2型豬鏈球菌sa1KR基因敲除突變株及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-03 14:37:26 3

專利名稱：2型豬鏈球菌sa1KR基因敲除突變株及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬細菌類，具體i兌是一4朱2型豬《連5求菌(6Yre; "cocciAS1 i""/s ""0^e2) M/^基因敲除突變抹的製備方法，以及在豬鏈球菌病疫苗研製中 的應用。
背景技術：
2型豬鏈球菌(簡稱S. 2)是一種重要的人獸共患病的病原體。豬群
對S. wh 2普遍易感，感染後可致急性敗血症、肺炎、腦膜炎、關節炎、心 內膜炎及急性死亡等，如不及時治療病死率達40°/ ;病後存活的豬生長緩慢，存 欄時間大為延長。近年我國南方省份的豬群中& 2流行日趨嚴重，時有
較大規模暴發，每年造成的經濟損失達數十億元。該病原體感染人類可導致腦 膜炎、敗血症等嚴重疾患。1998和2005年分別在我國江蘇和四川資陽人群中發 生大規模暴發流行，病人中出現高比例的、國內外罕見的中毒性休克症候群， 病情兇險，病死率高(60%~80%),引發嚴重的公共衛生事件。目前，國內外尚 無理想的適合動物和人群使用的疫苗，相關基礎和應用研究對於該病的預防和 控制具有十分重要的意義。
傳統的疫苗包括滅活疫苗和減毒活疫苗。滅活疫苗是經滅活的全菌體死疫 苗，其最大的優點是製備與生產容易，且穩定、易保存；但缺點是需多次接種、 接種劑量大、接種後局部或全身毒、副反應明顯，且有的疫苗保護作用欠佳。 減毒活疫苗的優點是只需接種一次，接種劑量小，免疫效果較好，且免疫力教 持久；缺點是不穩定、難保存，且可能出現毒力的回覆突變。以上兩種疫苗都 是以全菌體為基礎的疫苗，它們的共同缺點是注入體內的抗原組分多而複雜， 有許多組分其實是非保護性抗原。這些非保護性抗原組分的存在， 一是幹擾了 機體對保護性抗原的應答(有時對非保護性抗原的應答成為主要應答，而保護性抗原是非主要應答甚至無應答)；二是非保護性抗原的存在可能帶來嚴重的免
疫毒副反應，如發燒、免疫性疾病等。

發明內容
本發明的目的，是針對上述不足之處提供一株無毒2型豬鏈球菌及其製備 方法，以及在豬鏈球菌病疫苗研製中的應用。
對一抹分離自2005年四川資陽2型豬鏈球菌疫情爆發現場的強毒林 05ZYH33 (Genbank登錄號NC—009442 )進行基因工程技術改造，將位於其染色 體上PAI挑毒力島中的二元信號轉導系統SalK/SalR編碼基因m/tW(序列表SEQ ID N0: 1和2 )進行基因敲除，取而代之的是壯觀黴素抗性基因盒(Spectinomycin resistance cassette, S/ c"，序列表SEQ ID NO: 3)，通過動物實-瞼證實該突 變^^為對宿主動物無致病力的無毒才朱。
然後基於系統生物學和反向遺傳學方法，擬對義2突變抹與野生抹 進行比較蛋白質組學研究，通過蛋白質二維電泳分離並找出二者蛋白表達譜上 的差異點，進而採用MALDI-TOF MS時間飛行質譜鑑定對這些差異點進行逐一 分析，確定每一個蛋白的編碼基因，按常規方法進行克隆、表達與純化，製備 出蛋白性抗原的候選分子。然後用這些候選分子作為抗原免疫動物，再用野生 林進行攻擊，觀察動物存活情況，篩選出可能的保護性抗原組分，為該菌疫苗
走向應用奠定基礎。
因此，製備該無毒2型豬鏈球菌菌林的方法，主要包括以下步驟
(1) 根據義2野生抹05ZYH33基因組wL^編碼基因的上下遊DNA序列， 設計PCR引物，
(2) 以05ZYH33基因組DNA為模板，擴增^LCT編碼基因，構建基因敲除載體；
(3) 建立在i^/基因兩側具有同源序列的^/7^基因敲除載體pUC:: m/v^;
(4) 基因敲除載體pUC:: M/v^電轉化製備好的51 2野生株05ZYH33感受 態細胞；
(5) 篩選具有壯觀黴素抗性的豬鏈球菌菌落，PCR和Southern雜交證實 w/^編碼基因被勤(/基因替換，即得到2型豬鏈球菌w/M基因敲除突變林。動物實驗檢測本突變株是否有對動物有危害。
目前該2型豬鏈球菌菌種的保藏號是CGMCC No. 2259;保藏單位是中國微 生物菌抹保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址北京市朝陽區大屯路中國 科學院微生物研究所；菌種的拉丁學名是S"e;7r0""〃《》"h sero0^e 2; 參據的微生物(林)05ZYH33Asa/iT /保藏日期為2007年11月23日。
本發明的細菌具有以下特徵該菌屬於球菌科、鏈球齊屬，為革蘭氏陽性 菌，兼性厭氧，呈卵圓形，以短鏈形式存在，在W綿羊血T服瓊脂培養基上37 。C培養24-48小時，可長出細小菌落，直徑l 2mm，呈淺灰色或半透明，稍帶 粘液樣，在菌落周圍能產生cr溶血環。
本發明的突出優點
1. 用該菌進行動物實驗，結果對實驗動物無任何危害。
2. 該無毒抹與野生抹全基因組序列相似性很大，適合用於疫苗研究與生產。


圖1為基因敲除載體pUC:: M/i^的構建過程示意圖； 圖2為^LO 基因敲出前後染色體基因組織分布圖3為無毒2型豬鏈球菌突變林0SZYH33A^/iT 的鑑定結果(B、 C、 D中1 號泳道為野生抹05ZYH33, 2號泳道為基因敲除突變株05ZYH33Asa/A7 ， 3號泳 道為單交換對照突變林)。
具體實施例方式
材料
1. Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa公司產品，中國大連)
2. T4 DNA連接酶(TaKaRa公司產品，中國大連)
3. ib汰I、 5a/nH I、 /V I、 AV d III等限制性內切酶(TaKaRa公司產品， 中國大連)
4. 質粒載體pUC18 (Promega公司產品，美國)
5. 質粒DNA抽提試劑盒(Profflega公司產品，美國)
6. DNA膠回收試劑盒(Promega公司產品，美國)7. 大腸桿菌DH5ot (本室保存)
8. 2型豬鏈球菌強毒抹05ZYH33 (分離自四川資陽中毒性休克症候群病人)
9. 酵母提取物、胰蛋白腖和Todd-Hewitt Broth ( THB )培養基(0xoid公 司產品，英國)
10. LB液體培養基稱取酵母提取物5 g,胰蛋白腖IO g， NaCl 10 g，溶 於1000 ml去離子水中，高壓蒸氣滅菌。
11. LB固體培養基每1000 ml液體LB培養基中加入15 g瓊脂粉，高壓蒸 氣滅菌。
12. THB液體培養基稱取THB粉3g，溶於100 ml去離子水中，高壓蒸氣 滅菌。
13. THB固體培養基每100ml液體THB培養基中加入1.5 g瓊脂粉，高壓 蒸氣滅菌。
14. 壯觀黴素、氨苄青黴素(Sigma公司產品，美國)
15. North2South DNA隨機引物生物素標記和化學發光檢測試劑盒(Pierce 公司產品，美國)
16. Gene Pulser Xcell m型電穿孔儀(BIO-RAD公司產品，美國)
實施例l:基因敲除栽體的構建
(1)引物設計根據i1. 2野生林05ZYH33基因組^/M編碼基因的上下 遊DNA序列(序列表SEQ ID NO: 4和5 ),設計PCR引物，鹼基序列如下 LA1: 5， GTGGATCCTAGCTTATTTTTACTGTTATC 3，
(下劃線處為引入的fcoR I酶切位點)
LA2: 5， AGCTGCAGATGGAGGAAATGCGGAATC 3，
(下劃線處為引入的A/HH I酶切位點)
RA1: 5，ATGGTACCAATTACCCTTTTTACTCAT 3'
(下劃線處為引入的戶W I酶切位點)
RA2: 5， AAGGGCCCCACCGACACTTCCACTACCTA 3，(下劃線處為引入的#/"(1 III酶切位點)
引物LA1和LA2用於擴增w/iT必扁碼基因的上遊DNA片段，引物RA1和RA2用於擴 增下遊DNA片段。為了克隆的需要，在LAl和LA2引物中分別引入i"coR I和勘/z/H I 的酶切位點，在引物RA1和RA2中分別引入屍W I和化'/ d III的酶切位點。
(2) PCR擴增以05ZYH33基因組DNA為模板，用引物LA1和LA2進行PCR，擴 增^/J必扁碼基因上遊片段LA;用引物RA1和RA2進行PCR，擴增w/^編碼基因下 遊片段RA。
PCR的反應體系為
模板(05ZYH33 genomic DNA) 2 pl
Primer 1 (LA1或RA1) 4 jal
Primer 2 (LA2或RA2) 4 jal
dNTP(10 mM each) 2 jil
10xPCR buffer 10 jal
MgCl2(25mM) 6 pi
Ex Taq DNA聚合酶 1 pi
細20_71 pi
Total 100 pi
PCR的反應條件為第一階段94。C預變性5分鐘；第二階段94。C變性40秒， 55。C退火40秒，72。C延伸l分鐘，循環25次；第三階段72。C延伸10分鐘。所得PCR 產物經iy。瓊脂糖電泳^r測分別可見約1200 bp (LA)和llOO bp (RA)大小的電泳 條帶，將PCR產物回收、純化，分別用&oR I和屍W I/#// d III進行雙
酶切，將雙酶切產物回收、純化，凍存備用。
(3) LA的克隆將fcoR 1/勘/wH I雙酶切後的LA片萃爻與用同樣內切酶雙酶切 處理過的pUC18載體進行連接，16。C過夜後將連接產物轉化DH5 ot大腸桿菌感受 態細胞，經氨千青黴素篩選後，挑取LB平板上的克隆培養於LB液體培養基中37 。C振蕩過夜。次日提取質粒DM，用&ov 1和勘/ # I進行雙酶切鑑定，將有1200 bp左右大小DNA片段出現的重組質粒命名為pUC18-LA。(4) RA的克隆將戶W I/#/"d in雙酶切後的RA片-更與用同樣內切酶雙酶 切處理過的重組質粒pUC18-LA進行連接，16。C過夜後將連接產物轉化DH5 oc大腸 桿菌感受態細胞，經氨卡青黴素篩選後，挑取LB平板上的克隆培養於LB液體培 養基中37。C振蕩過夜。次日提取質粒DNA,用屍W I和vW/2d III進行雙酶切鑑定， 將有IIOO bp左右大小DM片段出現的重組質粒命名為pUC18-LR。
(4) 壯觀黴素抗性基因分^的克隆；根據pSET2質粒DNA序列並以其為模板， 設計引物PCR擴增壯觀黴素抗性基因引物序列為
Spcl: AGGGATCCGTTCGTGAATACATGTTATA (下劃線為引入的勘/nH I酶切位點)， Spc2: ATCTGCAGGTTTTCTAAAATCTGAT (下劃線為引入的戶W I酶切位點)， PCR的反應體系和條件同前，所得PCR產物經1^瓊脂糖電泳檢測可見約1100 bp (i^cO大小的電泳條帶，將PCR產物回收、純化，用勘M1 1/AM進行雙酶切， 將雙酶切產物回收、純化，與用同樣內切酶雙酶切處理過的重組質粒pUC18-LR 進行連接，16X:過夜後將連接產物轉化DH5a大腸桿菌感受態細胞，經壯觀黴素 和氨苄青黴素雙重篩選後，挑取LB平板上的克隆培養於LB液體培養基中37。C振 蕩過夜。次日提取質粒DNA，用勘/hH I和戶W I進行雙酶切鑑定，將有IIOO bp左 右大小DNA片^:出現的重組質粒命名為pUC:: ^/y^。
(5) 基因敲除載體pUC:: w/^的確認將基因敲除載體pUC:: ^/A7 進行測 序，測序結果表明在5^c《基因兩側具有同源序列的w/iO 基因敲除載體 pUC:: ^力CT的構建完全正確。
實施例2:無毒2型豬鏈球菌突變林的篩選與鑑定
(1) 電轉化將構建好的基因敲除載體pUC:: i"〃vO 電轉化5: ^//s 2野生林 05ZYH33感受態細胞，將菌液塗布於含有壯觀黴素的THB平板上，37。C培養24-48 小時。
(2) 篩選從壯觀黴素THB平板上挑選豬鏈球菌菌落，分別培養於2ml液 體THB培養基，各取2 ja 1菌液作為模板，用引物checkl和check2(位於 基因內部，引物序列為
checkl: GGGGGACTATTACTTTTGAG,check2: TTTCTTTTTCGCGTTCTGTC
進行PCR初步篩選。如果^/^基因被敲除，PCR擴增將會得到陰性結果， 如果仍能擴增出預期大小(514 bp)的產物，說明m/^基因未被敲除。通過這 種方法，初步篩選獲得w/^ 基因敲除突變抹，將其命名為05ZYH33A"/^。
(3)鑑定採用Southern雜交進一步證實基因敲除突變抹05ZYH33A"/;^ 的正確性，雜交所用探針為分^基因、m/^編碼基因和pUC18質粒DNA，探針 的標記和雜交信號的檢測嚴格按照North2South DNA隨機引物生物素標記和化 學發光檢測試劑盒說明書進行。
實施例3:動物實驗
為檢測該2型豬鏈球菌突變林對宿主動物的致病性，在平板上分別挑取51 2野生抹05ZYH33和突變抹05ZYH33 △ 的單個菌落，於THB培養基中
37。C振蕩培養至對數生長中期(OD6。。《0.6),取0.5ml菌液(約108 CFU劑量)離 心收集菌體，用同等體積的無菌PBS緩衝液重懸細菌。通過耳緣靜脈注射的方 法，用野毒抹和突變抹分別攻擊健康長白仔豬(6頭豬/每個菌抹)，密切觀察 感染動物的體徵，比較兩組動物的發病情況及存活時間有無明顯變化。結果發 現，注射突變林後的實驗豬無明顯病理反應，而用同等劑量注射後的長白豬均 則出現典型的義2感染症狀，如關節炎、心內膜炎、呼吸衰竭等，繼而 先後死亡，最快可在24小時內猝死。動物實驗結果表明，^//> 基因敲除後的 突變抹為無毒抹。 實施例4:應用前景
基於系統生物學和反向遺傳學方法，擬對& m" 2突變抹與野生抹進行 比較蛋白質組學研究，通過蛋白質二維電泳分離並找出二者蛋白表達譜上的差
異點，進而採用MALDI-T0FMS時間飛行質譜鑑定對這些差異點進行逐一分析， 確定每一個蛋白的編碼基因，按常規方法進行克隆、表達與純化，製備出蛋白 性抗原的候選分子。然後用這些候選分子作為抗原免疫動物，再用野生抹進行 攻擊，觀察動物存活情況，篩選出可能的保護性抗原組分，為該菌疫苗走向應 用奠定^出。序列表
中國人民解放軍第三軍醫大學
<120〉 2型豬鏈球菌M/vCT基因敲除突變林的製備方法及其應用

5
Patentln version 3. 3
<210〉 1
1188
DNA
豬鏈球菌05ZYH33 ( 5Vre/^ococc"s 05ZYH33)

CDS
編碼二元信號轉導系統組氨酸激酶SalK的DNA序列
1
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2 597 DNA豬鏈球菌05ZYH33 ( 5^re/^ococcws05ZYH33)

CDS
編碼二元信號轉導系統反應調節因子Sa 1R的DNA序列
2
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3
1130
DNA 人工序列
編碼壯觀黴素抗性基因盒(Specti謹ycin resistance cassette)的DM序列
3
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1203
DNA
豬鏈J求菌05ZYH33 ( SYre/^ococcw 05ZYH33)
二元信號轉導系統SalK/SalR編碼基因^//v 的上遊DNA序列，為基因敲除的同源 左臂
4
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tga1203
5 1130 DNA
<213〉豬鏈球菌05ZYH33 ( 67re; "coccM 05ZYH33)
二元信號轉導系統SalK/SalR編碼基因^/jCT的下遊DNA序列，為基因敲除的同源 右臂
5
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gtgactgtcatctgtttacaggatttacactgaaga卿catctttggttUtucatag900
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cUaggUgtttggagctgggtaatcaagctcacgctg^tagtgatatgcgtgttgact1020
tgaaaaaatggtctcg"ttgatgttcttatgtggtattc1080
taaa汪ttgttccataagcacttcctaatgatgatUgggaggtctUtgg1130
權利要求
1.一種2型豬鏈球菌salKR基因敲除突變株，其保藏號為CGMCC No.2259。
2. 製備如權利要求1所述的2型豬鏈球菌w/M基因敲除突變林的方法， 其特徵在於有以下步驟(1) 根據i: 2野生4朱05ZYH33基因組^/J必扁碼基因的上下遊DNA序列， 設計PCR引物，(2) 以05ZYH33基因組DNA為模板，擴增^/^編碼基因，構建基因敲除載體；(3) 建立在& 基因兩側具有同源序列的M/yT7 基因敲除載體pUC: : w/v^;(4) 基因敲除載體pUC:: w/M電轉化製備好的i: 2野生抹05ZYH33感受 態細月包；(5) 篩選具有壯觀黴素抗性的豬鏈J求菌菌落，PCR和Southern雜交證實 ^//7 編碼基因被勤^基因替換，即得到2型豬鏈球菌w/i7 基因敲除突變林。
3. 根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於PCR引物的序列為 LA1: 5， GTGGATCCTAGCTTATTTTTACTGTTATC 3，(下劃線處為引入的^70)H酶切位點)LA2: 5， AGCTGCAGATGGAGGAAATGCGGAATC 3，(下劃線處為引入的勘/zjH I 酶切^f立點)RA1: 5， ATGGTACCAATTACCCTTTTTACTCAT 3，(下劃線處為引入的戶W I酶 切4立點)RA2: 5， AAGGGCCCCACCGACACTTCCACTACCTA 3，(下劃線處為引入的W/7d III 酶切位點)
4.如權利要求1所述的2型豬鏈球菌w7^基因敲除突變抹在豬鏈球菌 病疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種2型豬鏈球菌salKR基因敲除突變株及其製備方法和應用。所述突變株05ZYH33ΔsalKR，保藏號為CGMCC No.2259。其製備方法為利用同源重組技術將S.suis 2野生株05ZYH33染色體上PAI89K毒力島中的二元信號轉導系統SalK/R進行基因敲除，經PCR鑑定和Southern雜交證實，確定所獲得的菌株為基因敲除突變株，命名為05ZYH33ΔsalKR。用本發明所述突變株進行動物實驗，其結果對實驗動物無任何危害，所述突變株與野生株全基因組序列相似性很大，適合用於疫苗研究與生產。
文檔編號A61K39/09GK101294144SQ200810069298
公開日2008年10月29日 申請日期2008年1月25日 優先權日2008年1月25日
發明者唐家琪, 明 李, 申曉冬, 胡福泉 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學