一種提高蛋白質結晶成功率的方法

2023-06-11 05:34:56

專利名稱：一種提高蛋白質結晶成功率的方法
技術領域：
本發明涉及一種提聞蛋白質結晶成功率的方法。
背景技術：
蛋白質結構的解析對於解釋與蛋白質功能相關的生理活動具有非常重要的作用。雖然目前解析蛋白質結構的方法有很多種，但X射線單晶衍射技術解析蛋白質結構的方法仍然是最重要、最成熟、應用最為廣泛的一種技術。而對於這種技術，蛋白質晶體是必需的介質。因此，蛋白質晶體的獲得成為採用X射線單晶衍射技術解析蛋白質結構的關鍵因素。方便、高效的蛋白質晶體生長技術成為採用這種技術解析蛋白質結構的前提。採用加入形核劑促使形核的異相形核法，在一定程度上提高了蛋白質溶液的形核率，從而可以提高蛋白質的結晶成功率。Thakur等人採用加入不同種類的形核劑的方法使蛋白質的結晶成功率提高了 2% 67% (Improved Success of Sparse MatrixProtein Crystallization Screening with Heterogeneous Nucleating Agents.PLoSONE, 2007，2(10)，el091)。但形核劑以異物的形式加入到溶液中，這給晶體生長後期晶體的分離帶來一定的困難。異相形核除了以形核劑為形核中心外，也可以依靠容器的器壁形核。這種異相形核方式，為解決前述問題提供了一種可行的途徑。通過改變結晶容器壁的物理或化學狀態來提高蛋白質溶液的形核率可以在不引入異物的條件下來提高蛋白質結晶成功率，從而可以解決加入形核劑的方法帶來的晶體分離困難的問題。目前，蛋白質晶體的生長是將蛋白質溶液置入商用結晶板中進行生長。由於這種結晶板是商業產品，其所採用的材料表面光滑，吸附能力差，而蛋白質分子較大，吸附困難，這使得蛋白質溶液依靠器壁異相形核產生一定障礙。基於此，可以從改善結晶板的吸附性能著手，採用一定的手段對結晶板的表面進行處理，可以達到促進蛋白質異相形核，提高結晶成功率的目的。

發明內容
為了解決普通商用結晶板親水性差、對蛋白質溶液的吸附能力較弱的問題，本發明採用一種方法對結晶板進行表面處理，可改善上述問題，提高蛋白質結晶成功率。該方法採用具有強氧化性的酸性溶液或具有腐蝕性的有機溶劑溶液對結晶板進行處理，可以改變結晶板表面粗糖度，生成輕基、竣基、擬基等具有未水性的官能團，從而使結晶板表面的物理化學狀態產生改變，達到改善親水性，增加材料吸附能力的目的。此外，採用這種方法，可以通過改變處理溶液的配方、處理溫度、處理時間等，獲得具有不同表面物理化學狀態而具有不同吸附性能的結晶板。為提高不同種類蛋白質的結晶成功率提供了一種可行的方法。本發明的技術方案包括如下步驟:(I)表面處理溶液的配製。將溶質、溶劑以及水按照一定順序和比例混合均勻，配製成具有特定組分及比例的溶液。(2)結晶板的處理。將配製好的溶液置於恆溫水浴中，溫度設置範圍為常溫至70 °C，待溶液溫度穩定後，將結晶板浸入配製好的表面處理溶液中，浸蝕一定時間。(3)蛋白質結晶實驗。配製不同種類的蛋白質結晶溶液，將配製好的結晶溶液加入到表面處理過的結晶板中，以未處理的結晶板作為對照實驗，在恆溫培養箱中培養。觀察實
驗室結果。所述的處理溶液由具有特定比例的試劑配製而成。所述的結晶板為所有用於蛋白質結晶的結晶板。所述的蛋白質為所有需要結晶的蛋白質。本發明的有益效果是:通過將結晶板浸入到特定的溶液中，使結晶板表面發生一些物理或化學變化，這些變化包括結晶板表面發生局部溶解，甚至高分子鏈斷裂，從而使表面產生凹坑而變得粗糙不平。此外，還可以在結晶板表面產生親水性基團或接枝短鏈小分子等。這些變化改善了結晶板的親水性，從而可以提高蛋白質溶液的形核率，最終提高蛋白質的結晶成功率。
具體實施例方式以下將對本發明的優選實施例進行詳細的描述；應當理解，優選實施例僅為了說明本發明，而不是為了限制本發明的保護範圍。實施例1:1.表面處理溶液的配製。將重鉻酸鉀加入到蒸餾水中，攪拌至重鉻酸鉀完全溶解，然後向重鉻酸鉀溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌至溶液混合均勻，所得均勻溶液中各組分的質量比為:重鉻酸鉀:蒸餾水:濃硫酸=1:(2-5): (25-40)。
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2.結晶板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為常溫至70°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為2至24小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 71%。實驗例2:1.表面處理溶液的配製。將高錳酸鉀加入到蒸餾水中，攪拌攪拌至高錳酸鉀完全溶解，然後再向高錳酸鉀溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌至溶液混合均勻，所得均勻溶液中各組分的質量比為:高錳酸鉀:蒸餾水:鉻酸酐:濃硫酸=1:(1-5):(3-5): (5-25)。2.結晶板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為常溫至70°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為2至24小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 69%。實施例3:
1.表面處理溶液的配製。將鉻酸酐加入到蒸餾水中，攪拌至鉻酸酐完全溶解，再向鉻酸酐溶液中加入磷酸攪拌，最後再向該溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌至溶液混合均勻，所得均勻溶液中各組分的質量比為:鉻酸酐:蒸餾水:磷酸:硝酸:濃硫酸=1:(3-10):(10-40):(15-20): (60-120)。2.結晶板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為常溫至70°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為30分鐘至12小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 31%。實施例4:1.表面處理溶液的配製。將鉻酸酐加入到蒸餾水中，攪拌至鉻酸酐完全溶解，然後向鉻酸酐溶液中緩慢加入濃硫酸，並不斷攪拌至溶液混合均勻。混合溶液各組分的質量比為:鉻酸酐:水:硝酸:濃硫酸=1:(5-25):(10-15): (30-80)。2.結晶板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為40°C至70°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為30分鐘至24小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I,ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 24%。實施例5:1.表面處理溶液的配製。將重鉻酸鉀加入到蒸餾水中攪拌至完全溶解，向重鉻酸鉀溶液中加入磷酸攪拌至混合均勻，最後再向該溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌，至溶液混合均勻。所得均勻溶液中各組分的質量比為:重鉻酸鉀:蒸餾水:磷酸:硝酸:濃硫酸=1:(1-10):(10-40):(10-15): (30-90)。2.結晶板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為常溫至70°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為I至24小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 56%。實施例6:1.表面處理溶液的配製。將過二硫酸鉀加入到蒸餾水中，攪拌至完全溶解，再緩慢的加入濃硫酸，並不斷攪拌至溶液混合均勻。所得混合溶液中各組分的質量比為:過二硫酸鉀:蒸餾水:磷酸: 濃硫酸=1:(10-40):(15-25): (400-650)。2.結晶板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為40至70°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為5分鐘至2小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 45%。實施例1:1.表現處理溶液的配製。將鹽酸和硝酸依次加入到蒸餾水中，攪拌至溶液混合均勻後，再緩慢加入濃硫酸，並不斷攪拌至溶液混合均勻。混合溶液各組分的體積比為:鹽酸:水:硝酸:濃硫酸=1:(150-230):(260-300): (520-600)。2.結晶板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為40至70°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為30分鐘至12小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 38%。實施例8:1.表面處理溶液的配製。將 表面活性劑加入到蒸餾水中攪拌至完全溶解，再加入甲苯攪拌至溶液混合均勻。各組分的質量比為:表面活性劑:乙醚:甲苯:水=1:(1-3):(2-5):(10_15)。2.結果板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為20至50°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為3分鐘至2小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 21%。實施例9:1.表面處理溶液的配製。將乙醚、丙酮和蒸餾水按照體積比1:(1-5): (4-20)混合均勻，配製成處理溶液。2.結果板的處理。將配製好的溶液放置在恆溫水浴中，設置水浴溫度為10至40°C，等溶液溫度均勻後，將結晶板放入溶液中處理，時間為3分鐘至2小時。3.蛋白質結晶實驗。分別配製 Proteinase K, thaumatin, catalase, concanavalin A, a -chymotrypsinogen A I, ribonuclease A III, ribonuclease A XII, subtilisin AVIII, papain, lactalbumin, Hen Fegg-white lysozyme,Glucose isomerase 等蛋白質結晶溶液，然後加入到表面處理後的結晶板中，將結晶板放置在20°C的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。結晶成功率提聞了 29%。
權利要求
1.一種提高蛋白質結晶成功率的方法，其特徵在於包括下述步驟: (1)不同處理溶液的配製:①將重鉻酸鉀加入到蒸餾水中，攪拌至重鉻酸鉀完全溶解，然後向重鉻酸鉀溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌至溶液混合均勻，所得均勻溶液中各組分的質量比為:重鉻酸鉀:蒸餾水:濃硫酸=1:(2-5):(25-40);或者②將高錳酸鉀加入到蒸餾水中，攪拌攪拌至高錳酸鉀完全溶解，然後再向高錳酸鉀溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌至溶液混合均勻，所得均勻溶液中各組分的質量比為:高錳酸鉀:蒸餾水:鉻酸酐:濃硫酸=1:(1-5):(3-5):(5-25);或者③將鉻酸酐加入到蒸餾水中，攪拌至鉻酸酐完全溶解，再向鉻酸酐溶液中加入磷酸攪拌，最後再向該溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌至溶液混合均勻，所得均勻溶液中各組分的質量比為:鉻酸酐:蒸餾水:磷酸:硝酸:濃硫酸=1:(3-10):(10-40):(15-20):(60-120);或者④將鉻酸酐加入到蒸餾水中，攪拌至鉻酸酐完全溶解，然後向鉻酸酐溶液中緩慢加入濃硫酸，並不斷攪拌至溶液混合均勻，混合溶液各組分的質量比為:鉻酸酐:水:硝酸:濃硫酸=1:(5-25):(10-15):(30-80);或者⑤將重鉻酸鉀加入到蒸餾水中攪拌至完全溶解，向重鉻酸鉀溶液中加入磷酸攪拌至混合均勻，最後再向該溶液中緩慢加入濃硫酸並不斷攪拌，至溶液混合均勻，所得均勻溶液中各組分的質量比為:重鉻酸鉀:蒸餾水:磷酸:硝酸:濃硫酸=1:(1-10):(10-40):(10-15):(30-90);或者⑥將過二硫酸鉀加入到蒸餾水中，攪拌至完全溶解，再緩慢的加入濃硫酸，並不斷攪拌至溶液混合均勻，所得混合溶液中各組分的質量比為:過二硫酸鉀:蒸餾水:磷酸:濃硫酸=1:(10-40): (15-25): (400-650);或者⑦將鹽酸和硝酸依次加入到蒸餾水中，攪拌至溶液混合均勻後，再緩慢加入濃硫酸，並不斷攪拌至溶液混合均勻，混合溶液各組分的體積比為:鹽酸:水:硝酸:濃硫酸=1:(150-230):(260-300) =(520-600)或者⑧將表面活性劑加入到蒸餾水中攪拌至完全溶解，再加入甲苯攪拌至溶液混合均勻，各組分的質量比為:表面活性劑:乙醚:甲苯:水=1:(1-3):(2-5):(10-15)或者⑨將乙醚、丙酮和蒸餾水按照體積比1:(1-5): (4-20)混合均勻，配製成處理溶液； (2)結晶板的處理:將以上配置好的溶液置於恆溫水浴中，其中處理溶液①至③、處理溶液⑤溫度設置範圍為常溫至70°C，處理溶液④、處理溶液⑥、處理溶液⑦溫度設置範圍為40V至70°C，處理溶液⑧溫度設置範圍為20至50°C，處理溶液⑨溫度設置範圍為10至40°C待溶液溫度穩定後，將結晶板浸入配製好的表面處理溶液中，浸蝕一定時間；` (3)蛋白質結晶:配製不同種類的蛋白質結晶溶液，將配製好的結晶溶液加入到表面處理過的結晶板中，以未處理的結晶板作為對照實驗，在恆溫培養箱中培養，將結晶板放置在20 V的恆溫培養箱中，培養2-6天，觀察結晶結果。
2.根據權利要求1所述的提高蛋白質結晶成功率的方法，其特徵在於:所述的結晶板為所有用於蛋白質結晶的結晶板，蛋白質為所有需要結晶的蛋白質。
全文摘要
本發明提供了一種提高蛋白質結晶成功率的方法，包括如下步驟將溶質、溶劑以及水按照一定順序和比例混合均勻，配製成具有特定組分及比例的溶液，將配製好的溶液置於恆溫水浴中，溫度設置範圍為常溫至70℃，待溶液溫度穩定後，將結晶板浸入配製好的表面處理溶液中，浸蝕一定時間，配製不同種類的蛋白質結晶溶液，將配製好的結晶溶液加入到表面處理過及未處理的結晶板中，在恆溫培養箱中培養，觀察實驗結果。
文檔編號C07K1/30GK103242424SQ20131017616
公開日2013年8月14日 申請日期2013年5月14日 優先權日2013年5月14日
發明者尹大川, 何進, 郭雲珠, 張辰豔, 劉永明, 曹慧玲, 崔超, 施建宇, 商澎 申請人:西北工業大學