土貝母皂苷丙在製備治療惡性腫瘤藥物中的應用的製作方法

2023-05-28 02:47:41 4

專利名稱：土貝母皂苷丙在製備治療惡性腫瘤藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及土貝母皂苷丙的用途，特別是土貝母皂苷丙在製藥領域中的應用。
背景技術：
惡性腫瘤是一種嚴重危害身體健康的疾病，自20世紀70年代以後，惡性腫瘤的發病人數以每年3％-5％的速度遞增。目前常規的治療方法有外科手術治療、放射治療、化學藥物治療和生物調節治療等，其中化學藥物在惡性腫瘤的臨床治療應用中佔據主導地位，但其強烈的毒副作用也一直困擾著廣大的醫務人員。常規的癌症化學治療是自上個世紀50年代開始的，由於大多數藥物都是針對細胞分裂過程中DNA合成的，因此，這些治療方法必然傷及正常細胞和組織器官，尤其是骨髓，患者為此付出的代價極高。
中醫藥特別是中藥複方長期以來在治療某些惡性腫瘤疾病上起到了一些獨特的作用，但由於技術手段上的相對落後，使我們目前無法闡明中藥治病的基本原理，這已成為廣泛推廣應用複方中藥的一個巨大障礙。因此，從天然植物或中藥中尋找能夠說明作用機理的單體活性成分，已成為當今的熱門研究領域，並取得了一定的成績。例如從紅豆杉樹皮中分離出抗癌活性成分紫杉醇，從喜樹果實中分離出的抗癌活性成分喜樹鹼和10-羥基喜樹鹼等衍生物，從中藥斑蝥中分離出抗肝癌活性成分斑蝥素等。這些成功的例子都為我們尋找更多更新的化合物用於治療癌症展示了廣闊的美好前景。
目前，以齊墩果酸為先導化合物進行結構改造來研製新的活性化合物已成為繼紫杉醇結構修飾研究之後的又一熱門研究課題。令人感興趣的是，齊墩果酸在不同部位連上不同的基團，就會產生不同的生物活性，特別是與糖基相連形成皂苷後更加顯示出其獨特的活性。土貝母皂苷正是齊墩果酸同系物皂苷。
從土貝母中已經分離出的土貝母皂苷甲在中國專利94104124.7，95113751.4中被證明可以治療陰道炎、宮頸炎、宮頸糜爛、宮頸息肉、直腸炎、直腸癌等，而且還能殺傷白血病細胞並對白血病細胞有誘導分化作用；另一種同系物是土貝母皂苷乙，在中國專利99106201.9中公開了其在預防和治療各種惡性腫瘤藥物中的應用。
土貝母皂苷丙是從中草藥土貝母Bolbostemma paniculatum[Maxim]Franquet鱗莖中分離出來的一種單體有效成分，分子式為C64H100O31，分子量為1364，結構式為 其結構為大環三萜皂苷，由齊墩果酸為母核的貝萼皂苷元(bayogenin)和組成糖鏈的四種糖—葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖，以及3-甲基-3-羥基戊二酸組成。該皂苷易溶於水和極性溶劑，穩定性好，適合於製作任何現代製劑如片劑、膠囊劑、栓劑、各種搽劑軟膏、注射劑等，但至今未見土貝母皂苷丙在製備用於治療惡性腫瘤藥物中應用的相關報導。

發明內容
本發明的目的是提供土貝母皂苷丙在製藥中的新用途，具體地說是提供土貝母皂苷丙在製備治療惡性腫瘤藥物中的應用，以製備能有效治療惡性腫瘤的藥物。
土貝母皂苷丙可從土貝母鱗莖中用如下方法提取將乾燥的土貝母鱗莖粉碎後，過2mm孔徑篩網，用20倍藥材重量的95％乙醇分3～4次冷浸，減壓回收乙醇，將提取液濃縮至無醇味。分別用三分之一倍量的氯仿和正己烷萃取脫脂，水層凍幹，收率為16％。
凍乾粉用水溶解後上DIAION HP20(日本NIPPON RENSUI公司)離子交換樹脂分離組分，分別用30％、70％和100％乙醇洗脫，得到3部分，收率分別為6.5％、11.1％和2.2％。
將70％乙醇洗脫部分上矽膠柱，用氯仿-甲醇-水(7∶3∶1)混合液洗脫，得到土貝母皂苷甲和其他兩部分，其中一部分上C18反相矽膠柱，用75％甲醇溶液洗脫即得到土貝母皂苷乙和另一部分；將其上製備型HPLC分離，流動相為70％甲醇水溶液，流速6ml/min，檢測波長210nm，即可得到土貝母皂苷丙。
將其用於治療惡性腫瘤，即口服土貝母皂苷丙以治療惡性腫瘤，其劑量為5-15mg土貝母皂苷丙/日，每日分兩次口服，土貝母皂苷丙可以製成膠囊、片劑、栓劑或顆粒劑等藥劑學上所說的各種口服劑型和各種搽劑軟膏、注射劑等。
實驗證明，從土貝母中分離純化出的土貝母皂苷丙具有更高活性的抗癌作用，並具備廣譜抗腫瘤效果，對膀胱癌、胃癌、急性髓性白血病、紅白血病、肝癌、卵巢癌、直腸癌、肺癌細胞均有殺傷作用，毒副作用低，且活性比土貝母皂苷甲強。機理研究證明其主要是通過誘導細胞凋亡和影響細胞脂代謝導致壞死而對癌細胞產生作用。
為了更好地理解本發明的實質，以下用土貝母皂苷丙的藥效試驗、急性毒性試驗和作用機理研究結果來說明其在治療惡性腫瘤中的功效作用。
1.藥效試驗1.1 MTT法檢測土貝母皂苷甲和土貝母皂苷丙藥物對8種腫瘤細胞的生長抑制效應1.1.1細胞株HL-60(急性髓性白血病)，K562(紅白血病)，HePG2(肝癌)，SKOV3(卵巢癌)，SW480(直腸癌)，A549(肺癌)，T24(膀胱癌)BGC(胃癌)3T3(小鼠成纖維細胞，轉化細胞)，ECV304(人臍靜脈內皮細胞)。由重慶醫科大學病理生理教研室提供。細胞培養在10％小牛血清RPMI1640(美國GIBCO)培養液中(內含0.1％青鏈黴素)，並置37℃，5％CO2培養箱備用。
1.1.2藥物用生理鹽水分別配製土貝母皂苷甲和土貝母皂苷丙溶液，使藥物最終濃度均為5.6、11.2、22.5、45、90μg/ml五種濃度。
1.1.3試驗方法分別收集對數生長期8株細胞，調整細胞濃度為5×104個/ml，接種於96孔培養板中，每孔加200μL(1×104個細胞/孔)。實驗分為試劑對照組，細胞對照組，土貝母皂苷甲和土貝母皂苷丙藥物5種不同濃度的實驗組，每孔加藥物溶液20μL，每組設8個平行孔，培養3天後，吸去上清液，加1640培養液200μL/孔及濃度為5mg/ml的MTT溶液20μL/孔，繼續培養4h，吸去上清夜，加二甲亞碸200μL/孔，震蕩溶解後，在自動酶標儀(Bio-Rad-550型)上測定每孔的吸光值，測定波長570nm。實驗重複3次，取平均值計算藥物對8株細胞作用的中效濃度(即IC50)及相關係數。結果見表1、2、3。
表1土貝母皂苷甲抑制8株腫瘤細胞繫結果土貝母皂苷甲抑制率(X±std，n＝3)細胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/mlHL-60 0.15±0.007 0.308±0.0220.720±0.0730.837±0.0050.908±0.010＜0.001K562 0.360±0.0390.574±0.0280.770±0.0160.871±0.0370.930±0.022＜0.001HePG2 0.382±0.0380.632±0.0300.822±0.0350.870±0.0120.906±0.012＜0.001SKOV3 0.156±0.0160.419±0.0660.648±0.0190.807±0.0040.894±0.014＜0.001SW480 0.347±0.0330.628±0.0180.786±0.0250.865±0.0330.928±0.021＜0.001A549 0.325±0.0180.609±0.0140.805±0.0100.865±0.0170.923±0.017＜0.001T24 0.306±0.0240.544±0.0310.757±0.0200.837±0.0220.918±0.006＜0.001BGC 0.219±0.0310.630±0.0280.784±0.0310.859±0.0390.927±0.024＜0.001表2土貝母皂苷丙抑制8株腫瘤細胞繫結果土貝母皂苷丙抑制率(X±std，n＝3)細胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/mlHL-600.243±0.0310.458±0.0350.786±0.0240.874±0.0230.924±0.013＜0.001K5620.454±0.0280.616±0.0290.829±0.0340.878±0.0240.927±0.026＜0.001HePG20.414±0.0130.632±0.0300.827±0.0240.875±0.0230.927±0.014＜0.001SKOV30.263±0.0230.549±0.0210.756±0.0250.823±0.0160.954±0.007＜0.001SW4800.365±0.0260.742±0.0300.858±0.0340.907±0.0170.951±0.013＜0.001A5490.336±0.0180.628±0.0190.818±0.0060.893±0.0140.934±0.007＜0.001T24 0.344±0.0120.630±0.0170.792±0.0090.878±0.0190.938±0.011＜0.001BGC 0.297±0.0190.665±0.0290.828±0.0330.871±0.0110.941±0.017＜0.001
表3土貝母皂苷甲、丙抑制8株腫瘤細胞系中效濃度結果中效濃度(IC50，μg/ml)細胞系土貝母皂苷甲 土貝母皂苷丙HL-60 15.95 11.66K5628.10 6.27HePG27.00 5.95SKOV316.85 11.16SW480 8.18 6.33A5498.53 8.06T24 9.02 7.56BGC10.48 8.321.2土貝母皂苷甲、丙抑制荷瘤小鼠腫瘤試驗1.2.1對接種S180瘤株的昆明小鼠的抑制試驗受試藥物分別稱取土貝母皂苷甲、乙一定量，加生理鹽水溶解即可。
給藥途徑腹腔注射(ip)或尾靜脈注射(iv)。
實驗動物昆明小鼠、SPF級動物(合格證號為醫動字第310101001)。
瘤株腹水瘤細胞株(S180)，來自重慶醫科大學病理生理教研室。
實驗環境實驗在一級標準動物實驗室進行，設施合格證書20000330號。
實驗方法昆明小鼠50隻、體重18～22g、雌雄兼用。取接種7～8天之腹水瘤按1∶10稀釋計數、使終濃度為瘤細胞1000萬個/ml；每隻鼠右腋皮下接種0.2ml(含200百萬個瘤細胞)。次日隨機均分3組藥物組(劑量3mg/kg)、空白對照組及環磷醯胺(Cy，劑量50mg/kg)陽性對照組。藥物組每天給藥一次，連續給藥7天；空白對照組則給予相應體積NS液；陽性對照組(Cy組)間日給藥一次。末次給藥後停藥一天。脫頸處死動物，稱體重及剖瘤稱重。計算各組瘤重，按下列公式求出腫瘤抑制率，並進行t檢驗。
表4土貝母皂苷甲、丙對荷S180腫瘤小鼠的抑制作用劑量給藥途徑 藥前/藥後 藥前/藥後 瘤 重抑制率組別P值(mg/kg) ×次數動物數 體重 (x±sd)(％)對照組 17/1719.4/28.4 1.57±0.34苷甲8 ip×6 10/1019.5/22.5 1.03±0.3534 ＜0.01苷丙6 ip×6 10/1019.5/20.8 0.70±0.2355 ＜0.01Cy50 sc×3 10/1019.5/27.7 0.67±0.2557 ＜0.001
由表4可見，土貝母皂苷甲、丙對荷S180腫瘤小鼠有明顯抑制作用(p＜0.01)，而皂苷丙的作用明顯高於皂苷甲。
1.2.2對接種肝癌細胞株(H22)的昆明小鼠的抑制試驗實驗方法同上。瘤株肝癌細胞株(H22)，來自重慶醫科大學病理生理教研室。
表5土貝母皂苷甲、丙對荷H22腫瘤小鼠的抑制作用劑 量 給藥途徑 藥前/藥後 藥前/藥後 瘤 重 抑制率組 別P值(mg/kg) ×次數動物數 體重(x±sd) (％)對照組 17/17 23.3/32.12.62±0.71苷甲 12 ip×5 10/10 23.3/27.81.77±0.3632.4＜0.01苷丙 8 ip×5 10/10 23.3/25.61.39±0.5746.9＜0.001Cy 50 sc×3 10/10 23.3/27.41.12±0.4657.0＜0.001由表5可見，土貝母皂苷甲、丙對荷H22腫瘤小鼠有明顯抑制作用(p＜0.001)。而皂苷丙的作用明顯高於皂苷甲。
2.急性毒性試驗2.1小鼠靜脈注射毒性試驗實驗動物小鼠為昆明種，一級動物(合格證號為醫動字第310101001)，體重18～22g。雌雄各半，由重慶市中藥研究院實驗動物研究室提供。小鼠領取後於實驗室觀察3天，供給充足飼料，自由飲水，確定實驗動物健康無病後方供實驗用。
實驗環境實驗在一級標準動物實驗室進行，設施合格證號為24303013。
數據處理LD50測定用半數效量概率單位法(加權直線回歸法)計算，所用PEMS統計軟體由華西醫科大學研製。
給藥途徑靜脈注射。
實驗方法根據預試結果，初步確定土貝母皂苷丙靜脈注射的全死劑量為24mg/kg，全不死劑量為14.0/kg，即以24mg/kg為最大劑量，按0.85的等比依次遞減進行試驗，測定小鼠LD50值。
取昆明種小鼠40隻，雌雄各半，分4組，每組10隻，禁食不禁水12小時，按劑量(24.00、20.40、17.34、14.7mg/kg)分別給動物一次性靜脈注射，記錄動物毒性反應及死亡情況，連續觀察7天，並計算LD50。
表6土貝母皂苷丙對正常小鼠靜脈注射急性毒性結果計量 動物數 死亡數存活數(mg/kg) (只)(只) (只)24.00 10 10 020.40 10 6 417.34 10 1 914.70 10 010實驗結果24mg/kg組，小鼠全部死亡(給藥後10分鐘死亡9隻)，死前動物雙腿後彈，心跳加快呼吸加深、隨後撲腹而亡。屍檢見有1隻動物鼻孔出血、眼球突出、餘未見明顯肉眼見病變；20.40mg/kg組動物藥後72小時內有6隻動物死亡，尾部見紫黑色炎性壞死，成活4隻動物均未見尾根部斷掉成莊尾。見表6。
本次實驗結果LD50為19.79mg/kgLD50的95％可信區間為18.55～21.20mg/kg。
2.2小鼠腹腔注射毒性試驗試驗所有條件與上述相同。給藥途徑腹腔注射。根據預示結果按0.8等比級數設計給藥計量。見表7。
表7.土貝母皂苷丙對正常小鼠腹腔注射急性毒性結果計量動物數 死亡數 存活數(mg/kg) (只) (只) (只)24.00 10 10019.20 109115.36 107312.29 10469.83 1028本次實驗結果LD50為13.34mg/kg。LD50的95％可信區間為10.96～15.30mg/kg。
2.3對正常細胞的毒性試驗試驗方法同1.1.3項。結果表明，土貝母皂苷甲、丙對正常細胞均有一定的細胞毒作用。見表8、9、10。
表8土貝母皂苷甲對正常細胞的毒性試驗土貝母皂苷甲抑制率(X±std，n＝3)細胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/ml3T3 0.233±0.0230.567±0.0200.787±0.0170.862±0.0140.914±0.011＜0.001ECV3040.161±0.0180.326±0.0180.574±0.0240.814±0.0130.899±0.008＜0.001表9.土貝母皂苷丙對正常細胞的毒性試驗土貝母皂苷丙抑制率(X±std，n＝3)細胞系P5.6μg/ml 11.2μg/ml 22.5μg/ml 45.0μg/ml 90.0μg/ml3T30.335±0.0190.654±0.0130.801±0.0040.874±0.0160.936±0.009＜0.001ECV304 0.321±0.0110.634±0.0260.775±0.0080.833±0.0120.918±0.008＜0.001表10.土貝母皂苷甲、丙抑制正常細胞系中效濃度結果中效濃度(IC50，μg/ml)細胞系土貝母皂苷甲 土貝母皂苷丙3T310.81 9.37ECV304 17.98 8.693.作用機理研究3.1流式細胞儀檢測藥物對細胞周期的變化及細胞凋亡率影響收集SW480細胞株對數生長期細胞，將1×106個細胞接種於200ml培養瓶中，實驗分為對照組，實驗組(分別使用土貝母皂苷甲和土貝母皂苷丙藥物1/2中效濃度)，培養3天，胰酶消化，分別收集對照組及實驗組細胞，PBS洗2次，檢測細胞周期用預冷的70％乙醇固定，檢測細胞凋亡用10％甲醛固定，進行流式細胞儀檢測。
結果表明，SW480細胞株在用藥後，其細胞周期主要表現G1期細胞數量明顯增加，S期細胞減少。使用ANNEXIN V-FITC試劑盒檢測細胞凋亡，對於土貝母皂苷甲和土貝母皂苷丙處理後細胞均檢測到凋亡細胞和壞死細胞。結果見表11。
結論土貝母皂苷丙作用於腫瘤細胞可以引起細胞凋亡，從而起到殺死腫瘤細胞的作用。
表11.土貝母皂苷甲、丙對SW480細胞周期及凋亡率影響序號 G1 S G2凋亡率(％)對照組36.761.02.3皂苷甲32.666.31.1 9.9皂苷丙46.447.56.2 14.33.2電鏡觀察藥物對細胞形態的影響細胞樣品的準備同3.1項，收集對照組及實驗組細胞，PBS洗2次，細胞用戊二醛固定，按常規方法切片後製備樣品於電鏡下檢測。
電鏡下觀察結果顯示，藥物作用後的細胞呈現三種類型1)凋亡細胞，其形態出現細胞核碎裂，胞漿電子密度加深等現象；2)壞死細胞；3)變性細胞，其形態出現空泡，胞漿中存在脂滴。
結論從用藥後細胞形態的改變來看，土貝母皂苷丙可以導致腫瘤細胞脂肪代謝的紊亂，在細胞中形成脂滴，最終導致細胞壞死，同樣起到殺死腫瘤細胞的作用。
具體實施例方式
實施方式一製備土貝母皂苷丙注射劑稱取0.25g土貝母皂苷丙溶於400ml的無水乙醇中，加注射用水至1000ml，用3號垂熔漏鬥或其他濾器濾材過濾至澄明，灌封，100℃滅菌30分鐘即得注射用針劑。本品為無色澄明液體。pH值為5.5～7.0。
實施方式二製備土貝母皂苷丙片劑按下列配比準備原料土貝母皂苷丙 10克羥丙甲纖維素(Methocel E50)200克羥丙甲纖維素(Methocel K4M) 75克羥丙纖維素 25克無水乳糖 65克硬脂酸 6克硬脂酸鎂 6克微粉矽膠 3克將兩種規格的羥丙甲纖維素和羥丙纖維素在相對溼度小於40％的環境中至少貯存24小時，兩種不同粘度的羥丙甲纖維素混合約1.5小時，加羥丙纖維素後混合15分鐘，放置。加土貝母皂苷丙和乳糖混合，再加硬脂酸、硬脂酸鎂和微粉矽膠混勻，直接壓片，每片含藥物10mg。
權利要求
1.土貝母皂苷丙在製備治療惡性腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及土貝母皂苷丙的用途，特別是土貝母皂苷丙在製備治療惡性腫瘤藥物中的應用。藥效及急性毒性試驗證明，從土貝母中分離純化出的土貝母皂苷丙具有更高活性的抗癌作用，並具備廣譜抗腫瘤效果，對膀胱癌、胃癌、急性髓性白血病、紅白血病、肝癌、卵巢癌、直腸癌、肺癌細胞均有殺傷作用，毒副作用低，且活性比土貝母皂苷甲強。機理研究證明其主要是通過誘導細胞凋亡和影響細胞脂代謝導致壞死而對癌細胞產生作用。
文檔編號A61K31/7028GK1559419SQ20041002184
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月15日 優先權日2004年2月15日
發明者於超, 邱宗蔭, 李惠芝, 何俊琳, 湯為學, 於 超 申請人:於超, 邱宗蔭, 於 超