一種用於防治韭菜遲眼蕈蚊的蘇雲金芽孢桿菌及其應用的製作方法

2023-11-06 21:53:37 2

一種用於防治韭菜遲眼蕈蚊的蘇雲金芽孢桿菌及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了屬於生物防治領域的一種用於防治韭菜遲眼蕈蚊的蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis)菌株JQ23，該菌株已於2014年6月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.9375。本發明還公開了一種含有JQ23的微生物殺蟲劑及其製備方法。本發明蘇雲金芽孢桿菌JQ23對韭菜遲眼蕈蚊幼蟲具有很高的毒力，為韭菜遲眼蕈蚊的防治提供了一種有效的方法；其次，本發明蘇雲金芽孢桿菌屬於天然產物，對人畜無毒，對環境無汙染；此外，本發明微生物殺蟲劑製備方法簡單，使用方便。
【專利說明】一種用於防治韭菜遲眼蕈蚊的蘇雲金芽孢桿菌及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物防治領域，具體涉及一種用於防治韭菜遲眼蕈蚊的蘇雲金芽孢杆 菌，以及該蘇雲金芽孢桿菌在蔬菜害蟲防治中的應用。

【背景技術】
[0002] 韭菜遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga)又名韭蛆、黃腳蕈蚊，屬雙翅目，眼蕈蚊科， 主要危害韭菜、大蔥、洋蔥、小蔥、大蒜等百合科蔬菜，偶爾也危害萵苣、青菜、芹菜等，是蔥 蒜類蔬菜的主要害蟲之一，在全國各地均有分布。韭菜遲眼蕈蚊的幼蟲生活在土壤表層，群 集在韭菜地下部的鱗莖和柔嫩的莖部蛀食為害。初孵幼蟲先為害韭菜葉鞘基部和鱗莖的上 端；春、秋季主要為害嫩莖，導致根莖腐爛。受害韭菜地上部分生長細弱，葉片發黃萎蔫下 垂，最後韭葉枯黃死亡。夏季氣溫高時，幼蟲向下移動，為害韭菜鱗莖，致使整個鱗莖腐爛， 嚴重時整墩韭菜枯死。對於韭菜遲眼蕈蚊的防治方法主要有物理防治（糖醋液、臭氧等） 和化學防治。由於物理防治方法存在操作繁瑣、防治效果受環境影響大等缺點，生產上主要 採用農藥灌根等化學手段進行防治，但是由於韭蛆繁殖快、隱蔽性強、防治難度大，導致菜 農不規範或過量、甚至違規使用禁用的高毒農藥進行防治，導致農藥殘留超標、汙染環境、 危害人類健康以及殺害有益鳥類等問題，另一方面，長期大量使用化學農藥增強害蟲抗藥 性、汙染環境、殺傷鳥類、造成害蟲再度猖獗的惡性循環，不能達到對害蟲種群的有效控制， 同時造成韭菜農殘超標，使消費者健康受到威脅。近年來毒韭菜事件頻發，如：2004年4月 "香河毒韭菜進京事件"、2010年4月"青島毒韭菜"和2011年3月河南南陽"毒韭菜事件"， 連續的毒韭菜曝光事件，使得消費者"談韭色變"，嚴重影響了菜農的經濟利益和消費者的 食品安全。
[0003] 生物防治由於具有專一性強、對人畜無毒害、不存在產生抗藥性以及環境汙染等 問題，日益受到人們的青睞。為了減少化學農藥對環境的汙染及對人民健康的威脅，篩 選對韭蛆有高致病性的生防微生物是防治韭蛆的有效方法和重要措施。蘇雲金芽孢杆 菌（Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種從土壤或死亡昆蟲體內分離出來的革蘭 氏陽性細菌，此類菌在芽孢形成時期能產生一種或多種對鱗翅目、鞘翅目、雙翅目、同翅 目、膜翅目、直翅目、等翅目、毛翅目或纓翅目等多種害蟲具有殺蟲活性的伴孢晶體蛋白 (Insecticidal Crystal Proteins,簡稱ICPs)。這種殺蟲晶體蛋白對目標害蟲高效專一、 對人畜無害、不汙染環境，因而蘇雲金芽孢桿菌在害蟲的生物防治中得到了廣泛的應用。
[0004] 利用蘇雲金芽孢桿菌防治韭蛆的研究相對較少，如蘇雲金芽孢桿菌防治韭蛆的效 果可達75%左右（成學美等.植保技術與推廣。1998年04期）或84.85% (解維星.2006， 華中農業大學碩士論文）。
[0005] 從上述可知，利用蘇雲金芽孢桿菌防治韭菜遲眼蕈蚊具有良好應用前景。


【發明內容】

[0006] 本發明目的在於提供一種用於防治韭菜遲眼蕈蚊的蘇雲金芽孢桿菌。該菌株對雙 翅目眼蕈蚊科害蟲韭菜遲眼蕈蚊具有高毒殺能力。
[0007] 本發明另一目的在於提供一種微生物殺蟲劑。
[0008] 本發明第三目的在於提供上述微生物殺蟲劑的製備方法。
[0009] 本發明第四目的在於提供上述蘇雲金芽孢桿菌的用途。
[0010] 實現本發明的技術方案如下：
[0011] 本發明一種蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23,該菌株已於 2014年6月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京 市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 9375。
[0012] -種微生物殺蟲劑，含有上述蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23。
[0013] 上述微生物殺蟲劑，其劑型為液體劑型。
[0014] 上述微生物殺蟲劑，其所述的液體劑型中含有上述蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23 的芽孢濃度為 107 ?108cfu/ml。
[0015] 上述微生物殺蟲劑的製備方法，包括如下步驟：
[0016] (1)、菌種活化：將保存的蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23 在LB平板培養基上、在29?31°C下活化12?16h ;挑取單菌落在LB斜面培養基上、在 29?31°C下培養3?5天，得活化的菌株；
[0017] (2)、種子液製備：用無菌接種環刮取一小環步驟（1)中活化的菌株接種到LB液體 培養基50ml中，在29?31°C、轉速為200?220rpm/min條件下培養10?14h，得種子液；
[0018] (3)、發酵培養：按照體積比為1?2%的比例將步驟（2)所得的種子液接入到黃 豆餅澱粉粉培養基中，在29?31°C、轉速為200?220rpm/min條件下培養48?60h，得到 發酵液；
[0019] (4)、用水稀釋步驟（3)所得的發酵液，調節pH值至6. 6?6. 8,添加0.02?0· 1% 的苯甲酸鈉，即得微生物殺蟲劑；或者將步驟（3)所得的發酵液在4°C、轉速為5000rpm/ min條件下離心30min，取沉澱，得沉澱物，再用水稀釋沉澱物，調節pH值至6. 6?6. 8,添加 0. 02 %?0. 1 %的苯甲酸鈉，即得微生物殺蟲劑。
[0020] 上述製備方法步驟（1)中所述的LB平板培養基或LB斜面培養基為本領域技術人 員所熟知的常用培養基，其組成成分及其重量比例為：胰蛋白腖l〇g，酵母提取物5g，氯化 鈉 l〇g，瓊脂粉 15g，水 1L，ρΗ7· 2。
[0021] 上述製備方法步驟（2)中所述的LB液體培養基為本領域技術人員熟知的常用培 養基，其組成成分及其重量比例為：胰蛋白腖l〇g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水lL，pH7. 2。
[0022] 上述製備方法步驟（3)中所述的黃豆餅粉培養基的組成成分及其重量百分 比為：黃豆餅粉2. 5 %、棉籽餅粉1.2 %、玉米澱粉1.5 %、酵母粉0.5 %、ΚΗ2Ρ040 . 03%、 MgS040 . 05%，水 1L。
[0023] 上述蘇雲金芽孢桿菌JQ23在防治蔬菜害蟲上的應用。
[0024] 所述的蔬菜害蟲是指雙翅目眼蕈蚊科害蟲。
[0025] 所述的眼蕈蚊科害蟲是指亜菜遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga)。
[0026] 本發明菌株JQ23採集篩選的過程及其分類鑑定：
[0027](一）採集篩選的過程及形態分類鑑定：
[0028] 本發明菌株JQ23是河北省農林科學院植物保護研究所將2013年4月在河南省 採集的土樣中分離到的菌株接種在LB固體培養基（胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉 l〇g，瓊脂粉15g，水1L，pH7. 2)上在30°C條件下培養，不同時間取樣鏡檢觀察菌落（見圖 1)形態特徵、晶體特徵等。在LB培養基上培養不同階段觀察結果如下，營養體：呈杆狀，兩 端鈍圓，大小約1. 1?1.5X0. 5μπι;單個或兩個以上呈鏈狀存在。芽孢：橢圓形，大小約 1. 0?1. 2 X 0. 5 μ m，為休眠體；對高溫或者乾燥等不良環境有較強的抵抗力。伴孢晶體：球 形，直徑約0. 4 μ m，具有殺蟲活力。這些形態特徵與《常見細菌系統鑑定手冊》（東秀珠等 編著，科學出版社.2001年）中描述的芽孢桿菌形態特徵基本一致，初步判斷該菌株屬於蘇 雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)，並將其命名為JQ23。
[0029] (二）利用gyrB基因序列對JQ23菌株進行分子鑑定分類：
[0030] 將JQ23菌株接種於LB培養液，30°C振蕩過夜，取lmL菌液於Eppenddorf管中，離 心，棄上清，200 μ L超純水懸浮，100°C處理lOmin，12000rpm離心5min，取上清即為DNA模 板。利用芽孢桿菌gyrB-F和gyrB-R為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；其中所述的引 物序列為：
[0031] gyrB-F :5' TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT3,（SEQ ID No. 1)，
[0032] gyrB-R :5, TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC3,（SEQ ID No. 2);
[0033] gyrB 的 PCR 擴增反應體系（50μ L) :10XPCR Buffer(Mg2+)5y L ;dNTP Mixture(2.5mM)5yL，引物（10ymol/L)各 lyL，模板 lyL，Taq聚合酶（5U/yL)lyL， 超純水補至 50μ L。反應程序為：95°C 5min ;95°C 30s，55°C 45s，72°C lmin，30 個循環； 72°C 10min。將擴增產物送交上海生工生物工程有限公司進行測序，得JQ23菌株的gyrB基 因序列（見SEQ ID No. 3)。將JQ23菌株的gyrB基因序列在Genbank中進行同源性比較， 結果發現JQ23與蘇雲金芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高，達到99% ;同時利用MEGA 軟體構建系統發育樹，結果（見圖3) JQ23菌株與蘇雲金芽孢桿菌聚合在一起，說明JQ23菌 株為蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)，並且與任何其他菌株不同，是一個新菌 株。
[0034] (三）利用phoR基因序列對JQ23菌株進行分子鑑定分類：
[0035] 提取JQ23菌株的DNA，然後以JQ23菌株的DNA為模板，以ph〇R-F和ph 〇R-R為引 物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；其中所述的引物序列為：
[0036] phoR-F :5' TTYARYTCATGRGAVACATT3'（SEQ ID No. 4);
[0037] phoR-R :5, GGNTAYAAANARGAGGAGCC3,（SEQ ID No. 5);
[0038] phoR 的 PCR 反應體系（50 μ L) : 10XPCR Buffer (Mg2+) 5 μ L，dNTP Mixture(2.5mM)5yL，引物（10ymol/L)各 2yL，模板 lyL，Taq 聚合酶（5U/yL)lyL， 超純水補至 50μ L。反應程序為：95°C 5min ;95°C 30s，50°C 45s，72°C lmin，30 個循環； 72°C 10min。將所得擴增產物送交上海生工生物工程有限公司進行測序，得JQ23菌株的 phoR 基因序列（見 SEQ ID No. 6)。將 JQ23 的 phoR 基因序列（見 SEQ ID No. 6)在 Genbank 中進行同源性比較，結果發現JQ23菌株與蘇雲金芽孢桿菌的phoR基因序列同源性最高，達 到99% ;同時利用MEGA軟體構建系統發育樹，結果（見圖4) JQ23菌株與蘇雲金芽孢桿菌 聚合在一起，說明JQ23菌株在分類上屬於蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)，並 且與任何其他菌株不同，是一個新菌株。
[0039] 本發明JQ23微生物殺蟲劑的使用方法：將JQ23微生物殺蟲劑直接兌水稀釋至 1 X 107cfu?1 X 108cfu/ml，在韭蛆發生初期灌根防治，連續灌根3次，每次間隔5-7d。
[0040] 本發明具有的優點或有益效果：本發明蘇雲金芽孢桿菌菌株JQ23對韭菜遲眼蕈 蚊幼蟲具有很高的毒力，其菌液濃度在IX 107cfu/mL以上時，對韭菜遲眼蕈蚊幼蟲7天的 校正死亡率達83.84%以上；凡23微生物殺蟲劑1父10 7(^11/1^使用濃度下，田間蟲口減退 率達到66. 03%，防治效果達到85. 09%;本發明為韭菜遲眼蕈蚊的防治提供了一種有效的、 無害的、環保的方法；其次，本發明蘇雲金芽孢桿菌屬於天然產物，對人畜無毒，對環境無汙 染，將其作為微生物殺蟲劑用於蔬菜害蟲防治，屬於環境友好型殺蟲劑，該微生物殺蟲劑的 開發和利用將有效杜絕"毒韭菜事件"再次發生，保障食品安全；此外，本發明JQ23的微生 物殺蟲劑製備方法簡單，使用方便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0041] 圖1.為JQ23菌株菌落照片。
[0042] 圖2.為JQ23菌株感染的韭菜遲眼蕈蚊幼蟲對比照片，其中左側的為健康的韭菜 遲眼蕈蚊幼蟲，右側的為被JQ23菌株感染的韭菜遲眼蕈蚊幼蟲。
[0043] 圖3.為根據gyrB基因序列構建的JQ23系統發育樹。
[0044] 圖4.為根據phoR基因序列構建的JQ23系統發育樹。

【具體實施方式】
[0045] 實施例1 JQ23菌株微生物殺蟲劑的製備
[0046] 按照如下方法進行：
[0047] (1)菌種活化：將保存的蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23((已於2014年6月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保 藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 9375))在LB平板培養基（其組成成分及其重量比例為：胰蛋白腖10g，酵母提取物5g， 氯化鈉 l〇g，瓊脂粉15g，水lL，pH7. 2)上29°C活化13h，挑取單菌落在LB斜面培養基（（其 組成成分及其重量比例為：胰蛋白腖l〇g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂粉15g，水1L， pH7. 2)上30°C培養3天，得活化的菌株。
[0048] (2)種子液的製備：用無菌接種環刮取一小環步驟（1)活化的菌株接種到LB液 體培養基（其組成成分及其重量比例為：胰蛋白腖l〇g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水1L， pH7. 2)50ml中，在30°C、搖床轉速為200rpm/min的條件下培養12h，得種子液。
[0049] (3)發酵培養：按照體積比為1 %的比例將步驟（2)的種子液接入到黃豆餅澱 粉粉培養基（其組成成分及其重量百分比為：黃豆餅粉2. 5 %、棉籽餅粉1.2%、玉米澱 粉 1. 5 %、酵母粉 0· 5 %、ΚΗ2Ρ040· 03 %、MgS040. 05 %，加水混合溶解，調 ρΗ7· 2,121°C 滅菌 30min，再降到30°C備用）中，在30°C，轉速為200rpm/min搖床培養48h，檢測發酵液中菌 體和芽孢數量，待發酵液中胞晶分離達到95%時停止發酵培養，得發酵液（以下簡稱"菌 液"；經稀釋平板計數法計數發酵液中的活菌數大於5. 46 X 108cfu/ml。
[0050] (4)將步驟⑶所得發酵液調節pH值至6. 6?6. 8,添加0. 02 %?0. 1 %的苯甲 酸鈉，即得微生物殺蟲劑；或者將發酵液在4°C、轉速為5000rpm/min條件下離心30min，棄 掉上清液，所得沉澱為JQ23孢晶混合物，用水稀釋菌體JQ23孢晶混合物至1 X 107cfu/ml濃 度，調節pH值至6. 6?6. 8,添加0. 02 %?0. 1 %的苯甲酸鈉，即為微生物殺蟲劑。
[0051] 實施例2 :本發明JQ23菌株防治韭菜遲眼蕈蚊幼蟲室內生測試驗
[0052] (一）試驗設計：
[0053] 將實施例1製備的JQ23菌液用水分別稀釋成5X108、1X108、1X10 7、1X106、 1 X 105cfu/ml五個濃度梯度。
[0054] 對照：無菌水
[0055] (二）試驗方法：
[0056] (1)將滅菌的1. 5%水瓊脂倒入一次性塑料培養皿中，厚度為3mm，上鋪兩層濾紙；
[0057] (2)將韭菜剪至大小為10mm的韭菜段，浸泡在實施例⑴製備的JQ23菌液中 20min，取出浸泡過JQ23菌液的韭菜段放入平皿中。
[0058] ⑶挑取大小一致、健康活潑的韭菜遲眼蕈蚊幼蟲接種在步驟⑵中含菌的韭菜 段上，以無菌水為對照。置於25°C、光周期14h :10h(L :D)條件下飼養7d。每處理30頭試 蟲，設3次重複，施藥後定期調查死亡蟲數。數據統計分析應用SPSS18. 0軟體進行數據處 理。
[0059] 表1本發明菌株JQ23防治韭菜遲眼蕈蚊2齡幼蟲的試驗結果
[0060]

【權利要求】
1. 一種蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23,該菌株已於2014 年6月24日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.9375。
2. -種微生物殺蟲劑，其特徵在於含有權利要求1所述的蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株 JQ23。
3. 按照權利要求2所述的微生物殺蟲劑，其特徵在於其劑型為液體劑型。
4. 按照權利要求3所述的微生物殺蟲劑，其特徵在於其所述的液體劑型中含有權利要 求1所述的蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23的芽孢濃度為107? 108cfu/ml 〇
5. 權利要求3所述的微生物殺蟲劑的製備方法，其特徵在於包括如下步驟： (1) 、將保存的蘇雲金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)菌株JQ23在LB平板培養 基上、在29?31°C下活化12?16h ;挑取單菌落在LB斜面培養基上、在29?31°C下培養 3?5天，得活化的菌株； (2) 、用無菌接種環刮取一小環步驟（1)中活化的菌株接種到LB液體培養基50ml中， 在29?31°C、轉速為200?220rpm/min條件下培養10?14h，得種子液； (3) 、按照體積比為1?2%的比例將步驟（2)所得的種子液接入到黃豆餅澱粉粉培養 基中，在29?31°C、轉速為200?220rpm/min條件下培養48?60h，得到發酵液； (4) 、用水稀釋步驟（3)所得的發酵液，調節pH值至6. 6?6. 8,添加0. 02?0. 1 %的 苯甲酸鈉，即得微生物殺蟲劑；或者將步驟（3)所得的發酵液在4°C、轉速為5000rpm/min 條件下離心30min，取沉澱，得沉澱物，再用水稀釋沉澱物，調節pH值至6. 6?6. 8,添加 0. 02 %?0. 1 %的苯甲酸鈉，即得微生物殺蟲劑。
6. 按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其步驟（1)中所述的LB平板培養基或 LB斜面培養基的組成成分及其重量比例為：胰蛋白腖10g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，瓊脂 粉 15g，水 1L，ρΗ7· 2。
7. 按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其步驟（2)中所述的LB液體培養基的 組成成分及其重量比例為：胰蛋白腖l〇g，酵母提取物5g，氯化鈉10g，水1L，pH7. 2。
8. 按照權利要求5所述的製備方法，其特徵在於其步驟（3)中所述的黃豆餅粉培養基 的組成成分及其重量百分比為：黃豆餅粉2. 5%、棉籽餅粉1. 2%、玉米澱粉1. 5%、酵母粉 0· 5 %、ΚΗ2Ρ040· 03 %、MgS040 . 05 %，水 1L。
9. 權利要求1所述的蘇雲金芽孢桿菌菌株JQ23在防治眼蕈蚊科害蟲上的應用。
10. 按照權利要求9所述的應用，其特徵在於其所述的眼蕈蚊科害蟲是指韭菜遲眼蕈 蚊（Bradysia odoriphaga)〇
【文檔編號】A01P7/04GK104099277SQ201410338466
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年7月16日 優先權日:2014年7月16日
【發明者】杜立新, 宋健, 曹偉平, 馮書亮, 王金耀 申請人:河北省農林科學院植物保護研究所