸，其當所述抗體或片段結合於IL-6時，埋在IL-6的F229空穴中。在一個具體實施方案中，在30位的胺基酸是酪氨酸，在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，所述VH域具有根據Kabat在99位的胺基酸，其當所述抗體或片段結合於IL-6時，埋在IL-6的F279空穴中。在一個具體實施方案中，在99位的胺基酸是纈氨酸。
[0011 ] 在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域和VL域，所述VH域包含超變環Hl，H2和H3，其中所述VH域多肽與VL域配對，所述VL域包含超變環LI，L2和L3，其中超變環H1-H3和L1-L3至少之一通過用IL-6抗原對羊駝屬(Lama)物種進行免疫接種而從該羊駝屬物種的常規抗體獲得。在一個具體實施方案中，超變環Hl，H2，LI，L2和L3的至少之一呈現預測的或實際的相應規範摺疊結構，其與人抗體中出現的Hl，H2，LI，L2或L3超變環的規範摺疊結構相同或實質上相同。在一個具體實施方案中，超變環Hl和H2的至少之一各呈現預測的或實際的規範摺疊結構，其與相應的人類規範摺疊結構相同或實質上相同。在一個具體實施方案中，超變環LI，L2和L3的至少之一各呈現預測的或實際的規範摺疊結構，其與相應的人類規範摺疊結構相同或實質上相同。在一個具體實施方案中，超變環Hl和H2的至少之一形成預測的或實際的規範摺疊結構的組合，其與已知出現於人類種系VH域的規範摺疊結構的相應的組合相同或實質上相同。在一個具體實施方案中，超變環Hl和H2的至少之一形成規範摺疊結構的組合，其對應於選自下組的人類規範摺疊結構的組合:1-1，1-2，1-3，1-4 ，1-6，2-1，3-1和3_5。在一個具體實施方案中，超變環LI和L2的至少之一形成預測的或實際的規範摺疊結構的組合，其與已知出現於人類種系VL域的規範摺疊結構的相應的組合相同或實質上相同。在一個具體實施方案中，超變環LI和L2的至少之一形成規範摺疊結構的組合，其對應於選自下組的人類規範摺疊結構的組合:11_7，13-7 (A, B, C)，14-7(A, B),12-11,14-11,12-12,2-1,3-1，4-1和 6-1。
[0012]在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域和VL域，其中所述結合分子的VH域和/或VL域與一個或多個對應人類VH或VL域在框架區FR1，FR2，FR3和FR4內具有90%或更高的序列同一性。在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域和VL域，且為親本結合分子的種系化變體，其中所述結合分子的VH域和VL域之一或兩者與親本非人類抗體的對應VH域和VL域相比，在框架區內包含總共I至10個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述親本結合分子是常規的駝類抗體。在某些實施方案中，所述結合分子是抗體或其抗原結合片段。
[0013]在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ IDno:500[X1PdvvtgfhydX2]中列出的hcdr3胺基酸序列，或其序列變體，其中:
[0014]X1是任何胺基酸，優選D或Y ;
[0015]X2是任何胺基酸，優選Y或N ;和[0016]其中所述序列變體在所述序列中包含一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，HCDR3胺基酸序列選自下組:SEQ ID N0:497_499。
[0017]在某些實施方案中，所述VH域進一步包含SEQ ID NO: 507 [VIXJXADTYYSPSUQS]中列出的HCDR2胺基酸序列或其序列變體，其中:
[0018]Xl是任何胺基酸，優選D，Y或N ;
[0019]X2是任何胺基酸，優選D或E ;
[0020]X3是任何胺基酸，優選A或G ;
[0021 ] X4是任何胺基酸，優選E或K ;和
[0022]其中所述序列變體在所述序列中包含一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，HCDR2胺基酸序列選自下組:SEQ ID NO: 501-506。
[0023]在某些實施方案中，所述VH域進一步包含在SEQ ID NO: 512 [X1X2YYX3WX4]中列出的HCDRl胺基酸序列，或其序列變體，其中:
[0024]Xl是任何胺基酸，優選T，S或P ;
[0025]X2是任何胺基酸，優選R或S ;
[0026]X3是任何胺基酸，優選A或V ;
[0027]X4是任何胺基酸，優`選S或T ;和
[0028]其中所述序列變體在所述序列中包含一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述HCDRl胺基酸序列選自下組:SEQ ID N0:508_511。
[0029]在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ ID NO: 497，501和508中分別列出的HCDR3，HCDR2和HCDRl胺基酸序列。
[0030]在某些實施方案中，所述結合分子進一步包含VL域，其中所述VL域包含SEQ IDNO: 524 [ASYX1X2X3X4X5X6X7]中列出的IXDR3胺基酸序列，或其序列變體，其中:
[0031]Xl是任何胺基酸，優選R或K ;
[0032]X2是任何胺基酸，優選N，H，R，S，D，T或Y ;
[0033]X3是任何胺基酸，優選F，Y，T，S或R ;
[0034]X4是任何胺基酸，優選N或I ;
[0035]X5是任何胺基酸，優選N或D ;
[0036]X6是任何胺基酸，優選V，N，G或A ;
[0037]X7是任何胺基酸，優選V或I ;和
[0038]其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述LCDR3胺基酸序列選自下組:SEQ ID NO: 513-523.[0039]在某些實施方案中，所述VL域進一步包含SEQ ID NO:535[X1VX2X3RX4S]中列出的LCDR2胺基酸序列，或其序列變體，其中:
[0040]Xl是任何胺基酸，優選R，K，D，A或E ;
[0041]X2是任何胺基酸，優選S，N或T ;
[0042]X3是任何胺基酸，優選T，K或Y ;
[0043]X4是任何胺基酸，優選A，T或V ;和
[0044]其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述LCDR2胺基酸序列選自下組:SEQ ID N0:525_534。[0045]在某些實施方案中，所述VL域進一步包含SEQ ID NO: 542 [AGX1X2X3DX4GX5X6X7YVs]中列出的LCDRl胺基酸序列，或其序列變體，
[0046]其中
[0047]Xl是任何胺基酸，優選A或T ;
[0048]X2是任何胺基酸，優選S或N ;
[0049]X3是任何胺基酸，優選S，E或N ;
[0050]X4是任何胺基酸，優選V或I ;
[0051]X5是任何胺基酸，優選G，Y，T或F ;
[0052]X6是任何胺基酸，優選G或Y ;
[0053]X7是任何胺基酸，優選N，D或A ;和
[0054]其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述IXDRl胺基酸序列選自下組:SEQ ID N0:538_541。在某些實施方案中，所述結合分子包含VL域，所述VL域包含SEQ ID NO: 513，525和536中分別列出的LCDR3，IXDR2和IXDRl胺基酸序列。在某些實施方案中，所述結合分子包含:VH域，其具有SEQ IDNO: 497，501和508中分別列出的HCDR3，HCDR2和HCDRl胺基酸序列；和VL域，其具有SEQID N0:513,525和536中分別列出的LCDR3，LCDR2和LCDRl胺基酸序列。在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，其與SEQ ID NO: 152中列出的胺基酸序列具有至少85%序列同一性。在 某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，其胺基酸序列選自下組:SEQ IDNO: 127-232和569-571。在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，其胺基酸序列為SEQID NO: 152。在某些實施方案中，所述結合分子包含VL域，其與SEQ ID N0:416中列出的胺基酸序列具有至少85%序列同一性。在某些實施方案中，所述結合分子包含VL域，其胺基酸序列選自下組:SEQ ID N0:391-496。在某些實施方案中，所述結合分子包含VL域，其胺基酸序列為SEQ ID N0:416。在某些實施方案中，所述結合分子包含:VH域，其具有SEQ IDNO: 152中列出的胺基酸序列；和VL域，其具有SEQ ID NO:中416列出的胺基酸序列。
[0055]在某些實施方案中，所述結合分子包含所述Hl和H2環，其形成規範摺疊結構的組合，所述組合對應於見於人類IACY抗體結構中的人類規範摺疊結構的組合3-1。在某些實施方案中，所述結合分子包含所述LI和L2環，其形成規範摺疊結構的組合，所述組合對應於見於人類3MUG抗體結構中的人類規範摺疊結構的組合6 λ -1。在某些實施方案中，所述結合分子包含所述LI，L2和L3環，其形成規範摺疊結構的組合，所述組合對應於見於人類3MUG抗體結構中的人類規範摺疊結構的組合6 λ -1-5。
[0056]在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，所述VH域包含SEQ IDNO:544[RAGX1GX2G]中列出的HCDR3胺基酸序列，或其序列變體，其中:
[0057]X1是任何胺基酸，優選W ；
[0058]X2是任何胺基酸，優選M，A，L，S或N ;和
[0059]其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述HCDR3胺基酸序列選自下組:SEQ ID NO:543, SEQ ID NO:566, SEQ IDNO:567 和 SEQ ID NO:568。
[0060]在某些實施方案中，所述VH域進一步包含SEQ IDNO:554[X1Isx2X3Gx4SX5X6YX7DSVKG]中列出的HCDR2胺基酸序列，或其序列變體，其中:[0061]Xl是任何胺基酸，優選A，P或R ;
[0062]X2是任何胺基酸，優選A或S ;
[0063]X3是任何胺基酸，優選S或G ;
[0064]X4是任何胺基酸，優選G或V ;
[0065]X5是任何胺基酸，優選A或T ;
[0066]X6是任何胺基酸，優選Y，N或S ;
[0067]X7是任何胺基酸，優選G，A或T ;和
[0068]其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述HCDR2胺基酸序列選自下組:SEQ ID N0:545_553。
[0069]在某些實施方案中，所述VH域進一步包含SEQ ID NO:562[X1X2X3X4X5]中列出的HCDRl胺基酸序列，或其序列變體，其中:
[0070]Xl是任何胺基酸，優選S或T ;
[0071]X2是任何胺基酸，優選H或Y ;
[0072]X3是任何胺基酸，優選A或R ;
[0073]X4是任何胺基酸，優`選M或L ;
[0074]X5是任何胺基酸，優選S或Y ;和
[0075]其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在一個具體實施方案中，所述HCDRl胺基酸序列選自下組:SEQ ID N0:555_561。
[0076]在某些實施方案中，所述VH域包含HCDR3，其具有選自下組的胺基酸序列:SEQ IDNO: 543，566，567和568，和包含分別在SEQ ID NO: 545和555中列出的HCDR2和HCDRl胺基酸序列。在某些實施方案中，所述結合分子進一步包含VL域，其中所述VL域包含SEQ IDNO: 563中列出的LCDR3胺基酸序列，或其序列變體，其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在某些實施方案中，所述VL域進一步包含SEQ ID N0:564中列出的LCDR2胺基酸序列，或其序列變體，其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在某些實施方案中，所述VL域進一步包含SEQ ID NO:565中列出的IXDRl胺基酸序列，或其序列變體，其中所述序列變體包含所述序列的一個，兩個或三個胺基酸取代。在某些實施方案中，所述VL域包含分別在SEQ ID NO: 563，564和565中列出的LCDR3，IXDR2和IXDRl胺基酸序列。在某些實施方案中，所述結合分子包含:VH域，其具有分別在SEQ ID NO: 544，545和555中列出的HCDR3，HCDR2和HCDRl胺基酸序列；和VL域，其具有分別在SEQ ID勵:563，564和565中列出的1^0?3，1^0)1?2和1^0)1?1胺基酸序列。在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，其與SEQ ID N0:86中列出的胺基酸序列具有至少85%序列同一性。在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，其具有的胺基酸序列選自下組:SEQ ID NO: 39-126和569-571。在某些實施方案中，所述結合分子包含VH域，其具有的胺基酸序列選自 SEQ ID NO:86，SEQ ID NO:569，SEQ ID NO:570 和 SEQ ID NO:571。在某些實施方案中，所述結合分子包含VL域，其與SEQ ID NO:350中列出的胺基酸序列具有至少85%序列同一'丨生。在某些實施方案中,所述結合分子包含VL域,其具有的胺基酸序列選自下組:SEQ ID NO:303-390。在某些實施方案中，所述結合分子包含VL域，其具有的胺基酸序列為SEQ ID NO: 350。在某些實施方案中，所述結合分子包含:VH域，其具有SEQ ID N0:86,SEQ ID NO:569, SEQ ID NO:570或SEQ ID NO:571中列出的胺基酸序列JPVL域，其具有SEQ ID NO:350中列出的胺基酸序列。
[0077]在某些實施方案中，所述結合分子包含Hl和H2環，其形成規範摺疊結構的組合，所述組合對應於見於人類IDFB抗體結構中的人類規範摺疊結構的組合1-3。在某些實施方案中，所述結合分子包含LI和L2環，其形成規範摺疊結構的組合，所述組合對應於見於人類IMFA抗體結構中的人類規範摺疊結構的組合7 λ-1。在某些實施方案中，所述結合分子包含L1，L2和L3環，其形成規範摺疊結構的組合，所述組合對應於見於人類3MUG抗體結構中的人類規範摺疊結構的組合7 λ -1-4。 [0078]在某些實施方案中，所述結合分子是Fab片段，其以低於2110_5^的解離速率(0ff-rate)(通過表面等離子共振測量的kf)結合於人類IL-6。在某些實施方案中，所述結合分子以亞皮摩爾結合親和力結合於人類IL-6抗原。在某些實施方案中，所述結合分子以單數位飛摩爾的結合親和力結合於人類IL-6抗原。在某些實施方案中，所述結合分子包含超變環，其從羊駝屬的常規抗體無需後續親和力成熟而獲得。在某些實施方案中，所述結合分子以少於0.1pM的IC50抑制IL-6誘導的B9雜交瘤細胞的增殖。
[0079]在某些實施方案中，所述結合分子呈現大於65°C的熔解溫度(Tm)。在某些實施方案中，所述結合分子是親本駝類抗體的種系化變體，所述種系化變體與所述親本駝類抗體相比具有更高的熔解溫度。在某些實施方案中，所述結合分子在HEK293細胞中瞬時表達後以至少20mg/ml的水平表達。在某些實施方案中，所述結合分子表徵為低於約10.0，例如低
於約6.0的EpiBase?評分。在某些實施方案中，所述結合分子抑制IL-6對IL-6受體的
結合。在某些實施方案中，所述結合分子抑制gpl30對IL-6受體的結合。在某些實施方案中，所述結合分子特異性結合於人類和食蟹猴IL-6。在某些實施方案中，所述結合分子包含至少一個來自特異性結合於IL-6的駝類抗體的⑶R。
[0080]在另一個方面，本發明提供了藥物組合物，其包含任何前述權利要求的結合分子，和一種或多種藥學上可接受的載體。
[0081]在另一個方面，本發明提供了治療IL-6相關疾病或病症的方法，其包括向需要該治療的受試者施用有效量的本發明的藥物組合物。
[0082]在另一個方面，本發明提供了分離的核酸，其編碼本文中公開的結合分子。
[0083]在另一個方面，本發明提供了重組表達載體，其包含本發明的核酸分子。
[0084]在另一個方面，本發明提供了宿主細胞，其包含本發明的重組表達載體。
[0085]附圖簡述
[0086]圖1描述了測量本發明的抗體的體外IL-6中和活性的細胞增殖測定的結果。
[0087]圖2描述了測量本發明的抗體的體內效力的上皮卵巢癌小鼠腫瘤異種移植實驗的結果。
[0088]圖3A-B顯示本發明的61H7抗體的駝類來源的超變環(L1_L3，H1和H2)採用預測的人類抗體的規範摺疊和規範摺疊組合。
[0089]圖4A-B顯示本發明的68F2抗體及其種系化變體(129D3)的駝類來源的超變環(L1-L3，Hl和H2)採用預測的人類抗體的規範摺疊和規範摺疊組合。
[0090]圖5描述了 IL-6的空間填充模型，其分別與以下疊合(overlay): (A) IL-受體的F229 ； (B) IL-6 受體的 F229 和 61H7VH 的 W98, (C) IL-6 受體的 F229 和 68F2VL 的 Y30 ;和(D)IL-6 受體的 F229，61H7VH 的 W98 和 68F2VH 的 V99，均按照 Kabat 編號。[0091]圖6描述了對於IL-6受體結合重要的IL-6上的兩個表面結合空穴的空間填充模型，其與下述疊合:IL_6受體的殘基F229和F279，以及68F2VL的殘基Y30和68F2VH的V99，均根據Kabat編號(在該結構中為Y32和V104)。
[0092]圖7A-B描述68F2及其種系化變體129D3的熱穩定性，其在Biacore中用固定化的糖基化人類IL-6針對下述進行測量:(A)本發明的其它種系化變體IL-6抗體和(B)其它參照抗體。每個圖的上部描述了熔解曲線，而下部列出了對於每個抗體的Tm值。
[0093]圖8描述抗體克隆68F2，129D3 (68F2的種系化變體)和103A1 (61H7的變體)的血清穩定性。亦包括了參照抗體GL18。
[0094]圖9描述對於本發明的IL-6抗體，相對於參照抗體(以粗體顯示)(包括完全的人類抗體阿達木單抗(adalimumab) (Humira))的低免疫原性(Epibase)評分。
[0095]圖1OA-B描述(A) 68F2和(B) 61H7的VH和VL的比對，描述與其相應的種系化變體129D3和111A7的框架區的高水平的序列同源性。亦顯示了導入每個分子的框架改變的最小數目(總共為13)。
[0096]圖1lA-B 顯示(A)CNT0328 和⑶ VH_rabbit (ALD518)的 VH 和 VK 的比對，描述與其相應的種系化變體CNT0136和VH_human(ALD518)的框架區的高水平的序列同源性。亦顯示了導入每個分子的框架改變的最小數目(總共為36和46)。
[0097]圖12顯示129D3IgGl抗體及其變體在食蟹猴中的藥代動力學概貌。
[0098]圖13描述測量本發明的抗體的體內效力的血清澱粉狀蛋白A(SAA)小鼠模型實驗的結果。
[0099]圖14描述測量本發`明的抗體的體內效力的小鼠銀屑病異種移植物實驗的結果。
[0100]圖15描述在腎細胞癌小鼠腫瘤異種移植物模型中測量本發明的抗體的體內效力的實驗中觀察到的腫瘤生長數據。
[0101]圖16描述在腎細胞癌小鼠腫瘤異種移植物模型中測量本發明的抗體的體內效力的實驗中觀察到的存活數據的Kaplan-Meier圖。
[0102]圖17描述在腎細胞癌小鼠腫瘤異種移植物模型中測量本發明的抗體的體內效力的實驗中觀察到的腫瘤生長數據，所有藥劑以3mg/kg給藥。
[0103]圖18描述在腎細胞癌小鼠腫瘤異種移植物模型中測量本發明的抗體的體內效力的實驗中觀察到的存活數據的Kaplan-Meier圖,所有藥劑以3mg/kg給藥。
[0104]發明詳述
[0105]1.定義
[0106]為了使得本發明可更容易理解，首先定義了某些術語。
[0107]如用於本文中，術語「IL-6」指白介素-6。IL-6核苷酸和多肽序列在本領域中是公知的。例示性人類IL-6胺基酸序列列於GenBank保藏G1: 10834984，而例示性的小鼠IL-6胺基酸序列列於GenBank保藏G1: 13624311。
[0108]如用於本文中，術語「抗體」指免疫球蛋白分子，其包含四個多肽鏈，即通過二硫鍵相互連接的兩個重(H)鏈和兩個輕(L)鏈，以及其多聚物(例如IgM)。每條重鏈包含重鏈可變區(縮寫為VH)和重鏈恆定區。重鏈恆定區包含三個域:CH1，CH2和CH3。每條輕鏈包含輕鏈可變區(縮寫為VL)和輕鏈恆定區。輕鏈恆定區包含一個域(CLl)。VH和VL區可進一步細分為具有超變性的區，稱為互補決定區(CDR)，散布於稱為框架區(FR)的更保守的區中。
[0109]如用於本文中，術語抗體的「抗原結合片段」包括任何天然存在的，酶法可獲得的，合成的，或遺傳工程的多肽或糖蛋白，其特異性結合抗原以形成複合物。抗體的抗原結合片段可例如從完整抗體分子使用任何合適的標準技術如蛋白分解消化或重組遺傳工程技術(涉及對編碼抗體可變域和任選地恆定域的DNA的操作和表達)來衍生。抗原結合部分的非限定性實例包括:(i)Fab片段；(ii)F(ab』)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(V)單鏈Fv(scFv)分子；(vi) dAb片段；和(vii)由模仿抗體的超變區的胺基酸殘基組成的最小識別單元(例如，分離的互補決定區(⑶R))。其它工程改造的分子，如二價抗體(diabody)，三價抗體(triabody),四價抗體(tetrabody)和微抗體(minibody),亦涵蓋於表述「抗原結合部分」之內。
[0110]如用於本文中，術語「可變區」或「可變域」指下述事實:可變域VH和VL的某些部分在序列方面在抗體之間廣泛不同，並用於每種特定抗體對其靶抗原的結合和特異性。然而，所述差異在抗體的可變域中並非平均分布。其聚集在每個VL域和VH域中稱為「超變環」的三個區段，其形成抗原結合位點的一部分。V拉姆達輕鏈域的第一、第二和第三個超變環在本文中稱作LI ( λ )，L2 ( λ )和L3 ( λ )，並可定義為包含VL域中的殘基24-33 (Ll(A),由9，10或11個胺基酸殘基組成)，49-53 (L2 ( λ )，由3個殘基組成)和90-96 (L3 ( λ )，由5個殘基組成)(Morea等，Methods20:267-279 (2000))。V卡帕輕鏈域的第一，第二和第三個超變環在本文中稱作LI U)，L2(k)和L3(k)，並可定義為包含VL域中的殘基25-33 (LI (O，由6，7，8，11，12或13個殘基組成)，49-53 (L2( O，由3個殘基組成)和90-97 (L3 ( K )，由 6 個殘基組成)(Morea 等，Methods20:267-279 (2000))。VH 域的第一，第二和第三個超變環在本文中稱作Hl，H2和H3並可定義為包含VH域中的殘基25-33 (H1，由7，8或9個殘基組成)，52-56 (H2，由3或4個殘基組成)和91-105 (H3，長度高度可變)(Morea 等，Methods20:267-279 (2000))。
[0111]除非另行指明，術語LI，L2和L3分別指VL域的第一，第二和第三個超變環，並涵蓋從V卡帕和V拉姆達同種型獲得的超變環。術語Hl，H2和H3分別指VH域的第一，第二和第三個超變環,並涵蓋從任何已知的重鏈同種型(包括Y, ε，δ，α或μ)獲得的超變環。
[0112]超變環LI，L2，L3，HI, Η2和Η3可各包含如下所定義的「互補決定區」或「⑶R」的部分。術語「超變環」和「互補決定區」並不是嚴格同義的，因為超變環(HV)基於結構而定義，而互補決定區(Q)R)基於序列變異性而定義(Kabat等，Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD.，1983)，且對HV和CDR的限制在一些VH和VL域中可為不同的。
[0113]VL和VH域的⑶R通常可定義為包含下述胺基酸:輕鏈可變域的殘基 24-34(CDRLl)，50-56(CDRL2)和 89-97(CDRL3)和重鏈可變域的殘基 31-35 或3l-35b(CDRHl)，50-65(CDRH2)和 95-102(CDRH3)(Kabat 等，Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service, National Institutes ofHealth, Bethesda, MD.(1991))。因此，HV可包含於相應的CDR中，且本文中提及VH和VL域的「超變環」可解釋為亦涵蓋對應的CDR，反之亦然，除非另行指明。
[0114]可變域的更高度保守的部分稱作框架區(FR)，如下文所定義。天然重鏈和輕鏈的可變域各包含四個FR (分別為FRl，FR2，FR3和FR4)，其主要呈β -層疊構型，由三個超變環連接。每個鏈中的超變環通過FR緊密結合在一起，與來自其它鏈的超變環一起參與抗體的抗原結合位點的形成。對抗體的結構分析揭示了由互補決定區形成的結合位點的形狀和序列之間的關係(Chothia 等，J.Mol.Biol.227:799-817 (1992) ；Tramontano 等，J.Mol.Biol，215:175-182(1990))。儘管其具有高度序列差異性，但六個環中的五個僅採用主鏈構象的一個小全集，這稱為「規範結構」。這些構象首先由環的長度決定，其次由在環中和框架區中的某些位置上關鍵殘基的存在決定，其通過填充(packing)，氫鍵鍵合，或呈現不常見的主鏈構象的能力而決定構象。
[0115]如用於本文中，術語「互補決定區」或「CDR」指見於重鏈和輕鏈多肽的可變區內的非連續性抗原結合位點。這些特定區由Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616 (1977)和Kabat Sequences of protein of immunological interest.(1991),和由 Chothia 等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)和由 MacCallum 等，J.Mol.Biol.262:732-745 (1996)描述，其中該定義包括相互比較時胺基酸殘基的重疊或一部分。將涵蓋如上述每一個引用的參考文獻中定義的CDR的胺基酸殘基列出以供比較。優選地，術語「CDR」是基於序列比較由Kabat定義的Q)R。
[0116]表1:CDR 定義
[0117]
【權利要求】
1.一種結合分子，其特異性結合於IL-6，所述結合分子包含至少一種抗體⑶R，其中所述CDR包含至少一個胺基酸殘基，當所述結合分子結合於IL-6時，所述胺基酸殘基埋於IL-6上的F229空穴或F279空穴中。
2.權利要求1的結合分子，其包含VL域，所述VL域在根據Kabat的位置30具有胺基酸，當所述結合分子結合於IL-6時，所述胺基酸埋於IL-6上的F229空穴中。
3.權利要求2的結合分子，其中在位置30的胺基酸是酪氨酸。
4.前述任一項權利要求的結合分子，其包含VH域，所述VH域在根據Kabat的位置99具有胺基酸，當所述結合分子結合於IL-6時，所述胺基酸埋於IL-6上的F279空穴中。
5.權利要求4的結合分子，其中在位置99的胺基酸是纈氨酸。
6.前述任一項權利要求的結合分子，其為抗體或其抗原結合片段。
7.前述任一項權利要求的結合分子，其包含VH域，所述VH域包含選自下組的HCDR3胺基酸序列:SEQ ID NO: 497-500，543，544，566，567 和 568。
8.權利要求7的結合分子，其中所述VH進一步包含選自下組的HCDR2胺基酸序列:SEQID NO:501-507 和 545-554。
9.權利要求7或8的結合分子，其中所述VH進一步包含選自下組的HCDRl胺基酸序列:SEQ ID NO:508-512 和 555-562。
10.權利要求7-9任一項的結合分子，其進一步包含VL域，其中所述VL域包含選自下組的 LCDR3 胺基酸序列:S EQ ID NO:513-524 和 563。
11.權利要求10的結合分子，其中所述VL域進一步包含選自下組的IXDR2胺基酸序列:SEQ ID NO:525-535 和 564。
12.權利要求10或11的結合分子，其中所述VL域進一步包含選自下組的IXDRl胺基酸序列:SEQ ID NO:536-542 和 565。
13.權利要求6的結合分子，其包含VH域，所述VH域具有選自下組的胺基酸序列:SEQID NO:1-232 和 569-571。
14.權利要求6的結合分子，其包含VL域，所述VL域具有選自下組的胺基酸序列:SEQID NO:233-496 ο
15.權利要求6的結合分子，其包含:VH域，所述VH域具有選自下組的胺基酸序列:SEQ ID NO: 1-232和569-571 ;和VL域，所述VL域具有選自下組的胺基酸序列:SEQ IDNO:233-496。
16.前述任一項權利要求的結合分子，其包含VH域和VL域，所述VH域包含超變環Hl，H2和H3，其中所述VH域多肽與VL域配對，所述VL域包含超變環LI，L2和L3，其中超變環H1-H3和L1-L3至少之一是從通過用IL-6抗原主動免疫接種羊駝屬(Lama)物種得到的羊駝屬物種常規抗體獲得的。
17.權利要求16的結合分子，其中: a)超變環Hl，H2，LI，L2和L3至少之一呈現預測或實際的規範摺疊結構，其與人抗體中出現的Hl，H2，LI，L2或L3超變環的相應規範摺疊結構相同或實質上相同； b)超變環Hl和H2各呈現預測的或實際的規範摺疊結構，其與相應的人類規範摺疊結構相同或實質上相同； c)超變環LI，L2和L3各呈現預測的或實際的規範摺疊結構，其與相應的人類規範摺疊結構相同或實質上相同； d)超變環Hl和H2形成預測的或實際的規範摺疊結構的組合，其與已知出現於人類種系VH域的規範摺疊結構的相應的組合相同或實質上相同； e)超變環Hl和H2形成規範摺疊結構的組合，其對應於選自下組的人類規範摺疊結構的組合:1-1，1-2，1-3，1-4，1-6，2-1，3-1 和 3-5 ； f)超變環LI和L2形成預測的或實際的規範摺疊結構的組合，其與已知出現於人類種系VL域的規範摺疊結構的相應的組合相同或實質上相同； g)超變環LI和L2形成規範摺疊結構的組合，其對應於選自下組的人類規範摺疊結構的組合:11_7，13-7 (A, B, C)，14-7 (A, B)，12-11，14-11，12-12，2-1，3-1，4-1 和 6-1 ； h)超變環Hl和H2形成規範摺疊結構的組合，其對應於如見於人類IACY抗體結構中的人類規範摺疊結構的3-1組合； i)超變環LI和L2形成規範摺疊結構的組合，其對應於如見於人類3MUG抗體結構中的人類規範摺疊結構的6 λ -1組合；和/或 j)超變環L1，L2和L3形成規範摺疊結構的組合，其對應於如見於人類3MUG抗體結構中的人類規範摺疊結構的6 λ -1-5組合。
18.前述任一項權利要求的結合分子，其 a)抑制IL-6對IL-6受體的結合； b)抑制gpl30對IL-6受體的結合；
c)特異性結合於人類和食蟹猴(cynomolgusmonkey) IL-6 ； d)包含至少一個來自特異性結合於IL-6的馬它類(camelid)抗體的Q)R； e)特徵為具有少於約10.0的EpiBase?-評分； f)在HEK293細胞中通過瞬時表達以至少20mg/ml表達； g)呈現大於65°C 的熔解溫度(melting temperature, Tm)； h)以少於0.1pM的IC50抑制IL-6誘導的B9雜交瘤細胞的增殖； i)以少於ZxKT5iT1的解離速率(通過表面等離子共振測得的kj結合於人類IL-6； j)是親本駝類抗體的種系化變體，所述種系化變體與親本駝類抗體相比具有更高的熔解溫度； k)包含至少一個來自羊駝屬常規抗體而無後續親和力成熟的⑶R ； I)當以天然的IgGlFc格式靜脈內施用於食蟹猴時，具有至少9日，優選至少15日的血清半衰期；或 m)是親本結合分子的種系化變體，其中所述結合分子包含VH和VL域，且其中所述結合分子的VH和VL域之一或兩者與親本非人類抗體的相應VH和VL域相比，在框架區中包含總共I至10個胺基酸取代；和/或包含VH和VL域，其中所述結合分子的VH和VL域之一或兩者在框架區FR1，FR2，FR3和FR4中與一個或多個相應的人類VH或VL域具有90%或更高的序列同一性。
19.前述任一項權利要求的結合分子，其包含VH域，所述VH域具有選自下組的胺基酸序列:SEQ ID NO: 1-232和569-571，其中至少一個穀氨醯胺變成穀氨酸。
20.前述任一項權利要求的結合分子，其包含人Fe域，所述Fe域具有雙重突變H433K/N434F。
21.一種藥物組合物，其包含前述任一項權利要求的結合分子和一種或多種藥學上可接受的載體。
22.—種處理IL-6相關的疾病或病症的方法,其包括向需要此處理的受試者施用有效量的權利要求21的藥物組合物。
23.一種分離的核酸，其編碼權利要求1-20任一項的結合分子。
24.一種重組表達載體，其包含權利要求23的核酸。
25.—種宿主細胞，其包含權利要求24的重組表達載體。
【文檔編號】A61P35/00GK103601806SQ201310193693
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2012年5月23日
【發明者】C.布蘭切託特, J.德哈德, T.德賴爾, N.A.德瓊格, S.P.範德沃寧, N.G.H.翁奇內 申請人:亞根-X公司