胞外醛內酯酶的製作方法

2023-05-28 05:30:51

胞外醛內酯酶的製作方法
【專利摘要】本公開涉及通過使用嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶來水解己糖-δ-內酯。特別地，本公開涉及包含嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶的組合物及其使用方法。
【專利說明】胞外醛內酯酶[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請要求在2010年7月30日提交的美國臨時申請N0.61/369，358的優先權，所述申請在此以引用方式全文併入本文。
[0003]ASCII文本文件形式的序列表的提交
[0004]以下提交的ASCII文本文件形式的內容以引用方式全部併入本文:序列表的計算機可讀形式(CRF)(文件名:677792000640SeqList.txt，記錄日期:2011年6月20曰，大小:28KB)。
【技術領域】
[0005]本公開涉及通過使用嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶來水解己糖-δ -內酯。特別地，本公開涉及包含嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶的組合物及其使用方法。
【背景技術】
[0006]木質纖維素生物質為豐富的可再生資源，並且為潛在用於生產液體燃料和其他增值產物的原料(I)。生產木質纖維素衍生的生物燃料的主要障礙為化學預處理以及用於解聚的酶的高成本(2)。嗜熱真菌(嗜熱側孢黴,Sporotrichum thermophile)極快速地降解纖維素，並且以極其相同的速率代謝粉末狀纖維素和葡萄糖(3)。與得自嗜溫真菌絲狀真菌紅褐肉座菌(Hypocrea jecorina)(同物異名裡氏木黴(Trichoderma reesei))的那些水解酶的穩定性相比，得自所述這種有機體的水解酶的熱穩定性提供了實踐優點，例如在廣泛的PH範圍內具有高的酶活性，其中所述的嗜溫真菌絲狀真菌紅褐肉座菌(同物異名裡氏木黴(Trichoderma reesei))用於生產生物質降解酶。在纖維素底物上的生長過程中，嗜熱側飽酶分泌纖維素酶、半纖維素酶(4)、氧化酶(5)以及許多未知功能的蛋白質。
[0007]纖維二糖脫氫酶(CDH)為嗜熱側飽酶在纖維素上生長的過程中大量生產的胞外血-黃素蛋白(5)。許多纖維素分解真菌生產CDH(6)。所述的CDH將纖維二糖和較長的纖維糊精的還原末端氧化成相應的醛內酯(圖1)。對於所有纖維素分解微生物體而言，可以通過增加CDH和葡萄糖氧化酶的表達水平來改善得自纖維素的糖酸產率。
[0008]醛內酯或糖內酯在水性溶液中不穩定，並且發生水解從而形成相應的醛糖酸。未經催化的水解的程度和速率取決於特定的內酯、PH和溫度。葡糖酸-δ-內酯與葡糖酸之間的平衡常數為7.7，這有利於葡糖酸，並且在室溫和pH 5.0下，葡糖酸-δ-內酯在水中的半衰期為約I小時(10)。然而，儘管缺乏這種穩定性，但是諸如嗜熱側飽酶之類的真菌進化出催化糖內酯水解成它們相應的醛糖酸的酶。這種水解成醛糖酸增加纖維素隨後被纖維素分解酶(例如纖維素酶)水解的容易性。因此，糖內酯高效地轉化為醛糖酸可以對纖維素降解並由此對生物燃料的形成具有有利的影響(圖1)。
[0009]在磷酸戊糖途徑中，主要研究了糖內酯的酶水解(11-14)。在磷酸戊糖途徑中，葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脫氫酶轉化為6-磷酸-葡糖酸內酯。接著，該內酯被6-磷酸葡糖酸內酯酶(PGL)水解，從而形成6-磷酸葡萄糖，並最終轉化為核酮糖-5-磷酸。在大腸桿菌(Escherichia coli)的糖酵解缺陷株中，刪除PGL基因導致在葡萄糖上的生長嚴重受到抑制(15)，清楚地證明6-磷酸葡糖酸內酯的自發水解在體內是不足夠的。
[0010]已經報導了被分泌到多種真菌的培養物濾液中的醛內酯酶活性(16-17)。得自黑麴黴的醛內酯酶通過Bruchmann et al.純化(16)，並顯示為真菌纖維素分解系統的重要部分。然而，得自嗜熱側飽酶的胞外醛內酯酶尚未純化、鑑定或表徵。
[0011]在新興的生物燃料工業中，在高溫和酸性pH值下的反應對於植物細胞壁的多糖酶轉化為可發酵糖而言是重要的。高溫轉化降低了細菌汙染的風險，並且在高溫下酶通常具有較快的轉換。此外，由於汙染的風險降低，所以低PH也是有利的。最佳的是，纖維素酶在pH 4.8-5.0下工作，並且如果所有的酶具有相似的最佳pH使得它們可以同時使用，則可以使得所述的方法更簡單。因此，在本領域中重要的是具有由嗜熱真菌(例如嗜熱側飽黴)分離得到的熱穩定的酶，該酶在廣泛的PH值範圍內具有活性，從而用於水解在生物燃料原料植物細胞壁多糖轉化為可發酵糖的過程中生產的內酯。包含在廣泛的PH值範圍內具有醛內酯酶活性的組合物和方法將在木質纖維素的酶解聚中具有用途。
[0012]發明概述
[0013]本公開涉及具有保守模體和內酯酶活性(例如嗜熱側飽黴醛內酯酶I)的重組多肽、其變體和其片段。本公開還涉及包含多肽的組合物、以及包含這些組合物的食品添加劑，其中所述的多肽具有保守模體和醛內酯酶活性。此外，本公開涉及通過使用所述的組合物來水解含己糖的多糖或寡糖來製備內酯酸的方法，使生物質解構的方法，食品加工的方法，織物清潔的方法，以及紙漿漂白的方法。本公開還涉及包含重組多肽的宿主細胞、以及包含這些宿主細胞的組合物，其中所述的多肽具有保守模體和內酯酶活性。
[0014]因此，一方面提供含有GPRH 模體(SEQ ID NO: 9)和 DPTGxF/Y 模體(SEQ ID NO: 10)的重組多肽，其中所述的多肽具有內酯酶活性。在某些實施方案中，重組多肽含有SEQID NO:1的胺基酸序列。在某些實施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO:2的胺基酸序列。在某些實施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO: 3的胺基酸序列。
[0015]本發明的另一個方面提供了組合物，該組合物包含根據之前任意一個實施方案中所述的方面的重組多肽。在某些實施方案中，所述的組合物進一步包含至少一種另外的多肽。在可以與之前所述的實施方案結合的某些實施方案中，所述的至少一種另外的多肽為纖維二糖脫氫酶(⑶H)。在可以與之前所述的實施方案(其具有進一步包含至少一種另外的多肽的組合物)結合的其他實施方案中，所述的至少一種多肽為葡萄糖氧化酶(GOX)。
[0016]本發明的另一個方面提供了包含與調節序列可操作地連接的多核苷酸序列的表達載體，所述多核苷酸序列編碼根據之前所述的方面(其具有所述的重組多肽)的多肽。
[0017]本發明的另一個方面提供了組合物，該組合物包含根據之前所述的方面的表達載體。
[0018]本發明的另一個方面提供了宿主細胞，該宿主細胞包含根據之前所述的方面的表達載體。在某些實施方案中，所述的宿主細胞選自真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
[0019]本發明的另一個方面提供了組合物，該組合物包含根據之前在其任意一個實施方案中所述的方面的宿主細胞。
[0020]另一個方面提供了製備重組多肽的方法，包括:(a)提供包含載體的宿主細胞的群，其中所述的載體包含編碼多肽的多核苷酸序列，該多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，並且具有內酯酶活性；以及(b)在一定的條件下培養細胞群，其中在所述的條件下，由所述的表達載體的編碼序列所編碼的多肽得以表達。在某些實施方案中，多肽含有SEQ ID NO:1的胺基酸序列。在其他實施方案中，多肽含有SEQ IDNO:2的胺基酸序列。在某些實施方案中，多肽含有SEQ IDNO:3的胺基酸序列。在某些實施方案中，宿主細胞選自真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
[0021]另一個方面提供了製備醛糖酸的方法，包括:使己糖-δ -內酯底物與重組多肽接觸，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，並且具有內酯酶活性。在某些實施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO:1的胺基酸序列。在其他實施方案中，重組多肽含有SEQ ID NO:2的胺基酸序列。在某些實施方案中，重組多肽含有SEQIDNO:3的胺基酸序列。在某些實施方案中，己糖-δ -內酯底物選自纖維二糖酸-δ -內酯、葡糖酸-δ-內酯和內酯酸-δ- 內酯。
[0022]另一個方面提供了降解生物質的方法，包括:使所述的生物質與根據之前所述的方面的所述的組合物接觸，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ IDNO:10)，並且具有內酯酶活性。在某些實施方案中，組合物還包含⑶H。
[0023]另一個方面提供了使生物質解構的方法，包括:使所述的生物質與根據之前所述的方面的所述的組合物接觸，從而使所述的生物質解構，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO: 10)，並且具有內酯酶活性。在某些實施方案中，生物質含有植物材料。在可以與之前所述的實施方案結合的某些實施方案中，所述的植物材料選自:細葉芒、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆葦、小麥杆、大麥杆、加拿大稻草、燕麥稻、玉米稻、豆稻、燕麥皮、燕麥、高粱、稻殼、鹿洛、玉米纖維、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠、黃豆、可溶性酒精糟濾液(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹、針葉樹軟木、桉樹、樺木、柳樹、白楊、楊木、雜交楊木、能源甘鹿(energy cane)、短周期木本作物、作物殘茬、庭院廢物或其組合。
[0024]另一個方面提供了食品加工的方法，包含:將植物材料與根據之前所述的方面的所述的組合物接觸，從而產生可消化的植物材料，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，並且具有內酯酶活性。在某些實施方案中，可消化的植物材料餵養動物。
[0025]另一個方面提供了食品添加劑，該食品添加劑包含根據之前所述的方面的所述的具有重組多肽的組合物，其中所述的重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，並且具有內酯酶活性。
[0026]另一個方面提供了織物清潔的方法，包括:使弄髒的織物與根據之前的方面的所述的組合物接觸，從而產生清潔的織物，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)，並且具有內酯酶活性。
[0027]另一個方面提供了紙漿漂白的方法，包括:使紙漿與根據之前的方面的所述的組合物接觸，從而漂白的紙漿，其中所述的組合物具有重組多肽，該重組多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ IDNO:10)，並且具有內酯酶活性。[0028]附圖簡述
[0029]圖1提供了胞外糖氧化和內酯水解的機制的圖示。還原糖最初通過胞外氧化酶(包含葡萄糖氧化酶(GOX)和纖維二糖脫氫酶(⑶H))而被轉化為糖內酯。通過胞外內酯酶(圖框中)催化相應糖酸的轉化。在纖維素降解中，形成醛糖酸的這種轉化容易地進入到隨後的步驟中，並因此增加了生物燃料生產的效率。
[0030]圖2示出了嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I (Spothl I 109678)的胺基酸序列(SEQ IDNO:1)。戴帽的殘基表示信號肽，雙下劃線的區域表示所預計的N連接的糖基化位點，並且下劃線的區域表示通過LC-MS檢測的肽。圈起來的殘疾顯示出在醛內酯酶中是保守的。
[0031]圖3示出了嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶2 (Spothl I 89286)的胺基酸序列(SEQ IDNO:2) 0圈起來的殘疾顯示出在醛內酯酶中是保守的。
[0032]圖4示出了粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)內酯酶2 (NCU01743)的胺基酸序列(SEQ ID NO:3) 0圈起來的殘疾顯示出在醛內酯酶中是保守的。
[0033]圖5示出了使用4-15 % Criterion (Biorad)凝膠得到的經純化的重組Spothl 1109678 和 NCU07143 SDS-PAGE 分析結果。泳道 1:BenchmarkProtein 梯帶(在50kDa和20kDa處具有黑色條帶)，泳道2:在Pichia中表達的Spothl 1109678，泳道3:在Pichia中表達的Spothl 1109678 (5x稀釋的)，泳道4:在Pichia中表達的NCU07143,泳道5:在Pichia中表達的NCU07143 (5x稀釋的)。Spothl 1109678和NCU07143的表觀分子量分別為50-60kDa和約49kDa。
[0034]圖6示出了內源嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I的純化級份的SDS-PAGE分析結果。通過在含DTT的SDS緩衝液中沸騰使所述的級份變性。泳道I和7示出了蛋白質梯帶，泳道2示出了上清濃縮液粗品，泳道3示出了在除去纖維素結合單邊之後的上清液，泳道4示出了在Q HP離子交換色譜之後的上`清液，泳道5示出了在Mono Q離子交換色譜之後的上清液，以及泳道6示出了在PHE輸水作用色譜之後的上清液。
[0035]圖7示出了質譜的結果。經純化的完整嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶的解迴旋質譜示出了糖型之間的質樸差異為約162道爾頓。雙峰質量差為約20道爾頓。
[0036]圖8示出了使用3種不同的己糖-δ-內酯((a)葡糖酸-δ-內酯、(b)纖維二糖酸-δ-內酯、和(c)內酯酸-δ-內酯)作為底物，對嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I的動力學測試結果。
[0037]圖9示出了嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I的pH概況。在室溫下，使用IOnM醛內酯酶、50mM葡糖酸-δ -內酯和IOOmM緩衝液將所述的反應進行I分鐘。所用的緩衝液包含檸檬酸鈉，ΡΗ3.0 ;乙酸鈉，ρΗ4.0 ;乙酸鈉，ρΗ5.0 ;琥珀酸鈉，ρΗ6.0 ;HEPES，pH7.0 ;以及Tris，pH8.00誤差柱表不3個重複試驗的標準偏差。
[0038]圖10示出了具有其他醛內酯酶的嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I (Spothl I 109678)的多個序列比對。全黑圓圈表示在所預計的NC_cmle的活性位點處的殘基。ST_1為嗜熱側抱黴胞外醒內酯酶 I (Spothl 1109678 ；SEQID NO:1), PA_1 ;柄抱黴(Podospora anserina)醛內酯酶 I (XP_001910211.1 ；SEQ ID NO:4)，TR 為裡氏木黴(Trire2 | 55887 ；SEQ IDN0:5)，AN為黑麴黴(ΧΡ_659716.I ;SEQ ID NO:6)，ST_2為嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶2(Spothl|89286 ；SEQ ID NO:2)，EC_pgl 為大腸桿菌 6-磷酸葡糖酸內酯酶(ΝΡ_415288.I ；SEQ ID NO:7)，以及NC_cmle為粗糙脈孢菌順-羧基-粘康酸-內酯化酶(XP_957686 ；SEQID NO:8)。在所述的醛內酯酶中顯示具有2個保守的模體:GPRH模體(SEQ ID NO:9)(在嗜熱側孢黴醛內酯酶I中，胺基酸224-227)和DPTGxF/Y (SEQ ID NO:10)(在嗜熱側孢黴醛內酯酶I中，胺基酸182-187)。
[0039]圖11示出了各個序列的系統樹，其中所述的序列顯示出與嗜熱側孢黴醛內酯酶I具有序列相似性。列出了得自100個迭代的解靴帶值。(*)表示嗜熱側孢黴醛內酯酶1，表示以生物化學方式表徵的蛋白質，以及(▲)表示X射線晶體結構已經得到解釋的蛋白質。
[0040]圖12示出了在嗜熱側孢黴在補充有2%葡萄糖或2%纖維素的Vogel’s鹽上生長4天後收集的培養液中，嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I的特異活性。
[0041]圖13示出了嗜熱側孢黴在葡萄糖或纖維素上生長20小時之後,嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I和嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶2的表達概況。根據每百萬圖譜讀序中每千個鹼基轉座子的圖譜讀序數(RPKM)來歸一化。醛內酯酶I以淺灰色示出，醛內酯酶2以黑色示出。
[0042]定義
[0043]術語「胞外醛內酯酶」、「醛內酯酶」、「嗜熱側孢黴醛內酯酶1」、「嗜熱側孢黴醛內酯酶I」和「內酯酶」是指能夠催化aldonate和芳族內酯水解成相應的羧酸的酶(EC
3.1.1.17)。特別地，「醛內酯酶」使己糖-δ -內酯轉化為它們對應的醛糖酸。
[0044]術語「催化活性」或「活性」定量描述了給定底物在定義反應條件下的轉化情況。術語「特異活性」定量描述了在定義反應條件下每一定量的酶的催化活性。
[0045]如本文所用，術語「百分一致的」、「百分一致性」和「百分序列一致性」定義為在參照胺基酸或核酸序列與其他胺基酸或核酸序列之間的一致性的量。百分序列一致性可以通過比較2個最佳比對的序列來確定，其中與參照序列(例如所公開的核酸或胺基酸序列)相比，待比較的部分序列可以包含加入或刪除(即，間隔)，而所述的參照序列不包含加入或刪除，從而用於2個序列的最佳比對。所述的百分率通過以下方法計算:通過確定在兩個序列中一致的核酸或胺基酸殘基所形成的位置的數量以產生匹配位置的數量，再將匹配位置的數量除以待比較的位置的總數，並將結果乘以100從而得到序列一致性的百分率。當針對最大對應或設計區域進行比較和比對2個序列時，如果這2個序列中，相同胺基酸殘基或核酸的百分率是特定的(即，在特定區域上75%的一致的，或者在整個序列上並非特定時)，則這2個序列具有百分一致性，其中所述的最大對應或設計區域是使用以下序列比較算法或通過人工比對和視覺檢查而測量得到的。
[0046]適用於確定百分序列一致性的算法的一個實例為BLAST算法，其在Altschul etal.(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402中有所描述。用於實施BLAST分析的軟體可通過National Center for Biotechnology Information而為公眾利用。在以下情況下使用BLASTP程序，其中默認設定的字長為3，期望值(E)為10，BL0SUM62得分矩陣(參見Henikoff and Henikoff (1992) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 89:10915)比對(B)為 50，期望值(E)為10，M = 5，N = -4，以及雙鏈比較。對於核酸序列而言，BLASTN程序(用於核酸序列)使用默認字長(W)為11，期望值( E)為10，M = 5，N = -4，以及雙鏈比較。
[0047]發明詳述
[0048]以下說明書列出了大量示例性的構造、參數等。然而，應該認識到該說明書無意於限定本發明的範圍，而是作為示例性實施方案的描述而提供的。[0049]多肽
[0050]本公開涉及分離的多肽、其變體或其片段，所述的多肽具有保守的GPRH(SEQ IDNO:9)和/或DPTGxF/Y (SEQ ID NO: 10)模體，其中所述的多肽具有內酯酶活性。在一些實施方案中，多肽為胞外醒內酯酶。在一些優選的實施方案中，多肽為:胞外醒內酯酶，其包含SEQ ID NO:1的胺基酸序列；或胞外醛內酯酶的變體，該變體具有I至60個突變，同時保持了野生型嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I的活性(例如，SEQ ID NO:1的H177和R302)。在其他優選的實施方案中，多肽為:胞外醛內酯酶，其包含SEQ ID NO:2的胺基酸序列；或胞外醛內酯酶的變體，該變體具有I至60個突變，同時保持了野生型嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶2的活性(例如，SEQ ID NO:1的H177和R302)。在一些優選的實施方案中，多肽為胞外醛內酯酶，其包含SEQ ID NO:3的胺基酸序列；或其胞外醛內酯酶的變體，該變體具有I至60個突變，同時保持了野生型粗糙脈孢菌的內酯酶2的活性。在一些實施方案中，醛內酯酶與SEQ ID NO:1的序列一致性為至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75 %、優選至少80 %、優選至少85 %、優選至少90 %、優選至少95 %、優選至少99 %或者100%。在其他實施方案中，醛內酯酶與SEQ ID NO:2的序列一致性為至少50%、至少55%、至少60 %、至少65 %、至少70 %、至少75 %、優選至少80 %、優選至少85 %、優選至少90 %、優選至少95%、優選至少99%或者100%。在其他實施方案中，醛內酯酶與SEQ ID NO:3的序列一致性為至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、優選至少80%、優選至少85%、優選至少90%、優選至少95%、優選至少99%或者100%。
[0051 ] 在其他實施方案中，胞外醛內酯酶多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列通過插入或刪除一個或多個胺基酸殘疾和/或一個或多個胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基取代而與所述的SEQ ID NO:1的胺基酸序列不同。在其他實施方案中，胞外醛內酯酶多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列通過插入或刪除一個或多個胺基酸殘疾和/或一個或多個胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基取代而與所述的SEQ ID NO:2的胺基酸序列不同。在其他實施方案中，胞外醛內酯酶多肽包含胺基酸序列，該胺基酸序列通過插入或刪除一個或多個胺基酸殘疾和/或一個或多個胺基酸殘基被不同的胺基酸殘基取代而與所述的SEQ ID N0:3的胺基酸序列不同。在一些優選的實施方案中，胺基酸改變為:保守的胺基酸取代，其不會顯著地影響所述的多肽的摺疊和/或活性的；或者少量的刪除，通常為I至大約30個胺基酸。保守的取代的實例為在鹼性氨`基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性胺基酸(穀氨酸和天冬氨酸)、極性胺基酸(穀氨醯胺和天冬醯胺)、疏水性胺基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳族胺基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、及較小的胺基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸)的類別內進行。通常不會改變特異活性的胺基酸取代是本領域已知的。例如，最通常發生的取代為Ala變為Ser、Val變為lie、Asp變為Glu、Thr變為Ser、Ala 變為 Gly、Ala 變為 Thr、Ser 變為 Asn、Ala 變為 Val、Ser 變為 Gly、Tyr 變為 Phe> Ala變為Pro、Lys變為Arg、Asp變為Asn、Leu變為lie、Leu變為Val、Ala變為Glu、Asp變為Gly，以及保守的取代。
[0052]在一些實施方案中，胞外醛內酯酶多肽以重組方式生產，同時在其他方式中，所述的胞外醛內酯酶多肽以合成方式生產，或者由天然來源純化得到(例如嗜熱側孢黴)。
[0053]在其他實施方案中，胞外醛內酯酶胺基酸序列及衍生物作為N-和/或C-末端融合蛋白生產，從而例如有助於提取、檢測和/或純化，和/或向所述的胞外醛內酯酶加入功能性質。融合蛋白伴侶的實例包含但不限於穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)、6XHis、GAL4(DNA結合和/或轉錄活化結構域)、FLAG-、MYC-標記或本領域的技術人員公知的其他標記。在一些實施方案中，在融合蛋白伴侶與所關注的蛋白序列之間提供蛋白水解的裂解位點，從而可以除去融合蛋白序列。優選的是，所述的融合蛋白不會阻礙胞外醛內酯酶的活性。
[0054]在一些實施方案中，胞外醛內酯酶與功能結構域融合，其中所述的功能結構域包含引導肽、前肽、結合結構域和/或催化結構域。合適的結合結構域包含但不限於各種特異性的碳水化合物結合結構域(例如CBM)，從而在胞外醛內酯酶的應用過程中提供針對碳水化合物成分的增加的親和性。合適的酶活性結構域具有活性，該活性支持胞外醛內酯酶在生產所述的產物中的作用。催化結構域的非限定性實例包含:纖維素酶；半纖維素酶，例如木聚糖酶、內切甘露糖聚酶、外切甘露糖聚酶、葡聚糖酶、阿拉柏糖酶、半乳糖苷酶、果膠酶、和/或其他活性(例如蛋白酶、脂酶、酸性磷酸酶等或它們的功能片段)。融合蛋白通過連接體序列可任選地與醛內酯酶連結，其中所述的連接體序列在不會顯著地影響任何一種成分的條件下簡單地將胞外醛內酯酶與融合結構有連接起來，或者所述的連接體可任選地具有用於目的用途的功能重要性。[0055]備選地，本文所述的胞外醛內酯酶可用於連接一種或多種所關注的額外蛋白。所關注的蛋白的非限定性實例包含:半纖維素酶、α-半乳糖苷酶、β_半乳糖苷酶、乳糖酶、β -葡聚糖酶、內切_β -1，4-葡聚糖酶、纖維素酶、木糖苷酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、木聚糖乙醯酯酶、半乳聚糖酶、內切甘露糖聚酶、外切甘露糖聚酶、果膠酶、果膠酸酯裂解酶、果膠脂酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉柏糖酶、聚鼠李糖半乳糖醛酸水解酶、漆酶、還原酶、氧化酶、多酚氧化酶、木質素酶、蛋白酶、澱粉酶、磷酸酶、解脂酶、角質酶和/或其他酶。
[0056]載體和宿主細胞
[0057]為了製備真菌胞外醛內酯酶，可以由公開的序列以化學方式合成編碼所述的酶的DNA,或者有帶有所述的基因的宿主細胞直接得到該DNA (例如通過cDNA文庫篩選或者PCR擴增)。在一些實施方案中，胞外醛內酯酶多核苷酸包含在表達盒中，和/或通過標準的分子克隆技術而被克隆到合適的表達載體中。這種表達盒或載體包含有助於轉錄起始和終止(例如啟動子和終止子)的序列，並且通常包含選擇標記。
[0058]表達盒或載體被引入到合適的表達宿主細胞中，接著該細胞表達相應的胞外醛內酯酶多核苷酸。特別合適的表達宿主為細菌表達宿主菌屬，包含埃希氏菌(例如大腸桿菌)、假單胞菌屬(例如突光假單胞菌(P.fluorescens)或斯氏假單胞菌(P.stutzerei))、變形菌屬(例如奇異變形菌(Proteusmirabilis))、勞爾氏菌屬(例如真氧產鹼桿菌(Ralstonia eutropha))、鏈絲菌屬、葡萄球菌(例如肉糖葡萄球菌(S.carnosus))、乳酸球菌屬(例如乳酸乳球菌)、或芽孢桿菌屬(枯草芽孢桿菌(SUbtilis)、巨大芽孢桿菌(megaterium)、地衣芽孢桿菌(Iicheniformis)等)。此外，特別合適的為酵母菌表達宿主，例如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)、漢遜酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、或畢赤酵母(Pichia pastoris)。特別合適的為真菌表達宿主，例如黑麴黴、Chrysosporium lucknowense、麴黴屬(例如米曲菌(A.0ryzae)、黑曲菌、小巢狀曲菌(A.nidulans)等)、或裡氏木黴。此外，哺乳動物表達宿主也是合適的，例如小鼠(例如NSO)、中國倉鼠卵細胞(CHO)或幼倉鼠腎(BHK)細胞系。此外，其他真核生物宿主(例如昆蟲細胞)或病毒表達系統(例如細菌噬菌體(例如Ml3、T7噬菌體或Lambda)或病毒(例如杆狀病毒))也適用於製備胞外醛內酯酶。
[0059]在所關注的具體宿主中，與分泌蛋白有關的啟動子和/或信號序列為在該宿主或其他宿主中用於胞外醛內酯酶的異源生產和分泌的代表。例如，在絲狀真菌系統中，驅動纖維二糖水解酶I (cbhl)、葡糖澱粉酶A(glaA)、TAKA-澱粉酶(amyA)、木聚糖酶(exlA)、gpd-啟動子 cbhl、cbhl 1 > 內切葡聚糖酶基因 EG1-EGV > Cel61B、Cel74A、egll-egl5、gpd 啟動子、Pgkl、pki1、EF-1a、tefUcDNAl和hexl的基因的啟動子是特別合適的，並且可以由大量不同的有機體(例如黑曲菌、裡氏木黴、米曲菌、泡盛麴黴(A.awamori)和小巢狀曲菌)衍生得到。在一些實施方案中，胞外醛內酯酶多核苷酸以重組方式與編碼合適的同源或異源信號序列的多核苷酸結合，其中所述的信號序列使得胞外醛內酯酶被分泌到胞外(或周質)空間中，由此允許在細胞上清液(或周質空間或裂解物)中直接檢測酶活性。用於大腸桿菌、其他革蘭氏陰性細菌和本領域已知的其他有機體的特別合適的信號序列包含驅動HlyA、DsbA、Pbp、PhoA、PelB、OmpA、OmpT或M13噬菌體Gill基因表達的那些。對於枯草芽孢桿菌、革蘭氏陽性有機體和本領域已知的其他有機體，特別合適的信號序列進一步包含驅動 AprE、NprB、Mpr、AmyA、AmyE、Blac、SacB 表達的那些，並且對於釀酒酵母(S.cerevisiae)或其他酵母菌而言，所述的信號序列包含嗜殺毒素、BarU Suc2、交配因子a、InulA或Ggplp信號序列。信號肽序列可以通過大量的信號肽酶切割，由此將信號肽由所表達的蛋白的其餘部分中除去。在一些實施方案中，胞外醛內酯酶的其餘部分單獨表達，或者表達為與位於N-或C-末端的其他肽、標記或蛋白(例如6Xhis、HA或FLAG標記)融合形成的融合體。合適的融合體包含有利於親和純化或檢測的標記、肽或蛋白(例如6Xhis、HA、幾丁質結合蛋白、硫氧化還原蛋白或FLAG標記)，以及有利於目標物內切-β -甘露糖聚酶的表達、分泌或加工的那些。合適的加工位點包含腸激酶、STE13、Kex2或適用於體內或體外切割的其他蛋白酶切割位點。
[0060]胞外醛內酯酶多核苷酸通過大量的轉化方法被引入到表達宿主細胞中，包含但不限於電穿孔、脂質輔助的轉化或轉染(「脂質體轉染」)、化學介導的轉染(例如使用氯化鈣和/或磷酸鈣)、乙酸鋰介導的轉化(例如宿主細胞原生質體的乙酸鋰介導的轉化)、整體「基因槍」轉化、PEG-介導的轉化(例如宿主細胞原生質體的PEG-介導的轉化)、原生質體融合(例如使用原核或真核生物原生質體)、脂質體介導的轉化，以及農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)、腺病毒或其他病毒或曬菌體轉化或轉導。
[0061]備選地，胞外醛內酯酶在細胞內表達。可任選地，在所述的酶的變體在細胞內表達、或者在使用信號序列(例如上文所述的那些)而被分泌到周質空間之後，可以使用透化或溶解步驟來將胞外醛內酯酶釋放到上清液中。膜屏障的瓦解受到機械手段(例如超聲波、加壓處理(法壓)、空洞形成)的應用或者膜消化酶(例如溶解酶或酶的混合物)的應用的影響。進一步備選地，編碼胞外醛內酯酶的多核苷酸通過使用合適的不含細胞的表達系統表達。在不含細胞的系統中，通常藉助於啟動子來轉錄所關注的多核苷酸，但是連接從而形成環狀表達載體是可任選的。在其他實施方案中，RNA是在未轉錄的條件下外源加入或產生的，並在不含細胞的系統中翻譯的。
[0062]生物質形成單糖或寡糖的降解
[0063]本公開的胞外醛內酯酶和宿主細胞在多種工業應用中找到用途。例如，本文所公開的胞外醛內酯酶在生物燃料的生產、食品加工、織物清潔和紙漿漂白中具有用途。
[0064]生物燃料的製備
[0065]本公開的胞外醛內酯酶發現作為來自生物質(用於製備乙醇、丁醇、其他產物或中間體)的化學或發酵原料在在製備單糖、二糖和寡糖中的用途。胞外醛內酯酶可以為具有或不具有所除去的細胞的發酵液粗品形式，或者為半純化或純化的酶的製備物形式。備選地，本公開的宿主細胞在使用生物質的發酵過程中作為所述的變體的來源。
[0066]生物質可以包含但不限於植物材料、城市固體廢物和廢紙。植物材料包含但不限於細葉芒、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆葦、小麥杆、大麥杆、加拿大稻草、燕麥秸、玉米秸、豆秸、燕麥皮、燕麥、高粱、稻殼、蔗渣、玉米纖維、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠、黃豆、可溶性酒精糟濾液(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹、針葉樹軟木、桉樹、樺木、柳樹、白楊、楊木、雜交楊木、能源甘蔗、短周期木本作物、作物殘茬、庭院廢物或其組合。在生物質的初生細胞壁中，主要多糖為纖維素，第二最豐富的多糖為半纖維素，第三為膠質。此外，在所述的細胞停止生長之後生產的次生細胞壁也包含多糖，並且通過聚合木質素與半纖維素共價交聯而加強。纖維素為脫水纖維二糖的均聚物，因此為線性i3-(l_4)-D-葡聚糖，而半纖維素包含多種化合物，例如具有多種取代基的絡合支化結構形式的木聚糖、木葡聚糖、阿拉伯木聚糖和甘露聚糖。儘管纖維素通常為多形性，但是發現纖維素在植物組織中主要作為平行葡聚糖鏈的不溶性結晶基質。半纖維素通常與纖維素及其他半纖維素氫鍵鍵合，這有助於穩定細胞壁基質。
[0067]通過生物質的酶降解以及將釋放的糖轉化為乙醇來生產乙醇。這種乙醇通常被稱為生物乙醇或生物燃料。其作為燃料添加劑或混合劑在共混物為少於1%至至多100%(燃料取代物)。因此，本公開的胞外醛內酯酶在木質纖維素生物質的降解中在己糖-內酯中間體的降解中具有用途，從而 有助於由生物質釋放己糖單糖。由此，己糖單糖用於乙醇的生產。具體而言，本發明的胞外醛內酯酶與用於生產己糖醛糖酸(例如己糖酸、己二糖酸、己三糖酸、己四糖酸、己五糖酸和/或己六糖酸)的木質纖維素生物質接觸放置。在另一個優選的實施方案中，胞外醛內酯酶與用於植物材料更廣泛的水解的其他糖酶(例如葡聚糖酶、木聚糖酶、α -半乳糖苷酶和/或纖維素酶)結合使用。
[0068]食品加工
[0069]多種抗營養因子限定了特定植物材料在動物飼料和人類食品的製備中的用途。包含木質纖維材料(例如纖維素)的植物材料通常減少了動物對該材料的消化性。纖維素的負作用具體而言是由於β_(1，4)糖苷鍵，該鍵阻止許多動物將纖維素降解為葡萄糖。這些作用是通過使用纖維素降解酶(即，胞外醛內酯酶)而降低，這允許更高比例的植物材料被轉化為飼料，從而使得飼料的成本降低。此外，通過胞外醛內酯酶的活性，纖維素材料分解成較簡單的糖，這可以更容易地同化，從而提供額外的能量。因此，包含本公開的胞外醛內酯酶的組合物優選用於加工和/或製造食品或動物飼料。
[0070]本公開的胞外醛內酯酶可用作用於單胃動物(例如家禽和豬)的飼料及人類食品的添加劑。在一些實施方案中，胞外醛內酯酶可用於預處理所述的飼料而非作為飼料添加劑。在一些優選的實施方案中，胞外醛內酯酶被加入或用於預處理得自植物材料的飼料，其中所述的植物材料例如為黑麥、高粱、大米、蔗渣、玉米、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠或黃豆。
[0071 ] 在欲用於食品加工或作為飼料補充物的、包含胞外醛內酯酶的組合物中，該組合物可任選地包含其他取代物，例如著色劑、芳香化合物、穩定劑、維生素、礦物質、其他飼料或食品增強的酶等。這特別應用於所謂的預混合物。根據本發明的食品添加劑可以與其他食品成分結合，從而生產經加工的食品產物。所得的結合的食品添加劑以合適的量與其他食品成分(例如穀物或植物蛋白質)混合，從而形成經加工的食品產物。
[0072]織物清潔
[0073]本公開的胞外醛內酯酶在洗滌劑組合物中具有用途，從而有利於除去含內酯的汙點/汙物。在優選的實施方案中，胞外醛內酯酶在洗滌劑組合物中與其他酶結合使用，其中所述的酶選自澱粉酶、纖維素酶、脂酶、果膠酶、蛋白酶和內切葡聚糖酶。
[0074]包含胞外醛內酯酶的本公開的洗滌劑組合物為任何方便的形式(例如條、片、粉末、顆粒、糊狀物或液體)。液體洗滌劑通常是水性的，通常包含至多70%的水和0-30%有機溶劑，或非水性的成分。
[0075]洗滌劑組合物包含一種或多種表面活性劑(例如包含半極性的非離子表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和/或兩性離子表面活性劑)。表面活性劑通常以0.1重量％至60重量％的水平存在。當洗滌劑包含表面活性劑時，其通常包含約1%至約40%的陰離子表面活性劑，例如線性烷基苯磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、脂肪醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、α -磺基脂肪酸甲酯、烷基-或烯基琥珀酸、或者肥皂。當洗滌劑包含表面活性劑時，其通常包含約0.2%至約40%的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、乙氧基壬基酚、烷基多糖苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇醯胺、脂肪酸單乙醇醯胺、多羥基烷基脂肪酸醯胺、或葡萄糖胺(glucamide)的N-醯基N-烷基衍生物。`
[0076]洗滌劑組合物可任選地包含0-65%洗滌劑促淨劑或絡合劑，例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或烯基琥珀酸、可溶性矽酸鹽或層狀矽酸鹽。洗滌劑組合物可任選地包括一種或多種聚合物，例如羧甲基纖維素(CMC)，聚(乙烯吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)，聚羧酸鹽，例如聚丙烯酸鹽、馬來酸/丙烯酸共聚物、和月桂基甲基丙烯酸酯/丙烯酸共聚物。洗滌劑可任選地包含漂白系統(例如過氧化氫來源)，例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，其可以與形成過酸的漂泊活化劑(例如四乙醯乙二胺或壬醯氧苯磺酸鹽)結合。備選地，漂泊系統包含醯胺、醯亞胺或碸的過氧化物。
[0077]在洗滌劑組合物中，以相應於每升洗液0.01-1OOmg酶蛋白的量加入胞外醛內酯酶，優選的是每升洗液0.05-5mg酶蛋白，特別是每升洗液0.1-1mg酶蛋白。
[0078]紙漿漂白
[0079]本公開的胞外醛內酯酶在紙漿(例如化學紙漿、半化學紙漿、牛皮漿、機械紙漿或通過亞硫酸鹽方法製備的紙漿)的酶輔助的漂泊中具有用途。在一些實施方案中，紙漿為使用氧、臭氧、過氧化物或過酸漂泊的不含氯的紙漿。在一些實施方案中，胞外醛內酯酶用於紙漿的酶輔助的漂泊中，其中所述的紙漿是通過經修改的或連續的成漿方法生產的，其中所述的方法表現出較低的木質素含量。在一些實施方案中，胞外醛內酯酶單獨使用，或者優選地與木聚糖酶和/或內切葡聚糖酶和/或α-半乳糖苷酶和/或纖維二糖水解酶結合使用。
[0080]討論
[0081]嗜熱側胞黴為由土壤和自熱堆肥分離得到的嗜熱真菌(3)。證明嗜熱側胞黴極快速地降解纖維素。在本公開的研發過程中，與纖維素降解過程有關的酶是由嗜熱側胞黴分離得到的。如本文所公開那樣，包含胞外醛內酯酶活性的酶經純化、鑑定並由嗜熱子囊菌嗜熱側胞黴表徵。嗜熱側飽黴醛內酯酶在廣泛的pH值範圍內水解己糖δ-內酯。該酶在500C (用於生產所述的酶的生長條件)下的幾天內是穩定的。在不同的底物上測定嗜熱側胞黴醛內酯酶的表達概況和動力學參數。本文所公開的結果對嗜熱側胞黴在營養物(特別是由己糖S-內酯)的獲取中是如何使用醛內酯酶以及這種酶如何可以用於生物燃料的生產進行洞察。
[0082]之前已經參照6-磷酸葡糖酸內酯酶(PGL)活性描述了兩類進化不同的酶。通過與大腸桿菌的葡糖胺-6-磷酸異構酶NagB具有同源性的酶來催化真核生物和原核生物的PGL活性(11)。最近，在大腸桿菌中測定形成PGL活性的基因(13-14)。大腸桿菌PGL與NagB-樣PGL不具有序列相似性，並且與粗糙脈孢菌順-羧基-粘康酸-內酯化酶(CMLE)具有13%的序列一致性，其中所述的順-羧基-粘康酸-內酯化酶為與β-酮己二酸途徑有關的酶(32)。在全部的細菌和真菌中，大腸桿菌PGL的同源物是普遍存在的。在嗜熱側胞黴和其他子囊菌中，NagB-樣PGL在磷酸戊糖途徑中形成了 PGL活性，這是由於預計NagB-樣PGL是細胞內的，並顯示出與人類和酵母PGL具有約40%的序列一致性。有趣的是，除了NagB-樣PGL，許多子囊菌具有不同的大腸桿菌PGL同源物，預計該物質為胞外蛋白，該蛋白可以具有與磷酸戊糖途徑中的PGL的功能無關的功能。
[0083]如本文所公開的那樣，鑑定與大腸桿菌PGL具有低同源性的嗜熱側胞黴基因。在嗜熱側胞黴中，公開的嗜熱側胞黴基因編碼了行成胞外醛內酯酶活性的醛內酯酶I。如本文所述，由Spothl 1109678基因編碼的醛內酯酶I為糖蛋白，並且具有廣泛的pH適應性，這與粗糙脈孢菌CMLE所報導的pH概況相似`。醛內酯酶I表現出對己糖δ-內酯底物具有高活性，但是對戊糖Y-內酯不具有可檢測的活性。顯而易見的是，對葡萄糖、纖維二糖和乳糖的S-內酯而言，kMt/KM值僅具有3倍的差異，表明所述的酶僅與葡萄糖部分相互作用。這與纖維二糖脫氫酶和許多纖維素酶的底物特異性形成明顯的對比，通常，所述的酶對纖維二糖的親和性比對葡萄糖的親和性高很多(6，35)。對粗糙脈孢菌CMLE和大腸桿菌PGL的結構研究表明這些酶的活性位點是高度保守的，並且可能在所述的蛋白質的表面或附近(31)。表面暴露的活性位點符合本文所公開的動力學結果。
[0084]嗜熱側飽黴在木質纖維素生物質上生長過程中，其誘導了兩種大腸桿菌PGL-樣內酯酶的表達(如本文所公開的那樣，醛內酯酶I和醛內酯酶2)。粗糙脈飽菌的近期全基因組表達概況研究鑑別出NCU07143，其為與嗜熱側飽黴內酯酶具有序列同源性(與醛內酯酶I的同源性為24% ;與醛內酯酶2的同源性為67% )的蛋白質，其在木質纖維素和純纖維素上生長的過程中受到強的上調節(21)。此外，在纖維素和木質纖維素上生長的過程中，還在粗糙脈飽菌的分泌組中檢測到NCU07143，證明所述的酶也是胞外酶。嗜熱側飽黴醛內酯酶2與嗜熱側飽黴醛內酯酶I具有約28%的序列一致性。儘管它們的序列一致性低，但是在兩種嗜熱側飽黴內酯酶中，所有所預計的活性位點的殘基都是保守的，並且與任何其他所預計的原核生物內酯酶相比，它們彼此更密切相關。
[0085]此外，與粗糙脈飽菌和嗜熱側飽黴內酯酶具有序列相似性的基因也存在於黑麴黴和裡氏木黴中(16)。儘管酵母菌中通常缺乏胞外醛內酯酶-樣基因，但是該基因絲狀子囊菌中是普遍存在的。所有經測序的纖維素分解子囊菌與嗜熱側飽黴醛內酯酶I或醛內酯酶2都具有同源性。而且，針對目前經測序的擔子菌的基因組，BLAST查詢僅帶來具有低同源性的蛋白質，並且沒有蛋白質被預測是胞外蛋白。
[0086]近年來,在原核生物銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)中表徵了與嗜熱側飽黴內酯酶具有低序列同源性的周質葡糖酸內酯酶(PpgL) (33)。與真菌相似，銅綠假單胞菌包含NagB-樣細胞內PGL，其在磷酸戊糖途徑中提供醛內酯酶活性(12)。此外，顯示出刪除PpgL會導致在葡糖酸鹽、2-酮葡糖酸鹽和甘露醇上嚴重生長的顯型，並導致色素形成減少。然而，銅綠假單胞菌並非為纖維素分解菌，這樣PpgL並不涉及任何細胞壁的降解過程，從而強調內酯酶在新陳代謝中的多種作用。
[0087]簡言之，本文所述的嗜熱側飽黴醛內酯酶I的生物化學表徵提供了關於嗜熱側飽黴醛內酯酶I在水解己糖S-內酯中的用途的嚮導，其中所述的水解己糖δ-內酯作為降解用於隨後生產生物燃料的木質纖維素生物質的過程中的步驟。形成和使用本公開，作用機制的知識並非是必須的。
[0088]實施例1
[0089]材料和方法
[0090]材料.除了糖內酯以外，所有化學品均為試劑級品質，併購自商品供應商。糖內酯是通過經修改的Frush與Isbell方法合成的(18)。簡言之，在IOOmL冰冷的水中，將
0.015摩爾的糖、0.03摩爾的碳酸鈣和0.02摩爾的溴混合，並在室溫下在黑暗中存放24小時。通過使用氮氣將所得的溶液吹掃I小時來除去殘餘的溴。然後，件過量的碳酸銀加入到所得的溶液中，並通過過濾除去沉澱。接著，將含有糖內酯的濾液施加到離子交換樹脂IR-120(H+)上。使用5個柱體積的水洗滌柱，並收集含有糖內酯的洗脫液。然後，在55°C下，在旋轉蒸發儀上濃縮洗脫液。如下文所述，通過高效液相色譜法(HPLC)分析各種糖內酯的純度。
[0091]重組粗糙脈孢菌NCU07143和嗜熱側孢黴醛內酯酶I的克隆和純化.[0092]使用以下引物對來擴增NCU07143和Spothl | 109678:
[0093]NCU07143 限制性酶:KpnI 和 XbaI
[0094]NCU07143-正向:ATATATATGGTACCGCCACTTTGCTGGTTTCC (SEQ IDNO:11)
[0095]NCU07143-反向:
[0096]ATATATATTCTAGATTCTCTACCCAAACGACAGCACTAAG(SEQ ID NO:12)
[0097]Spothl I 109678 限制性酶:KpnI 和 XbaI
[0098]Spothl 1109678-正向:ATATATATGGTACCGCCCCGGTCTGTGGC(SEQ IDNO: 13)
[0099]Spothl I 109678-反向:
[0100]ATATATATTCTAGATTCTGCTTAAACGTGGCAAAGTTG(SEQ ID NO:14)
[0101]對於Spothl I 109678而言，由在Vogel’s基本培養基(其補充有2% (w/v)棉球)上生長的嗜熱側飽黴培養物分 離cDNA。
[0102]對於NCU07143而言，由在Vogel』 s基本培養基(其補充有2% (w/v)Avicel)上生長的嗜熱側飽黴培養物分離cDNA。
[0103]PCR產物經凝膠純化，並根據製造商的說明書，克隆到ZeiO BluntR TOPOκ載體中。使用KpnI和XbaI消化包含有所述的內酯酶的Ppicz a -A載體和TOPO載體。插入物和切開的載體經凝膠純化。然後，使用熱敏磷酸酶處理所述的載體。使用Τ4 DNA連接酶將插入物連接到Ppicz a -A中。接著,根據製造商的說明書,將具有正確的插入物的質粒轉化至丨J畢赤酵母(Pichiapastoris)中(Pichia EasySelect Expression Kit, Invitrogen,Carlsbad, CA)。根據 Pichia EasySelect Expression Kit 說明書，使用濃度為 0.5% (v/v)的甲醇誘導表達。
[0104]在使用甲醇誘導2天以後，收穫培養物。通過離心除去細胞，並將培養液濃縮，再使用切向流過濾而緩衝液更換至25mM Tris pH 8.0中。接著,在5mL Fastflow HisTrap柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)上，運行濃縮的培養上清液。使用處於25mM Tris pH 8.0和500mM NaCl中的200mM咪唑，由所述的柱洗脫重組蛋白質。經純化的蛋白質的SDS-PAGE示於圖5中。
[0105]重組嗜熱側孢黴醛內酯酶2 (Spothl I 89286)的克隆和表達.在48 °C下，在補充有2% w/v葡萄糖的Vogel ' s培養基上，使嗜熱側飽黴生長30小時。然後，通過過濾分離菌絲，在液氮中冷凍，再使用研和杵將菌絲磨成細粉。使用QiagenPlant DNEasy基因組DNA分離試劑盒，根據製造商的說明書對約IOOmg的粉末進行加工。使用以下引物，由基因組DNA擴增Spothl I 89286，其中所述的引物為:Spothl I 89286-正向(TACTTCCAATCCAATGCAATGT(SEQ ID NO:15))和 Spothl|89286-反向(CTCCCACTACCAATGCCCTGC(SEQ ID NO:16))。
[0106]將PCR產物經凝膠純化，並在25mM dCTP存在下，使用T4 DNA聚合酶處理從而形成粘性末端。使用SspI消化 pNeurA質粒,並經凝膠純化。接著,在25mM dGTP存在下,使用T4 DNA聚合酶處理質粒從而形成粘性末端。然後，將具有粘性末端的質粒和質粒混合在一起，並使得它們在22°C下退火5分鐘，然後轉化到化學感受態的大腸桿菌中。對多個克隆子進行測序，從而證明Spothl I 89286正確地插入到pNeurA中。按照之前所述，將包含Spothl I 89286的pNeurA轉化到組氨酸營養缺陷型粗糙脈孢菌中(19)。然後，針對GFP螢光，篩選能夠在缺乏組氨酸的培養基上生產的轉化子，從而證明生產出Spothl I 89286。一旦將轉化子與GFP —起分離，便將分生孢子接種到包含Vogel' s培養基瓊脂(其補充有2%w/v的蔗糖)的新鮮斜面上。使培養物在斜面上生長10天，然後接種到包含Vogel' s培養基(其補充有2% w/v的蔗糖)的液體培養物中。在液體培養物中生長2天之後，使用水洗漆菌絲，並轉移至補充有2% w/v乙酸鈉的Vogel' s培養基中，從而誘導Spothl 89286的表達。在乙酸鹽培養基上生長2天之後，收穫培養物，在0.2微米PES過濾器上過濾，從而除去任何殘餘的生物質，並使用具有10，000MWC0 PES膜的切向流過濾系統濃縮。
[0107]使用標準的葡糖酸內酯酶測試法證明對葡萄酸內酯的內酯酶活性(如在其他部分所述)。由於在粗糙脈飽菌中，通過內切蛋白酶除去了親和純化靶物，所以所述的蛋白未經進一步的純化。
[0108]用於純化內切嗜熱側飽黴醛內酯酶I的菌株和生長條件.嗜熱側孢黴ATCC菌株42464得自美國典型培養物保藏中心(American Type CultureCollection)。將嗜熱側飽黴保持在包含2%纖維二糖的Vogel』 s鹽瓊脂(20)上。由在48°C下生長7天的瓊脂平板上分離分生孢子(真菌孢子)。針對醛內酯酶誘導研究，將嗜熱側飽黴分生孢子接種到包含Voger S鹽的液體培養物(其補充有2%葡萄糖或纖維素)中，並在48°C下、在200rpm的搖動下生長。
[0109]內切嗜熱側飽黴醛內酯酶I的純化.對於醛內酯酶的純化,將嗜熱側飽黴分生孢子接種到包含1.0g/L酪蛋白胺基酸、1.0g/L酵母提取物、0.5g/L氯化鉀、0.2g/L硫酸鎂七水合物、1.0g/L磷酸二氫鉀和微量元素溶液的天然培養基中。在48°C下，使培養物在200rpm的搖動下生長24小時，然後通過過濾收穫真菌菌絲(真菌的營養菌絲部分)並用於接種新鮮的天然培養基(其包含5g/L纖維素(Avicelu PH 101, Sigma, St.Louis, MO))，以誘導醛內酯酶的表達。
[0110]在包含纖維素的天然培養基上生長48小時之後，通過在0.2微米聚醚碸(PES)過濾器上過濾除去嗜熱側飽黴菌絲和殘餘的纖維素。然後,濃縮經過濾的培養液,並使用IOkDa分子量的阻隔(MWCO)PES膜(Millipore，Billerica, MA)，通過切向流過濾而緩衝液更換至25mM 4-(2-羥乙基)-1-哌嗪基乙磺酸(HEPES)的緩衝液pH 7.4中。然後，將濃縮的培養液與過量的纖維素混合，從而除去纖維素-結合蛋白，並通過在玻璃微纖維過濾器上進行真空過濾來分離纖維素顆粒。然後，以5mL/min的速率將濾液加載到5mLQ Sepharose高效(Q HP)陰離子交換柱(GE Healthcare)上。接著,使用超過15個柱體積的、範圍在O至0.5M NaCl的氯化鈉(NaCl)線性濃度梯度，由Q HP柱上洗脫醛內酯酶。然後，收集柱的級份，並測試形成的醛內酯酶活性(參見上文)。將具有最高的醛內酯酶活性的級份合併，並緩衝液更換至25mM HEPES緩衝液pH 7.4中。隨後，將包含蛋白質的各個級份加載至Mono Q? 10/100GL高效陰離子交換色譜柱(GE Healthcare)上，並使用超過8個柱體積的、範圍在O至0.5M NaCl的NaCl線性濃度梯度進行洗脫。將包含醛內酯酶活性的分級合併，並調節至1.5M硫酸銨和25mM HEPES, pH 7.4。然後，將各個樣品加載至
1.0mL RES0URCE?PHE輸水相互作用色譜柱(GE Healthcare)上。醛內酯酶不會與PHE柱結合，因此作為純的物質種類流過。濃縮經純化的醛內酯酶，並使用IOkDaMWCO離心濃縮儀(Millipore)進行緩衝液更換，`並存放在_80°C下。在這些條件下，醛內酯酶的活性能穩定數月。
[0111]酶的測試.如Hestrin所述測量醛內酯酶的活性(21)。在96孔微量滴定板上以3個重複實施所述的反應。簡言之，在25°C下，將IOOyL IOOmM新溶解的糖內酯與在IOOmM乙酸鈉pH 5.0中緩衝的100 μ L IOnM醛內酯酶混合I分鐘。通過在I分鐘內加入40 μ L鹼性羥胺(2.0M鹽酸羥胺，1.5Μ氫氧化鈉)使所述的反應淬火。然後，加入20微升4.0M鹽酸以酸化所得的溶液，並使糖氧肟酸鹽穩定。通過加入20 μ L 0.5Μ氯化鐵(FeCl3)顯色，並在540nm下測量吸光率。對於所有的實驗而言，在對照樣品上進行對照測量，其中所述的對照樣品中未加入酶。在酶存在下，由總水解中減去背景水解。這通常達到總內酯的不到10%。
[0112]質譜肽指紋圖譜.將36毫克脲、5 μ L IOOmM DTT和5 μ L 1.0Μ Tris (pH 8.5)加入到10 μ M醛內酯酶的100 μ L水性溶液中，並在70°C加熱I小時。在熱變性之後，將700 μ L25mM重碳酸銨和140 μ L甲醇加入到所述的溶液中，然後使用處於50mM乙酸鈉(pH 5.0)的50yL 100yg/mL胰島素處理。在37°C下，將所得的蛋白質用胰島素過夜消化。消化後，採用真空濃縮儀減小體積，並用經純化的去離子水洗滌3次。通過OMIX?微提取吸管尖端，根據製造商的說明書來除去樣品中殘餘的鹽(Varian，PaloAlto, CA)。使用串聯質譜來分析得自胰島素消化的肽，其中所述的串聯質譜與所述的超高效液相色譜在線連接(22)。
[0113]蛋白質的液相色譜-質譜分析.使用1200系列液相色譜(LC ;Agilent, SantaClara, CA)來分析蛋白質樣品，其中所述的1200系列液相色譜與裝配有1n Max?電噴霧離子源(ESI ；Thermo Fisher Scientific, Waltham,MA)的 LTQ Orbitrap XL? 雜交質譜在線連接。
[0114]LC 裝配有 C8 保護柱(Poroshell 300SB-C8，5 μ m，12.5 X 2.1mm，Agilent)、分析柱(75X0.5mm)和100 μ L樣品環。LC溶劑A包含0.1 %甲酸/99.9%水(ν/ν)，溶劑B包含0.1%甲酸/99.9%乙腈(ν/ν)。將在使用橡膠隔墊蓋密封的自動進樣器樣品瓶中所裝有的樣品溶液在分析之前加入到Agilent 1200自動進樣器的樣品倉中。對於各樣品而言，將約100皮摩爾的蛋白質分析物注入到所述的柱上。在注入樣品之後，在5分鐘內，使用99.5%溶劑A，以90μ L/min的流動速率進行分析物的誘捕。洗脫程序包括:經歷24.5min，線性濃度梯度範圍為30%至95%的溶劑B;在等強度條件下，在95%溶劑B中溫育5分鐘；經歷
0.5min，線性濃度梯度範圍為0.5 %溶劑B的溶劑B ;在等強度條件下；以及在等強度條件下，在0.5%溶劑B中以90 μ L/min的流動速率溫育9.5min。將所述的柱和樣品倉分別保持在35°C和10°C下。僅包含經純化的、去離子水的空白溶劑在樣品之間運行，並在注入各樣品之後使用經純化的、去離子水漂洗自動進樣器注入針以避免樣品間的交叉汙染。
[0115]使用PEEK? 管(0.005」1.d.X 1/16」 0.d., Western Analytical, LakeElsinore,CA)來形成LC柱的出口與質譜的ESI探針之間的連接。在分析之前，使用包含咖啡因、肽MRFA和Ultramark丨62廠混合物的標準LTQ MS校正混合物來進行外標質量校正，其中所述的Ultramark丨62 I '!浞合物為氟化磷腈溶解於51 %乙腈/25 %甲醇/23 %水/I %乙酸溶液(ν/ν)中。ESI源的參數如下:離子遷移毛細溫度為275 °C，常態鞘氣(氮氣)流動速率為25%，ESI電壓為2.5kV，離子遷移毛細電壓為33V，以及套管透鏡電壓為125V。使用Orbitrap?質量分析儀(以圖譜格式，其中全MS自動增益控制靶物設定為5X105電荷，解析度設定為6XlO4(m/z = 400，FWHM))，在m/z = 500至2000的範圍內，以正離子模式記錄質譜。使用Xcalibur?軟體(4.1版，Thermo),處理原始質譜,並使用ProMassu軟體(2.5SR-1版，Novatia, Monmouth Junction, NJ)對測量的電荷狀態分布去卷積,其中所述的ProMass?軟體使用了預設「大蛋白」參數並且背景差因子為1.5。
[0116]天然蛋白質的納升電噴霧質譜.使用裝配有Z-spray"電噴霧(ESI)源(Q-TofPremier?, Waters, Milford, MA)的四極杆-飛行時間(Q-Tof)質譜來獲取天然蛋白質的質樸。使用正離子納升電噴霧(nanoESI)由包含10 μ M分析物蛋白質和IOmM乙酸銨的水性溶液形成離子。由硼娃玻璃毛細管(1.0mm 0.d./0.78mm 1.d, Sutter Instruments,Novato, CA)來形成NanoESI發射器,其中所述的毛細管被Flaming/Brown微電極控制儀(Model P-87，Sutter)控制在內直徑為約5至20 μ m的尖端。使用10 μ L注射器(Hamilton，Reno, NV)將約10 μ L的各種樣品溶液加入到nanoESI發射器中。通過逐漸增加施加到鉬絲(0.127mm直徑,Aldrich, Milwaukee, WI)上的DC電動勢、直到質譜信號開始出現來開啟電噴霧，其中所述的鉬絲被插入到nanoESI發射器的尖端約2mm內。在數據收集過程中的設備參數如下:nanoESI電壓為1.8kV，取樣錐電壓為30V，提取錐和離子導向電壓均為4.0V,離子源溫度為80°C，進入到氬光電池的加速電壓為2V，離子遷移級電壓為6X10_3mbar，IS光電池電壓為8Xl(T3mbar,以及Tof分析儀電壓為8Xl(T7mbar。通過調節￡；(1\\^_丨也1{>Speedivalve真空值將一級泵中的電壓增加7.4mbar，從而有利於氣相中非共價絡合物的保存。未使用錐氣流。在「V」模式下操作Tof分析儀。在測量之前即刻進行Tof分析儀的外標質量校正。使用MassL ynx?軟體(4.1版，Waters)處理質譜。
[0117]多序列比對以及系統發生學.針對由已經完成及正在進行的真菌基因組項目得到的預測真菌蛋白質的資料庫，使用基礎定點比對搜尋工具(BLAST ;23)查詢醛內酯酶序列來找到嗜熱側飽黴醛內酯酶蛋白質的同源基因。通過BLAST，針對美國國立生物技術信息中心(National Center forBiotechnology Information(NCBI))的資料庫得到原核生物的序列。使用T-COFFEE多序列比對軟體，定點進行多序列比對(24)。使用3.0版的PHYlogenetic Inferences Using Maximum Likelihood(PhyML)軟體測定最大概似法的系統發生學(通過Phylogeny.fr網頁伺服器具有100個解靴帶(25))。
[0118]mRNA-Seq表達概況.在生長20小時之後，由嗜熱側飽黴分離信使RNA，並按照標準的方案根據製造商的說明書來形成Illmnina? cDNA文庫(26)。在Illumina.1 GenomeAnalyzer II高通量測序系統上進行測序。序列讀取長度修整為31nt，並使用MAQ基因組短序列讀取比對軟體，針對嗜熱側飽黴基因組中的所有預測的轉錄物進行繪圖(27)。通過計算每千個外顯子模式的鹼基對所繪製的讀取數量除以在整個數據組RPKM中繪製讀取的總數來對表達進行歸一化(28)。圖譜必須使31-nt mRNA序列與由基因組序列通過計算確定的預測全長mRNA序列匹配。如果基因是聞表達的，則存在由Solexa測序(其與所述基因序列匹配)而生成的許多片段。相反，如果基因表達水平低，則極少的Solexa讀值與所述的基因序列匹配。
[0119]結果
[0120]編碼嗜熱側孢黴胞外醛內酯酶I的基因的長度為1，491鹼基對，並包含3個內含子。開放閱讀框的長度為1，206鹼基對，並編碼了 401個胺基酸的多肽，該多肽的計算質量為42，509Da。此外，還具有3個所預計的N-連接糖基化位點(30)。事實上，在所預計的糖基化區域中未檢測到肽，因此提供了 N-連接的糖基化的證據。
[0121]重組嗜熱側孢黴醛內酯酶I的純化和性質.圖5示出了純化蛋白質的SDS-PAGE分析。醛內酯酶的表觀分子量為50-60kDa，並且重組酶與下文所述的經純化的內源蛋白質具有相似的活性。
[0122]重組嗜熱側孢黴醛內酯酶I的純化和性質.由在豐富培養基上生長的嗜熱側飽黴的培養液中分離嗜熱側飽黴醛內酯酶活性，其中所述的豐富培養基包含纖維素作為碳源。分5步進行嗜熱側飽黴醛內酯酶的純化(表1)。將醛內酯酶純化25倍，總產率為25%。2個重要的純化步驟為Q HP離子交換色譜和PHE疏水相互作用色譜。經純化的醒內酯酶的SDS-PAGE表明分子量為約48kDa(圖6)。完整的醛內酯酶的液相色譜-質譜(LC-MS)分析顯示多種物質集中在約44kDa，並且質量差為約162道爾頓，這與己糖亞基的質量相當(圖7)。該結果表明蛋白質糖基化的存在，其為真菌分泌的胞外蛋白質中普通的翻譯後修飾。在IOmM乙酸銨中醛內酯酶的天然蛋白質LC-MS分析表明所述的蛋白質在溶液中為單體，這符合凝膠過濾的停留時間。
[0123]表1.內源嗜熱側孢黴醛內酯酶I的純化.[0124]
【權利要求】
1.一種重組多肽，包含 GPRH 模體(SEQ ID NO:9)和 DPTGxF/Y 模體(SEQ ID NO:10),其中所述多肽具有內酯酶活性。
2.權利要求1所述的重組多肽，包含SEQID NO:1的胺基酸序列。
3.權利要求1所述的重組多肽，包含SEQID NO:2的胺基酸序列。
4.權利要求1所述的重組多肽，包含SEQID NO:3的胺基酸序列。
5.包含權利要求1-4中任一項所述的重組多肽的組合物。
6.權利要求5所述的組合物，還包含至少一種另外的多肽。
7.權利要求6所述的組合物，其中所述至少一種另外的多肽是纖維二糖脫氫酶(CDH)。
8.權利要求6所述的組合物，其中所述至少一種另外的多肽是葡萄糖氧化酶(GOX)。
9.一種包含與調節序列可操作地連接的多核苷酸序列的表達載體，所述多核苷酸序列編碼權利要求1-4中任意一項所述的多肽。
10.一種包含權利要求9所述的表達載體的組合物。
11.一種包含權利要求9所述的表達載體的宿主細胞。
12.—種包含權利要求11所述的宿主細胞的組合物。
13.權利要求11所述的宿主細胞，其中所述的宿主細胞選自真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
14.一種製備重組多肽的方`法，包括: (a)提供包含載體的宿主細胞群，其中所述的載體包含編碼多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO: 10)，並且其中所述多肽具有內酯酶活性；以及 (b)在一定條件下培養所述細胞群，由此所述載體的所述多肽得以表達。
15.權利要求14所述的方法，其中所述多肽包含所述SEQID NO:1的胺基酸序列。
16.權利要求14所述的方法，其中所述多肽包含所述SEQID NO:2的胺基酸序列。
17.權利要求14所述的方法，其中所述多肽包含所述SEQID NO:3的胺基酸序列。
18.權利要求14-17所述的方法，其中所述宿主細胞選自真菌細胞、酵母細胞、細菌細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞。
19.一種製備醛糖酸的方法，包括:使己糖-δ-內酯底物與包含GPRH模體(SEQ ID NO:9)和DPTGxF/Y模體(SEQ ID NO:10)的重組多肽接觸，其中所述多肽具有內酯酶活性。
20.權利要求19所述的方法，其中所述重組多肽包含所述SEQID NO:1的胺基酸序列。
21.權利要求19所述的方法，其中所述重組多肽包含所述SEQID NO:2的胺基酸序列。
22.權利要求19所述的方法，其中所述重組多肽包含所述SEQID NO:3的胺基酸序列。
23.權利要求19-22所述的方法，其中所述己糖-δ-內酯底物選自纖維二糖酸-δ -內酯、葡糖酸-δ_內酯和內酯酸-δ -內酯
24.一種降解生物質的方法，包括:使所述生物質與權利要求5-8、10或12所述的組合物接觸。
25.一種使生物質解構的方法，包括:使所述生物質與權利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而使所述生物質解構。
26.權利要求25所述的方法，其中所述生物質包含植物材料。
27.權利要求26所述的方法，其中所述植物材料選自細葉芒、柳枝稷、大米草、黑麥草、草蘆、蘆華、小麥杆、大麥杆、加拿大稻草、燕麥稻、玉米稻、豆稻、燕麥皮、燕麥、高粱、稻殼、蔗渣、玉米纖維、大麥、燕麥片、亞麻、小麥、亞麻籽、桔漿、棉籽、花生、油菜籽、向日葵、豌豆、羽扇豆、棕仁、椰子、魔芋、刺槐豆膠、瓜爾膠、黃豆、可溶性酒精糟濾液(DDGS)、須芒草、玉米穗、松樹、針葉樹軟木、桉樹、樺木、柳樹、白楊、楊木、雜交楊木、能源甘蔗、短周期木本作物、作物殘茬、庭院廢物或其組合。
28.一種食品處理方法，包括:使植物材料與權利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而產生可消化的植物材料。
29.權利要求28所述的方法，其中所述可消化的植物材料餵養動物。
30.一種食品添加劑，包含權利要求5-8、10或12所述的組合物。
31.一種織物清潔方法，包括:使弄汙的織物與權利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而產生清潔的織物。
32.—種紙漿漂白方法，包括:使紙漿與權利要求5-8、10或12所述的組合物接觸，從而產生漂白的紙漿。
【文檔編號】C12P7/58GK103562400SQ201180033714
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2011年6月23日 優先權日:2010年7月30日
【發明者】W·T·畢森, J·H·多納凱特, M·A·馬萊塔 申請人:加州大學評議會