一種黃鯽蛋白抗菌肽的製備方法
2023-06-03 15:37:26
專利名稱：一種黃鯽蛋白抗菌肽的製備方法
技術領域：
本發明涉及蛋白抗菌肽的製備方法，尤其是一種黃鯽蛋白抗菌肽的製備方法。
背景技術：
在抗生素濫用，耐藥菌株不斷產生的今天，抗菌肽的研究吸引著國內外 學者的目光，人們在不斷尋找新的抗菌肽，探索抗菌肽新的作用機制。抗菌肽 (antibacterialpeptide, ABP)又稱抗微生物肽(antimicrobial peptide, AMP)廣泛分 布於細菌、病毒和各種動植物體內，是生物天然免疫防禦系統的重要組成部分。AMP多數 是一類分子量小於IOkDa小分子肽，在鏈長、序列及結構有多樣性的陽離子型兩親性肽類 (Boman H G. Antibactericidal peptides :key components needed in immunity[J]. Cell，1991,65 :205-207 ；Hultmark D.Drosophila immunity :paths and patterns[J]. Current Opinion in Immunology，2003，15 :12-19.)。第一個抗菌肽 Cecropin 是瑞典科 學家Meiner等在1981年從惜古比天蠶(Hyatophora cecropia)蛹中誘導分離得到一 禾中殺菌肽(Steiner H，Hultmark DiEngstrom^ . , et al. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity[J]. Nature，1981，292 246-248.)。目前抗菌肽的製備方法有從動植物組織中直接提取法、化學合成法、基因工程 法、酶解法。從天然動植物組織直接提取抗菌肽目前局限於幾種主要動植物，且需要大量溶 劑，分離提純困難較大；化學合成法隨著胺基酸數的增加，出錯率及副反應也增加，而且成 本高；基因工程法由於抗菌肽分子小、易被蛋白酶降解，而且表達產物可能對宿主有害，從 而影響了基因的高水平表達(布冠好，李宏基，楊國宇，等.抗菌肽的作用特點及應用前景 [J].動物醫學進展，2005，沈(3) :26- . )。Bolscher等認為採用酶解蛋白質法生產抗菌肽 可能是大批量生產抗菌肽最有前途的方法(Bolscher J GM, Van der Kraan M I A, Nazmi K. , et al. A one-enzyme strategy to release an antimicrobialpeptide from the LFampin-domain of bovine lactoferrin [J] · peptides, 2006, 27 :1-9.)。酶角軍法有反應 條件溫和、反應過程容易控制等優點。本身無抗菌作用的蛋白質可以通過改變蛋白質構型 或者通過酶解方式獲得抗菌活性，而具有抗菌作用的蛋白可以作為具有新功能作用和更強 抗菌作用的前體物質(Lopez Exposito I,Recio I. Antibacterial activity ofpeptides and folding variants from milk proteins[J]. International Dairy Journal,2006, (16) :1294-1305.) 以食物源蛋白為原料製備抗菌肽研究，國內外主要集中在乳源蛋白方面，而有關 其他食物源蛋白為基質直接通過酶切方式獲得具有抗菌活性肽的研究報導很少。本研究以 大宗海產低值魚黃鯽為原料，通過響應面優化法(RSM)確定出抗菌肽製備的最佳條件，並 對抗菌液的營養成分和理化穩定性進行測定，結果表明黃鯽蛋白抗菌肽中必需胺基酸含量 豐富、理化性質穩定。因為食物源蛋白酶解所得的抗菌肽安全性高、吸收性好，所以黃鯽蛋 白抗菌肽在食品中有作為營養和功能型添加劑的應用前景。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種黃鯽蛋白抗菌肽的製備方法，所製得的抗 菌肽安全性高、吸收性好，製備方法科學合理。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為一種黃鯽蛋白抗菌肽的製備方 法，其特徵在於包括以下步驟1)將魚肉洗淨切小塊，用組織搗碎機攪碎均勻，製成魚肉糜，按照魚肉糜質量的 3 5倍比例加入去離子水；2)調節魚肉糜與水混合液的pH值至1. 5 2. 5，並保持恆定；3)根據魚肉糜的質量，胃蛋白酶以1000 1300U/g的比例加入到混合液中，在保 持酶解溫度35 45°C的條件下，酶解2 3小時；4)加熱升溫至95 100°C進行鈍化滅酶，滅酶時間5 15分鐘；5)冷卻至3 5°C以下，進行離心處理5 15分鐘，離心速度6000_8000r/min ；6)過濾，取中間濾液至少在_20°C以下凍藏或凍幹保藏。所述的水與魚肉糜質量比值優選為4 1。所述的製備方法中pH值是用6mol/L的鹽酸與6mol/L氫氧化鈉來調節的，pH值 優選為2.0。所述的胃蛋白酶使用量優選為1100U/g。所述的酶解溫度優選37°C，時間2. 4小時。與現有技術相比，本發明的優點在於是以純天然的海產低值魚黃鯽為原料來 製備抗菌肽，黃鯽蛋白抗菌肽富含人體必需亮氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨 酸、蘇氨酸、纈氨酸，對熱、酸鹼和消化道蛋白酶理化性能穩定，對革蘭氏陰性菌(G_)大 腸桿菌(Escherichia coli)、焚光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens)、普通變形 (Proteusvulgaris)、綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)；革蘭氏陽性菌(G+)金黃色 葡萄球(Staphylococcus aureus)、巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)、八疊球菌 (Sarcina)、藤黃八疊球菌(Sarcina lutea)均有抑菌作用。以食物源蛋白酶解所得的抗菌 肽具有安全性高、吸收性好、抑菌效果好的優點，可以在食品中作為營養和功能型添加劑或 開發為耐藥菌抗生素，具有廣闊的應用前景。本製備方法簡單、經濟、易於操作，可以在普通 實驗室進行，也適用於工業化擴大生產。
圖1為工藝流程圖。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例11)將黃鯽去內臟洗淨切小塊，用組織搗碎機攪碎均勻，製成魚肉糜，取魚肉糜50 克，加入200克去離子水；2)用6mol/L的鹽酸與6mol/L氫氧化鈉來調節魚肉糜與水混合液的pH值至2. 0， 並保持恆定；
3)將55000U的胃蛋白酶加入到混合液中，在保持酶解溫度37°C的條件下，酶解 2. 4小時；4)升溫至95 100°C加熱進行鈍化滅酶，滅酶時間10分鐘；5)冷卻至4°C以下，進行離心處理10分鐘，速度7000r/min ；6)過濾，取中間濾液在_20°C凍藏或凍幹保藏。三氯乙酸沉澱(TCA)結合凱氏定氮法測定黃鯽蛋白的胃蛋白酶抗菌液中可溶 性肽提取率達到(81. 78士0.04) %，茚三酮結合凱氏定氮法測定抗菌酶解液的水解度為 (18. 12士0. 39) %。酶解液的雙縮脲反應、茚三酮反應均為陽性，說明是肽類混合物，其中混 合肽含量為25mg/ml。響應面分析(RSM)優選條件下，30μ 1黃鯽蛋白抗菌肽對大腸桿菌的抑菌圈直徑 為3士 1.9)mm與理論值20. 2mm無顯著性差異(P > 0. 05)，說明優選條件下確定的參數準確可靠，具有實用價值。
下面對優選條件下黃鯽胃蛋白酶酶解液的營養成分與性能做進一步測試分析。 一、胺基酸分析結果 表1黃鯽胃蛋白酶酶解液胺基酸分析Table !Amino acid composition of half-fin anchovy pepsin hydrolysates
權利要求
1.一種黃鯽蛋白抗菌肽的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)將黃鯽魚肉洗淨切小塊，用組織搗碎機攪碎均勻，製成魚肉糜，按照魚肉糜質量的 3 5倍比例加入去離子水；2)調節魚肉糜與水混合液的pH值至1.5 2. 5，並保持恆定；3)根據魚肉糜的質量，胃蛋白酶以1000 1300U/g的比例加入到混合液中，在保持酶 解溫度35 45°C的條件下，酶解2 3小時；4)加熱，升溫至95 100°C進行鈍化滅酶，滅酶時間5 15分鐘；5)冷卻至3 5°C以下，進行離心處理5 15分鐘，離心速度6000-8000r/min；6)過濾，取中間濾液至少在-20°C以下凍藏或凍幹保藏。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的水與魚肉糜質量比值優選為 4 1。
3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的pH值是用6mol/L的鹽酸與 6mol/L氫氧化鈉來調節的，pH值優選為2. 0。
4.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的胃蛋白酶使用量優選為1100U/g°
5.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的酶解溫度優選37°C，時間2.4 小時。
全文摘要
本發明涉及一種黃鯽蛋白抗菌肽的製備方法，將魚肉勻漿製成魚肉糜，在保持pH值1.5～2.5的條件下加入1000～1300U/g魚肉糜的胃蛋白酶，升溫至35～45℃酶解2～3小時，再將酶解液95～100℃加熱5～15min滅酶，冷卻至3～5℃，6000-8000r/min離心處理5～15分鐘，過濾，取中間濾液至少在-20℃以下凍藏或凍幹保藏。本發明是以純天然的海產低值魚黃鯽為原料來製備抗菌肽，黃鯽蛋白抗菌肽富含人體必需胺基酸，理化性能穩定，以食物源蛋白酶解所得的抗菌肽安全性高、吸收性好、抑菌效果好，可以在食品中作為營養和功能型添加劑或開發為耐藥菌抗生素，本製備方法簡單、經濟、易於操作，可以在普通實驗室進行，也適用於工業化擴大生產。
文檔編號C12P21/06GK102051398SQ20091015449
公開日2011年5月11日 申請日期2009年10月29日 優先權日2009年10月29日
發明者宋茹, 韋榮編 申請人:浙江海洋學院