低聚原花青素(opc)的分析方法

2023-05-28 05:27:51

專利名稱：低聚原花青素(opc)的分析方法
技術領域：
本發明涉及一種用於測定分析物或待分析樣品中含有的低聚原花青素(黃烷-3-醇的n-聚體混合物的總稱，n≥2)的方法，所述的分析物或待分析樣品例如是天然物質、食品和飲料、醫藥品和/或化妝品等。
背景技術：
原花青素(OPC)據稱是「法蘭西悖論」的有效成分之一，因為在酒中也含有該物質(1995，Clin.Chim.Acta.235，207-219)。原花青素已知的醫學效果有抗氧化活性、末梢循環改善活性、血液流動改善作用、肝功能改善作用(2004，Japan Food Science，403，一月刊，40-45)以及血小板凝集抑制作用(官方出版的專利公報2003-527418)。因此，需要開發方便的定性和定量測定OPC這種活性成分的方法。
分析原花青素的已知方法包括高效液相色譜-質譜法(LC-MS)的反相HPLC法(2003，Biosci.Biotechnol.Biochem.，67，(5)，1140-1142)和LC-MS的梯度洗脫的正相HPLC(2003，J.Agric.Food Chem.，51，7513-7521)。然而，這兩種方法都需要質譜檢測器，沒有一種方法被認為是方便的。此外，由於原花青素的組分黃烷-3-醇類的立體異構化，原花青素以許多立體異構體形式存在。可用作標準物質的化合物存在局限性。因此，除了一些已知化合物，不可能對原花青素進行定量分析。此外，自然界中的原花青素以從單體的黃烷-3-醇到二聚體、三聚體、進一步到更高聚合度的n-聚體形式存在。反相HPLC分析顯示黃烷-3-醇(單體)、其二聚體以及三聚體的峰重疊。
如上所述，沒有定性和定量測定OPC的簡便方法。

發明內容
在這種情況下，本發明者著重於開發一種新的分析方法，該方法可測定天然物質、食品、飲料和藥品中所含的n-聚體的含量以及豐度，而不受來自於黃烷-3-醇單體的幹擾。因此，本發明的目的是提供一種用於測定分析物如天然物質、食品和飲料中含有的OPC的新方法。


圖1顯示兒茶素、黃烷-3-醇二聚體和三聚體的正相HPLC分析結果。
圖2顯示混合了兒茶素和原花青素的分析物的正相HPLC分析結果。
發明效果本發明者進行了各種研究試圖解決前述問題。結果從實驗和分子量的角度闡明了(a)水解低聚原花青素(OPC)產生的花青素量總是n/2，而與OPC中含有的黃烷-3-醇的聚合度n的大小無關。該結論使得他們研究出OPC測定的簡便方法。本發明者進一步發現了意想不到的事實(b)使用正相柱高效液相色譜法可容易地實現迄今為止使用色譜法很難分離的不同聚合度n的黃烷-3-醇聚合物的分離。
本發明的方法利用上述事實(a)和/或事實(b)以簡便的方式分析天然物質、食品和飲料、醫藥品和/或化妝品中的低聚原花青素(OPC)的量，以及分析OPC中n-聚體的比例和/或含量。
根據本發明的方法，可以分析低聚原花青素(OPC)而不受低聚原花青素中經常含有的黃烷-3-醇單體的幹擾。
此外，本發明的方法可以測定分析物中低聚原花青素的各種聚合物的黃烷-3-醇聚合物而不需要質譜儀。因此，本發明的方法非常適宜分析天然物質、食品和飲料、醫藥品和/或化妝品中的低聚原花青素。
最佳實施方式本發明的方法適用的分析物是可能含有黃烷-3-醇的n-聚體(n≥2)的混合物(下文稱為低聚原花青素或OPC)的任意樣品，如天然物質(葡萄籽、羅望子果、蘋果、樹皮、松樹皮衍生的多酚、茶葉、可可等，和/或它們的處理產品(提取物等))、食品和飲料、醫藥品和/或化妝品。
低聚原花青素通常包括至少一種如下通式表示的化合物 結構式1 結構式2 結構式3 結構式4 n＝0-18的整數，n1＝1-18的整數，n2＝0-18的整數，以及R＝H或OH。
本發明尤其適用於包括至少一種下述原花青素類的上述低聚原花青素結構式1的原花青素B1、B2、B3和B4，其中n＝0；結構式2的原花青素B5、B6、B7和B8，其中n1＝0和n2＝0；以及結構式1的原花青素C1、C2和C4，其中n＝1。上述B1、B2......、C1、C2......是各個化合物的立體異構體。主要的原花青素、OPC和兒茶素的結構如下所示。兒茶素 PB7(兒茶素-4α，6-兒茶素) PB1(表兒茶素-4β，8-兒茶素)PB2(表兒茶素-4β，8-表兒茶素) PB3(兒茶素-4α，8-兒茶素) PB5(表兒茶素-4β，6-表兒茶素)
(1)OPC總量的測定根據本發明，無需考慮分析物中低聚原花青素(OPC)含有的黃烷-3-醇聚合物的類型和聚合度，當測定水解OPC產生的花青素時，從測得值可以測定OPC的總量。本發明的方法可以按照下列順序進行OPC的水解可以在酸性條件下通過熱分解進行低聚原花青素的水解。優選的條件包括例如使用酸/低級醇混合物作為酸性條件，所述酸優選是鹽酸、硫酸或硝酸，所述低級醇優選是丙醇、丁醇、戊醇和/或異戊醇。熱分解可以在溫度50-100℃，優選80-100℃，更優選85-95℃下進行，反應時間為30分鐘或更長，優選1小時或更長。所述酸的濃度選自0.1-2N，更優選0.4-1N。
進行水解時，如果分析物是含有低濃度的低聚原花青素的液體樣品，那麼可使用適當的方法濃縮樣品，例如凍幹或在減壓條件下固化至乾燥。
將所述分析物(包括其濃縮物)溶解於上述酸/低級醇混合物中，其濃度為0.01-1％，優選0.05-0.2％(O.5-2mg/ml)，由此進行水解。
水解的具體例子如下在玻璃試管中，將含有原花青素的樣品(0.5mg)溶解於1ml 0.6N的HCl/丁醇中，所得溶液在90℃的水浴中靜置2小時。反應完成後，使用UV-265(Shimadzu Corp.)量700-400nm的吸收光譜。測量551nm處的吸光度證實水解反應是否進行完全而產生花青素。
花青素量的測量可通過任意公知方法測量水解產生的花青素量，例如，可容易地通過高效液相色譜法或吸光度法完成。吸光度法可以使用未處理的水解產物，並優選測量550-552nm的吸光度，在此波長處，花青素在可見吸收光譜圖中顯示最大吸收。在此波長處，低聚原花青素水解產生的花青素以外的組分(例如，兒茶素最大吸收波長270nm)的影響可以忽略。
HPLC方法的例子具體描述如下使用HPLC柱YMC-ODS-A312(6mm×150mm，YMC)，乙酸∶甲醇∶水＝15∶17.5∶67.5的混合物1ml/min，柱溫40℃，檢測A520nm的面積值以測定花青素。氯化氰定、氯化翠雀定和氯化天竺葵色素(均獲自Funakoshi)可用作標準物質。這些標準物質的保留時間各不相同，其混合物或選自其中的任意一種可用作標準物質。對於HPLC柱，不僅上述C18基樹脂，而且C8-、C30-或聚合物基C18樹脂都可以進行相似的分析，只要其是反相樹脂。
OPC總量的計算基於上述測定的花青素量，測定分析物中低聚原花青素的量，使用如下方法a)通過水解一個n-聚體產生的花青素量為n/2，而與OPC中含有的黃烷-3-醇聚合物的聚合度n的大小無關。基於這一事實，水解產生的花青素量乘以係數2，可以得到預定量的分析物中例如以mg計的OPC總量。或者，(b)水解OPC產生的花青素量與OPC的總量成比例，而與OPC中含有的黃烷-3-醇聚合物的聚合度n的大小無關。基於這一事實，將水解產生的花青素量與水解已知量的OPC標準物質產生的花青素量相比較，可通過校正曲線或下述公式測定分析物中OPC的總量(例如，以mg計)和/或分析物中OPC的比例(a％)OPC總量(mg)＝(樣品的測量值/標準物質的測量值)×標準物質的量(mg)(公式1)分析物中OPC的比例(a％)＝(OPC總量(mg)/分析物的量)×100 (公式2)使用的適宜標準物質可選自原花青素B1和原花青素B2(兩者均獲自Funakoshi)。
(2)組成OPC的每種n-聚體的分析在本發明特別優選的實施方案中，除了在上述(1)中測定預定重量的分析物中的OPC總重量之外，或者獨立於上述測定，可使用高效液相色譜法(HPLC)測定出OPC中各種黃烷-3-醇聚合物的比例。通過如此做法，本發明還提供了一種新的OPC測定方法，該方法測定了預定重量的分析物中含有的、具有不同聚合度n的各種聚合物的重量。
高效液相色譜法中使用的柱優選是正相柱，特別優選填裝有矽膠基樹脂的正相柱。本發明者的研究表明，具有不同聚合度(在此情況下，也包括n＝1)的原花青素可以通過色譜法在正相柱上十分滿意地分離為各個組分。從黃烷-3-醇類具有高極性的事實判斷，到目前為止，人們仍然認為正相柱不能分離黃烷-3-醇類。此外，本發明的方法能使用紫外檢測器進行測量，而不需要質譜檢測器。
高效液相色譜法的條件可以根據需要確定。具體而言，例如使用色譜柱Inertsil SIL(4.6mm×150mm，GL Sciences Inc.)，洗脫液例如是己烷、甲醇、四氫呋喃和甲酸的混合物。優選使用己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝45∶40∶14∶1進行等度洗脫(約1ml/min)。使用己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝40-60∶30-50∶10-20∶0.1-5甚至可以在0.3-1.5ml/min的流速下進行分析。柱溫為10-60℃，優選40℃，檢測器優選是光電二極體陣列檢測器(PDA)，用於採集240-400nm的光譜數據。這是由於OPC在280nm具有最大吸收，但當樣品與其他多酚類混合時，280nm以外波長處的不同峰構成了最大吸收，因此有可能將OPC與其他多酚類區別開並排除它們。然而，當僅可以使用單波長檢測器的情況下，可以只使用A280nm的吸收進行分析。
使用色譜法分離的所有聚合物的總峰面積(所有聚合物包括二聚體或更高聚合度的聚合物)是在280nm處具有最大吸收的A280nm峰的面積值總和。所使用的色譜柱可以是Shimpack PREP-SIL(H)(4.6mm×300mm，Shimadzu Corp.)或Supersher Si60(4.5mm×100mm，Merck Co.)以及Inertsil SIL(4.6mm×150mm，GL Sciences Inc.)。
基於高效液相色譜法得到的峰面積，利用下述公式可計算組成OPC的每種n-聚體的比例(b％)b％＝{峰面積(每種n-聚體)}/{總峰面積(所有聚合物)}×100 (公式3)根據如此得到的每種n-聚體的比例和前述(1)得到的OPC重量，可以通過下述公式測定預定重量的分析物中含有的例如以mg計的每種n-聚體的重量n-聚體的量(mg)＝OPC的總量(mg)×n-聚體的比例(b％)/100 (公式4)下面通過實施例更詳細地描述本發明。然而，本發明並不限於這些實施例。
實施例1 酸水解條件的研究觀察松樹皮提取物(flavangenol)被酸分解時隨時間的變化。松樹皮提取物(1mg)溶解於1ml 0.6NHCl/BuOH中，在90℃的熱水浴中加熱該溶液。由20分鐘至140分鐘，每隔20分鐘進行採樣。樣品用丁醇按1∶10進行稀釋，測量400-700nm的可見吸收光譜。所有樣品的最大吸收出現在551nm。測量結果顯示在表1中。
表1 松樹皮提取物酸分解隨時間的變化

結果是，在酸分解過程中，吸光度隨時間的推移緩慢增加，120分鐘時達到峰值。基於該結果，隨後的試驗中，水解期間定為120分鐘(2小時)。
實施例2 酸水解中花青素的產生和測定在玻璃試管中，將含有原花青素的樣品(0.5mg)溶解於1ml 0.6N HCl/丁醇中，所得溶液在90℃的水浴中靜置2小時。反應完成後，用UV-265(Shimadzu Corp.)測量700-400nm的吸收光譜，並測定551nm的吸光度。在下述條件下，使用HPLC對反應完成後的溶液進行分析以測定花青素柱YMC-ODS-A312，6mm×150mm流動相CH3COOH∶MeOH∶H2O＝15∶17.5∶67.5檢測A520nm(使用PDA在400-600nm測量得到)用於分析的標準物質翠雀定、氰定和天竺葵色素購自Funakoshi。標準物質翠雀定在4.2分鐘流出，其λmax為535nm；氰定在5.5分鐘流出，其λmax為525nm；天竺葵色素在8.0分鐘流出，其λmax為515nm。如同翠雀定、氰定和天竺葵色素一樣，按照上述條件對來自樣品酸水解物的組分進行分析。
松樹皮提取物、葡萄籽多酚、茶多酚、蘋果多酚、羅望子果、原花青素B1(Funakoshi)用作OPC的標準物質。
結果顯示在表2和表3中。
表2 吸光度法測定OPC含量

表3 HPLC法測定OPC含量

*1.84μg/ml氰定+1.98μg/ml翠雀定實施例3 正相HPLC對兒茶素、二聚體和三聚體進行分析在下述條件下，使用正相HPLC分析用於兒茶素和原花青素的標準物質將(+)-兒茶素(Nacalai Tesque)、(-)-表兒茶素(Wako Pure ChemicalIndustries)、原花青素B1(Funakoshi)的樣品(每種樣品0.1mg)分別溶解於1ml流動相中，用0.45μm濾器過濾上述溶液，然後在下述條件下進行HPLC分析。
使用下面實施例5描述的方法合成三聚體。
柱Inertsil SIL，4.6mm×150mm流動相己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝45∶40∶14∶1檢測A280nm(使用PDA在240-400nm測量得到)在這些條件下，單體((+)-兒茶素和(-)-表兒茶素)在2.9分鐘流出，二聚體在3.6分鐘流出，三聚體在4.3分鐘流出。
這些物質的色譜圖如圖1所示。
實施例4 通過正相HPLC進行分析在下述條件下，使用正相HPLC分析含有兒茶素和原花青素的混合態樣品含有原花青素的樣品(1-2mg)溶解於1ml流動相中，用0.45μm濾器過濾上述溶液，在下述條件下進行HPLC分析。
使用的樣品為蘋果多酚、葡萄籽多酚、松樹皮提取物和羅望子果。
柱Inertsil SIL，4.6mm×150mm流動相己烷∶MeOH∶THF∶HCOOH＝45∶40∶14∶1檢測A280nm(使用PDA在240-400nm測量得到)作為分析圖的色譜圖如圖2所示。這些圖中，符號X代表在280nm沒有最大吸收且不同於OPC的多酚類。
每個樣品中的二聚體和三聚體的濃度通過公式c％＝a％×b％測定。結果示於表4。
表4 二聚體和三聚體的含量

實施例5 OPC的合成根據論文(1981，J.C.S.Perkin I.1235-1245)按照下述方式合成OPC。
將(+)-紫杉葉素(500mg)溶解於50ml乙醇中，加入200mg NaBH4。然後，加入1g(+)-兒茶素並溶解。然後加入HCl，將混合物攪拌1小時。反應產物用反相HPLC純化得到三聚體。
權利要求
1.一種測定預定重量分析物中含有的黃烷-3-醇的n-聚體(n≥2)混合物(下文將所述混合物稱為低聚原花青素或OPC)的總重量的方法，所述方法包括基於水解一個n-聚體產生的花青素量為n/2，而與n的大小無關的事實，測量通過水解所述分析物中的OPC產生的花青素的重量，以及將所測得的花青素的重量乘以係數2，得到所述分析物中OPC的總重量。
2.一種測定預定重量分析物中含有的低聚原花青素(OPC)總重量的方法，所述方法包括基於水解OPC產生的花青素量與OPC的總量成比例，而與OPC中含有的n-聚體的量比和聚合度n的大小不同無關的事實，測量通過水解所述分析物中的OPC產生的花青素重量，單獨測量通過水解已知重量的OPC標準物質產生的花青素量，以及通過校正曲線或下述公式測量所述分析物中OPC總重量和/或所述分析物中OPC的重量比(a％)OPC總重量(mg)＝(樣品的測量值/標準物質的測量值)×標準物質的重量(mg) (公式1)分析物中OPC的重量比(a％)＝(OPC總重量(mg)/分析物的重量)×100(公式2)。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述標準物質為原花青素B1。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的方法，其中所述的水解通過在酸性條件下的熱分解進行。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述酸性條件是酸和低級醇的混合物。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其中所述酸為鹽酸、硫酸或硝酸。
7.根據權利要求5或6所述的方法，其中所述低級醇為丙醇、丁醇、戊醇和/或異戊醇。
8.根據權利要求4-7任意一項所述的方法，其中所述的熱分解在溫度50-100℃，優選80-100℃，更優選85-95℃下進行，反應時間為30分鐘或更長，優選1小時或更長。
9.根據權利要求1-8任意一項所述的方法，其中花青素量通過高效液相色譜法和/或吸光度法測量。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述吸光度法通過測量550-552nm的吸光度進行，在此波長範圍內花青素在可見吸收光譜圖中顯示出最大吸收。
11.一種測定分析物中含有的低聚原花青素(OPC)的方法，所述分析物中黃烷-3-醇的n-聚體的聚合度n不同，所述方法包括如下步驟a)根據權利要求1-10任意一項的方法測定預定重量的分析物中含有的OPC總重量；b)獨立於步驟a)，通過高效液相色譜法(HPLC)分析所述分析物以分離OPC中含有的具有不同聚合度n的n-聚體，並測定各種n-聚體佔所有n-聚體即OPC量的定量比例；以及c)根據a)和b)的結果測定所述分析物中每種n-聚體的重量。
12.根據權利要求11所述的方法，其中高效液相色譜法中使用的柱為正相柱。
13.根據權利要求12所述的方法，其中所述正相柱中填充的樹脂為矽膠基樹脂。
14.根據權利要求12或13所述的方法，其中高效液相色譜法中，洗脫液是己烷、甲醇、四氫呋喃和甲酸的混合物，所述混合物的混合比為己烷/甲醇/四氫呋喃/甲酸＝40-60∶30-50∶10-20∶0.1-5，優選比例為45∶40∶14∶1，進行等度洗脫，柱溫為10-60℃，優選40℃，並測量280nm的吸光度。
15.根據權利要求11-14任意一項所述的方法，其中基於高效液相色譜法得到的峰面積，根據下述公式計算每種n-聚體的定量比例(b％)b％＝{峰面積(每種n-聚體)}/{總峰面積(所有聚合物)}×100 (公式3)。
16.根據權利要求11所述的方法，其中基於(a)測定的OPC重量和(b)測定的每種n-聚體的比例，在步驟(c)中，根據下述公式測定每種n-聚體的重量n-聚體的量(mg)＝OPC的總量(mg)×n-聚體的比例(b％)/100 (公式4)。
17.根據權利要求1-16任意一項所述的方法，其中待分析的低聚原花青素包括至少一種如下通式表示的化合物[化學式1]結構式1 結構式2 結構式3 結構式4 n＝0-18的整數；n1＝1-18的整數；n2＝0-18的整數；R＝H或OH。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述的低聚原花青素為包括至少一種下述原花青素類的低聚原花青素結構式1的原花青素B1、B2、B3和B4，其中n＝0；結構式2的原花青素B5、B6、B7和B8，其中n1＝0和n2＝0；以及結構式1的原花青素C1、C2和C4，其中n＝1。
19.根據權利要求1-18任意一項所述的方法，其中所述分析物為天然物質(葡萄籽、羅望子果、蘋果、樹皮、松樹皮衍生的多酚、茶葉、可可等，和/或它們的處理產品(提取物等))、食品或飲料、醫藥品和/或化妝品。
20.一種通過高效液相色譜法(HPLC)測定分析物中含有的低聚原花青素(OPC)的不同聚合度的n-聚體比例的方法。
21.根據權利要求20所述的方法，其中高效液相色譜法中使用的柱為正相柱。
22.根據權利要求20或21所述的方法，其中正相柱中填充的樹脂為矽膠基樹脂。
23.根據權利要求20-22任意一項所述的方法，其中高效液相色譜法中，洗脫液是己烷、甲醇、四氫呋喃和甲酸的混合物，所述混合物的混合比為己烷/甲醇/四氫呋喃/甲酸＝40-60∶30-50∶10-20∶0.1-5，優選比例為45∶40∶14∶1，進行等度洗脫，柱溫為10-60℃，優選40℃，並測量280nm的吸光度。
24.根據權利要求20-23任意一項所述的方法，其中基於高效液相色譜法得到的峰面積，根據下面的公式計算每種n-聚體的比例(b％)b％＝{峰面積(每種n-聚體)}/{總峰面積(所有聚合物)}×100 (公式3)。
25.根據權利要求1-24任意一項所述的方法，如果所述分析物為包括軟飲料或提神飲料、茶飲料、或酒精飲料的液體時，所述方法還包括凍幹所述分析物或在減壓條件下固化所述分析物至乾燥，然後粉末化的步驟。
全文摘要
本發明提供一種用於分析天然物質、食品和飲料、醫藥品和/或化妝品中含有的低聚原花青素(OPC)的新方法。本發明為一種分析OPC的新方法，該方法通過分析水解OPC得到的花青素以測定OPC的總量，並用高效液相色譜法(HPLC)分析OPC聚合度的比例以測定OPC中各種聚合物的含量。
文檔編號G01N33/02GK1989407SQ20058002518
公開日2007年6月27日 申請日期2005年7月27日 優先權日2004年7月29日
發明者福井祐子, 中原光一 申請人:三得利株式會社